CC BY
67
УДК 616-005.4:612.089.6 Кубанский научный медицинский вестник № 6 (120) 2010
И. М. КОЛЕСНИК, M. В. ПОКРОВСКИЙ, О. С. ГУДЫРЕВ, Л. М. ДАНИЛЕНКО, А. Е. КОРОЛЕВ, Р. А. НАРЫКОВ, Д. В. ЛОПАТИН, С. А. АЛЕХИН
ДИСТАНТНОЕ И ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ПРЕКОНДИЦИОНИРОВАНИЕ -НОВЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ СТИМУЛЯЦИИ НЕОВАСКУЛОГЕНЕЗА
Кафедра фармакологии Курского государственного медицинского университета,
Россия, 305000, г. Курск, ул. К. Маркса, 3. E-mail: kolesnik_inga@mail.ru
Проведено изучение возможности стимуляции неоваскулогенеза дистантным ишемическим прекондиционированием и рекомбинантным эритропоэтином в ишемизированной мышце голени крыс. Состояние микроциркуляторного русла оценивали при проведении лазерной допплеровской флоуметрии и гистологического исследования.
Ключевые слова: дистантное прекондиционирование, фармакологическое прекондиционирование, рекомбинантный эритропоэтин, неоваскулогенез.
I. М. KOLESNIK, M. V. POKROVSKYI, О. S. GUDYREV, L. M. DANILENKO,
А. Е. KOROLEV, R. А. NARYKOV, D. V. LOPATIN, S. А. ALEHIN
REMOTE AND PHARMACOLOGICAL PRECONDITIONING - NEW POSSIBILITIES OF NEOVASCULOGENESIS STIMULATION
Department of pharmacology Kursk state medical university,
Russia, 305000, Kursk, street K. Marks, 3. Е-mail: kolesnik_inga@mail.ru
The study of neovasculogenesis stimulation possibility with remote ischemic preconditioning and recombinant erythropoietin in rat’s shin ischemic muscle was carried out. The condition of microcirculatory vessels was estimated during laser doppler flowmetry and histological research.
Key words: remote preconditioning, pharmacological preconditioning, recombinant erythropoietin, neovasculogenesis.
Введение
Любое хирургическое вмешательство в той или иной степени связано с нарушением кровоснабжения и локальной ишемией. Острая ишемия имеет разные последствия в зависимости от её глубины, продолжительности и условий развития. При ишемии запускается ряд повреждающих процессов, интенсивность которых нарастает по мере того, как увеличивается продолжительность ограничения кровотока [2].
Ангиогенез - рост новых кровеносных сосудов - играет важную роль в восстановлении ишемизированных тканей. Современная медицина предлагает обширный выбор методов его стимуляции. Особая эффективность отмечена при применении аутотрансплантации клеток и генных препаратов (VEGF) [2, 3]. Однако, несмотря на специфические преимущества и теоретически не ограниченные возможности каждого из этих методов, диапазон их практического применения имеет достаточно жесткие рамки. Это связано с высокой стоимостью и недоступностью пока для большинства пациентов. Кроме того, остаются неизученными отдаленные результаты применения генных конструкций. Главными физиологическими стимуляторами ангиогенеза считают гипоксию и тканевую ишемию [1, 3, 5]. Отсутствие в тканях ишемии, по-видимому, исключает возможность инициации этого процесса. Применение ишемического прекондиционирования дает возможность стимулировать естественные механизмы ангиогенеза. Наибольшее развитие данная концепция получила в работах, посвященных изучению реакции сердца и головного мозга [7, 10, 11]. Однако предполагаемый механизм
реализации феномена прекондиционирования указывает на возможность его универсального использования в хирургии. Понимание того, что воздействие ишемической атакой на патологически измененную ткань рискованно и не всегда выполнимо, подтверждает целесообразность изучения эффектов дистантного прекондиционировния. Еще больший интерес для клинического применения представляет фармакологическое прекондиционирование. Наиболее перспективным в этом отношении является эритропоэтин. Это гликопротеиновый гормон, главным фактором, регулирующим его продукцию, является гипоксия [4, 6, 8]. Период полувыведения эритропоэтина значительно выше, чем у других гуморальных агентов прекондиционирования (аденозин, брадикинин, опи-оиды). Кроме того, открытие рецепторов эритропоэ-тина на мезангиальных клетках и в миокарде, фибро-бластах мышечной ткани и нейронов позволило изучить неэритропоэтические функции гормона [4, 6, 8, 12].
В связи с вышеизложенным целью настоящего исследования явилось изучение влияния дистантного прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэ-тина на неоваскулогенез при экспериментально моделируемой ишемии скелетной мышцы.
Методика исследования
Опыты проводили на белых крысах линии Wistar массой 250-300 г.
Для исследования взяты крысы без внешних признаков заболевания, прошедшие карантинный режим. В ходе эксперимента животные содержались в условиях стандартной экспериментальной биологически
чистой комнаты, температура воздуха составляла 22-240 С, освещение - 12 ч/12 ч светлый/темный цикл, все крысы получали гранулированный корм и фильтрованную водопроводную воду.
Операции и другие манипуляции на крысах проводились в условиях общего обезболивания внутрибрю-шинным введением водного раствора хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг веса. Выведение животных из эксперимента осуществляли в соответствии с «Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей», принятой Советом Европы (Strasbourg, Франция, 1986) и директивой совета 86/609/ЕЕС от 24.11.1986 «По согласованию законов, правил и административных распоряжений стран-участниц в отношении защиты животных, используемых в экспериментальных и научных целях», передозировкой хлоралгидрата, вводимого внутрибрю-шинно.
Животных распределяли по группам путем стратифицированной рандомизации со стратификацией по массе тела, условиям содержания и питания, а также по проводимым операциям и манипуляциям.
Возможность стимулирующего влияния дистантного ишемического прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина на неоваскулогенез оценивали при экспериментальном моделировании ишемии мышц голени. Оценку состояния микроциркуляторного русла проводили путем измерения микроциркуляции в мышцах и проведения гистологического исследования. Для получения данных о состоянии микроциркуляции в мышцах голени использовали оборудование производства компании «Biopac systems»: полиграф MP100 с модулем лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) LDF100C и инвазивным игольчатым датчиком TSD144. Запись и обработка данных производились при помощи программы «AcqKnowledge 3.8.1».
В контрольную серию было включено 100 крыс, которые были разделены на 10 групп. У животных первой группы - интактных - оценивали уровень микроциркуляции в мышцах голени, затем участок исследуемой мышцы брали на биопсию. Другие девять групп животных контрольной серии служили для изучения уровня микроциркуляции и морфологической картины на разных сроках после моделирования ишемии. Животным этих девяти групп контрольной серии, а также животным опытной серии производили операцию моделирования ишемии мышц голени правой задней конечности путем удаления участка магистрального сосуда, включающего бедренную, подколенную артерии и начальных отделов артерий голени.
В опытную серию было включено 60 животных, представленных тремя группами по 20 животных в каждой. Животным первой группы проводили дистантное прекондиционирование, во второй группе вводили рекомбинантный эритропоэтин, в третьей группе использовали сочетание дистантного прекондиционировния и рекомбинантного эритропоэтина по той же схеме.
Дистантное ишемическое прекондиционирование осуществляли 10-минутным пережатием бедренной артерии с последующей 30-минутной реперфузией непосредственно перед моделированием патологии, на 3-и и 5-е сутки. Пережатие бедренной артерии осуществляли наложением жгута на верхнюю треть бедра контрлатеральной конечности. Контролем правильности наложения жгута служило отсутствие пульса на артериях голени.
Рекомбинантный эритропоэтин («Эпокрин» эпо-этин-альфа; ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых препаратов» Федерального медико-биологического агентства г. Санкт-Петербурга, Россия.) вводили подкожно в дозе 50 МЕ/кг на первые, третьи и пятые сутки эксперимента. Доказано, что при данном режиме введения препарат не обладает гемостимулирующим эффектом [4].
Статистический анализ полученных данных осуществляли в программе «Microsoft Excel» версии 10.0.
Результаты исследования
У интактных животных показатель микроциркуляции в мышцах правой голени составил 526,16±34,4 перфузионных единиц (п. е.). При гистологическом исследовании мышц миоциты образуют плотные пучки, в толще которых проходят полнокровные венулы и артериолы, содержащие единичные эритроциты. Просветы сосудов широкие, эндотелиальные клетки без патологических изменений. У животных контрольной группы изучали показатели микроциркуляции на сроках 30 мин, 1-е сут., 3-и сут., 7-е сут., 10-е сут., 14-е сут., 21-е сут., 28-е сут. и 90-е сутки после моделирования ишемии. Изучение динамики уровня микроциркуляции на разных сроках после моделирования необходимо для изучения процесса компенсаторного неоваскулоге-неза. После операции уровень микроциркуляции резко и быстро снижается, а затем медленно восстанавливается. На протяжении первых десяти суток уровень микроциркуляции остается приблизительно на том же уровне, который наблюдался в остром периоде после операции: в пределах 210-230 п. е.; тенденция к восстановлению появляется только с 14-х суток эксперимента. Восстановление микроциркуляции происходит лишь к 90-м суткам эксперимента.
Анализируя данные, полученные при исследовании животных контрольной группы, а также литературные данные мы в качестве наиболее показательных рассматривали 28-е сутки (361±8,36 п. е.). 21-е взяты в качестве промежуточных (322±6,6 п. е.) . При проведении морфологического исследования на 21-е сутки ишемии пораженная мышца макроскопически выглядела набухшей, в ней имелись крупные участки серовато-коричневатого цвета. Данные участки гистологически представляли собой крупные очаги организующегося некроза с резорбцией некротических волокон и разрастанием грануляционной ткани. На 28-е сутки цвет мышцы нор-мализовывался, но она выглядела несколько гипотро-фичной. При гистологическом исследовании участки резорбируемого некроза были значительно мельче, а в микроциркуляторном русле отмечались полнокровие и новообразование единичных капилляров. Вблизи участков некроза встречались пучки атрофированных мышечных волокон.
Коррекция дистантным ишемическим преконди-ционированием привела к ожидаемому достоверному увеличению показателей микроциркуляции по сравнению с контрольной группой. Уровень микроциркуляции на 21-е сутки составляет 450,23±8,36 п. е., на 28-е сутки - 702,02±23,49 п. е. Аналогичный результат наблюдался при применении рекомбинантного эритропоэтина. При проведении ЛДФ уровень микроциркуляции на 21 сутки составляет 441,25±10,37 п. е., на 28-е сутки - 752,66±12,97 п. е. При сочетанной коррекции дис-тантным преконди-ционированием и рекомбинантным эритропоэтином
Кубанский научный медицинский вестник № 6 (120) 2010
УДК 616.33-089.86 Кубанский научный медицинский вестник № 6 (120) 2010
получены такие же результаты - на 21-е сутки -461,035±19,79, на 28-е сутки - 725,485±24,76 п. е.
Уровень микроциркуляции в группах коррекции экспериментальной ишемии дистантным ишемическим прекондиционированием, рекомбинантным эритропоэ-тином и их сочетанным воздействием на всех сроках эксперимента достоверно выше показателей контрольной группы на тех же сроках (р<0,05). Достоверных отличий между показателями опытных групп нами выявлено не было. Уровень микроциркуляции на 21-е сутки в опытных группах приближается к показателям в группе интактных животных, а на 28-е сутки значительно выше. То есть можно говорить о том, что предпринятые попытки коррекции в этих группах позволяют полностью компенсировать признаки ишемии до 28-х суток эксперимента. В контрольной серии восстановление исходного значения наблюдается значительно позже (в срок до 3 месяцев).
При макроскопической оценке мышцы ишемизированной голени в исследуемых группах на 21-е и 28-е сутки эксперимента не отличались по цвету и виду от мышц интактных крыс. При гистологическом исследовании некротические изменения в мышцах не обнаруживались. Однако в некоторых участках мышц встречались мелкие очаги атрофирующихся миоцитов с пролиферацией клеток перимизия. При большом увеличении во всех опытных группах отмечается активный капиллярогенез, более выраженный на 28-е сутки.
В настоящее время в доступной литературе появляются сведения о феномене прекондициониро-вания как о мощном методе борьбы с ишемией [2]. В данном исследовании мы показали, что дистантное прекондиционирование улучшает микроциркуляцию в ишемизированной мышце голени за счет стимуляции неоваскулогенеза. Первоначально феномен преконди-ционирования был описан как возможность повышения толерантности миокарда к летальному ишемическому повреждению [9]. Однако исследования последних лет показали, что в результате прекондиционирования не только снижается объем некротической зоны, но и стимулируются процессы восстановления ишемизированных тканей [10, 11]. Важную роль в регенерации тканей после их ишемического повреждения играет ангиогенез. После первичного ишемического эпизода начинается фенотипический репрограмминг, вледствие которого включается индукция синтеза оксида азота и клетки экспрессируют индуцибельные ферменты, признанные медиаторами отсроченной кардиопротекции: ¡N08, ЦОГ-2, МпСОД, альдозоредуктазу [2]. Рекомбинантный эритропоэтин в субгемопоэтической дозе оказывает на неоваскулогенез аналогичное влияние.
Полученные результаты позволяют проводить дальнейшие экспериментальные исследования возможности фармакологического прекондиционировния рекомбинантным эритропоэтином.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бокерия Л. А., Голухова Е. З., Еремеева М. В. и др. Первые результаты клинического применения терапевтического ангиогенеза с использованием гена VEGF165 человека // Бюл. НЦССХ РАМН. 2003. - Т. 4. № 11. - С. 326.
2. Бокерия Л. А.,Чигерин И. Н. Природа и клиническое значение «новых ишемических синдромов» НЦ ССХ им. А. Н. Бакулева РАМН, 2007. - 302 с.
3. Пашков Д. В., Покровский М. В., Колесник И. М. и др. Оценка неоангиогенного эффекта L-аргинина и его сочетания с плазмидами гена VEGF при экспериментальной ишемии конечности // Кубанский научный медицинский вестник. - 2009. - № 5. - С. 102-106.
4. Корокина Л. В., Колесник И. М., Покровский M. В. и др. Фармакологическая коррекция L-NAME индуцированного дефицита оксида азота рекомбинантным эритропоэтином // Кубанский научный медицинский вестник. - 2009. - № 9. - С. 66-69.
5. Покровский М. В., Покровская Т. Г., Кочкаров В. И., Ар-тюшкова Е. Б. Эндотелиопротекторные эффекты L-аргинина при моделировании дефицита окиси азота Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2008. - Т. 71. № 2. - С. 29-31.
6. Chong Z. Z., Kang J. Q., Maiese K. Erythropoietin is a novel vascular protectant through activation of Akt l and mitochondrial modulation of cysteine proteases // Circ Res. - 2002. - № 106. -P. 2973-2979.
7. Downey J. M., Davis A. M., Cohen M. V. Signaling pathways in ischemic preconditioning // Heart Fail Rev. - 2007. - № 12. - P. 181-188.
8. Mennini T., De Paola M., Bigini P. et al. Nonhematopoietic Erythropoietin Derivatives Prevent Motoneuron Degeneration In Vitro and In Vivo // Mol Med. - 2006. - № 12 (7-8). - P. 153-160.
9. Murry C. E., Jennings R. B., Reimer K. A. Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium // Circulation. - 1986. - № 14. - P. 1124-1136.
10. Ran R., Xu H., Lu A., Bernaudin M., Sharp F. R. Hypoxia preconditioning in the brain // Develop Neurosci. - 2005. - № 27. -P. 87-92.
11. Stenzel-Poore M. P., Stevens S. L., King J. S., Simon R. P. Preconditioning reprograms the response to ischemic injury and primes the emergence of unique endogenous neuroprotective phenotypes: a speculative synthesis // Stroke. - 2007. - № 38. - P. 680-685.
12. Xu B., Dong G. H., Liu H. et al. Recombinant human erythropoietin pretreatment attenuates myocardial infarct size: a possible mechanism involves heat shock Protein 70 and attenuation of nuclear factor-kappaB // Ann Clin Lab Sci. - 2005. - № 35(2). - P. 161-168.
Поступила 20.06.2010
Б. А. КОСЯКОВ, Ю. Л. ШАЛЬКОВ, И. А. АКПЕРОВ
ЭФФЕКТИВНОСТЬ ФИКСИРОВАННОЙ ГАСТРОСТОМЫ
Кафедра хирургии медицинского факультета Приднестровского государственного университета им. Т. Г. Шевченко MD-3300, г. Тирасполь, ул. 25 Октября, 107, тел. (+373 533) 2-38-49. E-mail: b.kos@list.ru
Предложен оригинальный метод формирования гастростомы для энтерального питания. Метод апробирован у 24 больных, жизнь которых удалось достоверно продлить на 4-6 месяцев по сравнению с больными контрольной группы.
Ключевые слова: рак желудка, рак пищевода, гастростома, оригинальный метод.
