CC BY
43
МАКРО- И МИКРОМОРФОЛОГИЯ
УДК 616.37-002 Оригинальная статья
динамика показателей лазерной спекл-визуализации кровотока в тканях при временной частичной локальной ишемии поджелудочной железы у голодных, сытых и алкоголизированных крыс
Д. А. Александров — ГБОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В. И. Разумовского», профессор кафедры хирургии и онкологии ФПК и ППС, профессор, доктор медицинских наук; П. А. Тимошина — ФГБОУ ВО «Саратовский государственный университет им. Н. Г. Чернышевского» (НИУ), инженер кафедры оптики и биофотоники, аспирант; В. В. Тучин — ФГБОУ ВО «Саратовский государственный университет им. Н. Г. Чернышевского» (НИУ), заведующий кафедрой оптики и биофотоники, заслуженный деятель науки РФ, профессор, доктор физико-математических наук; Г. Н. Маслякова — ГБОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В. И. Разумовского», заведующая кафедрой патологической анатомии, профессор, доктор медицинских наук; Т. В. Палатова — ГБОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В. И. Разумовского», ассистент кафедры патологической анатомии; Д. С. Седов — ГБОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В. И. Разумовского», кафедра хирургии и онкологии ФПК и ППС, врач-ординатор; Р. Р. Измайлов — МУЗ «ГБ г. Балакова», врач-хирург.
DYNAMICS OF LASER SPECKLE IMAGING OF BLOOD FLOW IN THE TISSUES AT PARTIAL TEMPORARY PANCREATIC ISCHEMIA OF HUNGRY, FED AND ALCOHOLIZED RATS
D.A. Alexandrov — Saratov State Medical University n.a. V. I. Razumovsky, Department of Surgery and Oncology of Raising Skills Faculty, Professor, Doctor of Medical Science; P. A. Timoshina — Saratov State University n.a. N. G. Chernyshevsky, Department of Optics and Biophotonics, Post-graduate; V. V. Tuchin — Saratov State University n.a. N. G. Chernyshevsky, Head of Department of Optics and Biophotonics, Professor, Doctor of Physical and Mathematical Science; G. N. Maslyakova — Saratov State Medical University n.a. V. I. Razumovsky, Head of Department of Pathological Anatomy, Professor, Doctor of Medical Science; T. V. Palatova — Saratov State Medical University n.a. V. I. Razumovsky, Department of Pathological Anatomy, Assistant; D. S. Se-dov — Saratov State Medical University n.a. V. I. Razumovsky, Department of Surgery and Oncology of Raising Skills Faculty, Resident; R. R. Izmailov — Balakovo Hospital, Surgeon.
Дата поступления — 27.12.2015 г. Дата принятия в печать — 19.05.2016 г.
Александров Д. А., Тимошина П. А., Тучин В. В., Маслякова Г. Н., Палатова Т. В., Седов Д. С., Измайлов Р. Р. Динамика показателей лазерной спекл-визуализации кровотока в тканях при временной частичной локальной ишемии поджелудочной железы у голодных, сытых и алкоголизированных крыс. Саратовский научно-медицинский журнал 2016; 12 (2): 106-109.
Цель: установить влияние частичной временной ишемии и последующей реперфузии на развитие панкреатита у лабораторных крыс. Материал и методы. Эксперименты выполнены на 73 белых крысах. Пережимали сосуды и регистрировали кровоток методом цифровой биомикроскопии и лазерной спекл-контрастной визуализации. Статистическая обработка данных проводилась программой Statistica for Windows 6.0 с использованием критерия Стьюдента. Результаты. Лазерная спекл-визуализация и цифровая микроскопия позволяют контролировать кровоток в сосудах поджелудочной железы. После пятиминутной частичной ишемии возникает реактивная гиперемия, изменения носят обратимый характер. После двадцатиминутной частичной ишемии реактивной гиперемии нет, развивается панкреатит без некроза. Поджелудочная железа алкоголизированных крыс более чувствительна к ишемии. Заключение. Методами лазерной спекл-визуализации и прижизненной цифровой микроскопии после пяти- и двадцатиминутной частичной ишемии поджелудочной железы выявлены фазные разнонаправленные изменения перфузии ее тканей и разная степень тяжести постишемического панкреатита.
Ключевые слова: поджелудочная железа, реперфузия, спекл-визуализация, прижизненная микроскопия.
Alexandrov DA, Timoshina PA, Tuchin VV, Maslyakova GN, Palatova TV, Sedov DS, Izmailov RR. Dynamics of laser speckle imaging of blood flow in the tissues at partial temporary pancreatic ischemia of hungry, fed and alcoholized rats. Saratov Journal of Medical Scientific Research 2016; 12 (2): 106-109.
The aim of the study is to determine the influence of a partial temporary ischemia and reperfusion on the development of pancreatitis in laboratory rats. Material and Methods. The experiments were performed on 73 white rats. Occluded blood vessels and blood flow were recorded by digital biomicroscopy and laser speckle contrast imaging. Statistical data processing was carried out the program Statistica for Windows 6.0 using the Student's criterion. Results. Laser speckle imaging and digital microscopes provide the monitoring of blood flow in the vessels of the pancreas. After a five-minute partial ischemia reactive hyperemia occurs, changes are invertible. After a twenty-minute partial ischemic reactive hyperemia does not occur, without developing pancreatitis necrosis. Pancreas of alcoholized rats has been found out to be more sensitive to ischemia. Conclusion. The method of laser speckle imaging and intravital microscopy after digital five- and twenty-minute partial ischemia of the pancreas revealed phase opposite directed changes in its tissue perfusion and varying severity of postischemic pancreatitis.
Key words: pancreas, reperfusion, speckle imaging, intravital microscopy.
Введение. На развитие деструкции поджелудочной железы оказывают влияние множество факторов, но наиболее значимым является нарушение микрогемодинамики [1, 2]. Ишемия и реперфузия в тканях поджелудочной железы экспериментальных животных приводят к изменениям, характерным для острого панкреатита [3]. В настоящее время наиболее эффективными методами определения параметров микрогемодинамики считаются лазерная допплеровская фло-уметрия (ЛДФ) и спекл-визуализация [4-9].
Цель: установить влияние частичной временной ишемии и последующей реперфузии на развитие панкреатита у лабораторных крыс.
Задачи исследования:
1. Оценить возможность использования методов лазерной спекл-визуализации для контроля за степенью сокращения кровотока в сосудах поджелудочной железы при создании локальной ишемии путем компрессии магистральных сосудов.
2. Изучить различия динамики восстановленного кровотока в микрососудах поджелудочной железы сытых, голодных и алкоголизированных крыс в различные сроки после локальной пяти- и двадцатиминутной ишемии, вызванной путем сокращения кровотока на 50%.
Материал и методы. Эксперименты выполнены на 73 белых крысах линии Wistar массой 200-250 г Все манипуляции на животных проведены в строгом соответствии с Правилами проведения качественных клинических испытаний в РФ (утв. МЗ РФ и введ. в действие 1 янв. 1999 г), приложением 3 к приказу МЗ СССР №755 от 10 августа 1977 г., положениями Хельсинкской декларации (2000 г.) и рекомендациями, содержащимися в Директивах Европейского Сообщества (№86/609ЕС).
Исследование свойств кровотока производилось с помощью методов лазерной допплеровской флоуметрии, цифровой биомикроскопии и метода лазерной спекл-контрастной визуализации по методике, используемой на кафедре оптики и био-фотоники ФГБОУ ВО «Саратовский национальный исследовательский государственный университет им. Н. Г. Чернышевского» и подробно описанной в нашей публикации 2014 г. [10]. Спекл-контрастная визуализация — бесконтактный метод, позволяющий получать и анализировать изображения кровотока в режиме реального времени. Регистрируемое значение контраста спекл-изображений обратно пропорционально скорости кровотока. Чем больше скорость, тем меньше контраст и наоборот.
В 2015 г. изменена конфигурация установки (схема без использования оптического волокна для доставки лазерного излучения к исследуемой области (рис. 1)). Исследовались сосуды поджелудочной железы, диаметры которых составили 280±40 мкм, что превышает диаметры сосудов в прошлых исследованиях. В связи с этим в серии экспериментов 2015 г. значения спеклов в контрольных группах крыс несколько ниже, чем в эксперименте 2014 г.
Лабораторные крысы были разделены на 8 групп.
В первой группе (п=6) исследовали исходный кровоток и его значения через 5 минут и на 5-е сутки после начала опыта.
Во второй группе (п=6) изучали исходный кровоток и его значения через 20 минут и на 5-е сутки после первого эксперимента.
Ответственный автор: Александров Денис Анатольевич Тел.: +7 (987) 8230609 E-mail: denirov@bk.ru
4-исследуемый объект
Рис. 1. Схема экспериментальной установки: 1 — He-Ne лазер ГН-5П, длина волны -633 нм; 2 — детектор (КМОП камера Basler A602f) с закрепленным тубусом микроскопа с микрообъективом (Ломо, 10*); 3 — расширитель лазерного пучка объектив 10х; 4 — исследуемый объект
В третьей группе (n=11) исследовали исходный кровоток голодных крыс, его значения через 5 минут после 50% сокращения кровотока в тканях поджелудочной железы, а также на 5-е сутки после начала опыта.
У четвертой группы (n=10) определялся исходный кровоток голодных крыс, его значения через 20 минут от начала частичной локальной ишемии тканей поджелудочной железы, а также на 5-е сутки после начала опыта.
В пятой группе (n=10) исследовали исходный кровоток сытых крыс, его значения через 5 минут от начала частичной локальной ишемии, а также на 5-е сутки после начала опыта.
В шестой группе (n=10) изучали исходный кровоток сытых крыс, его значения через 20 минут после 50% сокращения кровотока в тканях поджелудочной железы и на 5-е сутки после начала опыта.
В седьмой группе (n=10) определяли исходный кровоток алкоголизированных крыс, его значения через 5 минут, а также на 5-е сутки после частичной ишемии поджелудочной железы.
В восьмой группе (n=10) исследовали исходный кровоток алкоголизированных крыс, его значения через 20 минут от начала частичной локальной ишемии, а также на 5-е сутки после начала опыта.
Статистический анализ проведен с использованием пакета программ Statsoft (США). Данные представлены как mean±SD (или medain, 25-75%-ный интерквартильный размах при распределении признака, отличном от нормального). Для оценки различий частоты признака в группах использован критерий х2. Достоверность различий количественных показателей между несвязанными группами определялась при помощи непарного t-критерия Стьюдента и критерия Манна — Уитни. Статистически значимыми считались различия при p<0,05.
Результаты. Результаты измерений усредненного по времени контраста спеклов в контрольных группах животных представлены в таблице. Наблюдается статистически не значимое нарастание контраста спеклов как реакция на извлечение органа из брюшной полости во внешнюю среду.
108 макро- и микроморфология
Показатели усредненного по времени контраста спеклов (V) в контрольных группах животных
Группы <V> без воздействия <V> через 5 мин <V> через 20 мин <V> через 1 день <V> через 5 дней
Первая группа сравнения (n=6) Вторая группа сравнения (n=6) 0,162±0,031 0,164±0,029 0,181±0,021 0,183±0,022 0,182±0,012 0,183±0,014 0,180±0,021 0,167±0,019
Рис. 2. Сравнительная динамика показателей усредненного по времени контраста спеклов (V) и соответствующая ему скорость кровотока, отличающиеся у сытых, голодных и алкоголизированных крыс до, во время, после 5-минутной ишемии и на 5-й день после 50%-ного сокращения кровотока в тканях поджелудочной железы
Рис. 3. Сравнительная динамика показателей усредненного по времени контраста спеклов (V) и соответствующая ему скорость кровотока, отличающиеся у сытых, голодных и алкоголизированных крыс до, во время, после 20-минутной ишемии и на 5-й день после 50%-ного сокращения кровотока в тканях поджелудочной железы
На рис. 2 и 3 наглядно представлена сравнительная динамика показателей усредненного по времени контраста спеклов и соответствующей ему скорости кровотока голодных, алкоголизированных и сытых крыс до, во время, после пяти- и двадцатиминутной ишемии и на 5-й день после эксперимента соответственно. При этом исходные значения контраста спеклов у алкоголизированных крыс ниже значений у голодных крыс (р<0,049).
Определяется разница между значениями контраста спеклов алкоголизированных и сытых крыс, а также группами голодных и сытых крыс, но она не достигает статистической значимости.
Вектор направленности реперфузионных изменений отличается в зависимости от продолжительности ишемии поджелудочной железы.
Выраженность реперфузионного синдрома отличается у сытых, голодных и алкоголизированных крыс. После прекращения частичной ишемизации поджелудочной железы длительностью 5 минут значения контраста спеклов статистически значимо
меньше исходных, а следовательно, относительная скорость кровотока больше исходной, что свидетельствует о развитии реактивной гиперемии в органе при реперфузии. В большей степени это выражено в группе алкоголизированных животных. После прекращения частичной ишемизации поджелудочной железы длительностью 20 мин значения контраста спеклов останавливаются на исходных уровнях, что соответствует отсутствию реактивной гиперемии. При этом треть животных погибает в первые 5 суток от начала опыта.
Большая часть (80%) погибших животных представлена группой крыс, подвергшихся алкоголизации.
Обсуждение. Лазерная спекл-визуализация и прижизненная цифровая микроскопия являются эффективными методами мониторинга микрогемодинамики поджелудочной железы.
Контраст усредненных по времени динамических спеклов, используемый в качестве диагностического параметра, характеризуется достаточно высокой
Рис. 4. Изображение сосуда поджелудочной железы (диаметр 280 мкм) в когерентном свете (630 нм) (ч-б) и рассчитанное распределение контраста спеклов (1-0) (цветной) в различных состояниях скорости кровотока: а) нормальное, Ь) 50%-ная ишемия, с) 100%-ная ишемия, d) реперфузия
чувствительностью к изменениям кровотока в органе и может эффективно использоваться для дальнейших исследований в этой области.
Методики лазерной спекл-визуализации и прижизненной цифровой микроскопии позволяют контролировать степень сокращения кровотока в сосудах поджелудочной железы при создании локальной ишемии путем компрессии магистральных сосудов. На рис. 4 представлено спекл-изображение сосуда поджелудочной железы при различных состояниях скорости кровотока.
После пятиминутного сокращения кровотока в тканях поджелудочной железы на 50% возникает реактивная гиперемия, клинические и морфологические изменения носят обратимый характер.
После двадцатиминутного сокращения кровотока на 50% реактивной гиперемии нет, клинически и морфологически развивается панкреатит, не достигающий степени панкреонекроза. При этом треть животных погибают в первые 5 суток от начала опыта. Большая часть (80%) погибших животных представлена группой крыс, подвергшихся алкоголизации.
Поджелудочная железа у алкоголизированных крыс более чувствительна к ишемии, чем у групп сытых и голодных крыс.
Заключение. Методами лазерной спекл-визуализации и прижизненной цифровой микроскопии после пяти- и двадцатиминутной частичной ишемии поджелудочной железы выявлены фазные разнонаправленные изменения перфузии ее тканей и разная степень тяжести постишемического панкреатита.
Требуется дальнейшее изучение влияния репер-фузионных процессов на возникновение хирургической патологии в поджелудочной железе.
Конфликт интересов. Работа выполнена при поддержке грантов Минобрнауки России №3.1340.2014/К и РФФИ 14-02-00526.
Авторский вклад: концепция и дизайн исследования — Д. А. Александров, Д. С. Седов, П. А. Тимошина, В. В. Тучин; получение данных — Д. А. Александров, П. А. Тимошина, Г. Н. Маслякова, Т. В. Палатова, Д. С. Седов, Р. Р. Измайлов; обработка данных — Д. А. Александров, Г. Н. Маслякова, Т. В. Палатова, Д. С. Седов, П. А. Тимошина, В. В. Тучин; анализ и интерпретация результатов, написание статьи — Д. А. Александров, Д. С. Седов, П. А. Тимошина; утверждение рукописи — Д. А. Александров, В. В. Тучин, Г. Н. Маслякова.
References (Литература)
1. Beger HG, Isenmann R. Surgical manangement of necrotizing pancreatitis. Surg Clin N Amer 1999; 79 (4): 793-800.
2. Todd H, Baron MD, Desiree E, Morgan MDN. Acute Necrotizing Pancreatitis. Engl J Med 1999; 341 (6): 460.
3. Menger MD, Bonkhoff H, Vollmar B. Ischemia-reperfusion-induced pancreatic microvascular injury: аn intravital fluorescence microscopic study. Dig Dig Sci 1996; 41: 823-830.
4. Briers JD. Laser Doppler, speckle and related techniques for blood perfusion mapping and imaging. Physiological Measurement 2001; 22: 35-66.
5. Goodman JW. Speckle Phenomena in Optical: Theory and Applications. Englewood, Colorado: Roberts and Company, 2007; 387 р.
6. Hoffmann TF, Kübler J, Mebmer K. Bradykinin — Antagonisiering bei Ischämie und Reperfusion des Pankreas. Zentralbl Chir 1996; 121: 412^22.
7. Luo Q, Jiang C, Li P, et al. Laser speckle imaging of cerebral blood flow: Chapter 5. In: Tuchin VV, ed. Coherent-Domain Optical Methods: Biomedical Diagnostics, Environmental Monitoring and Material Science. 2nd ed. Vol. 1. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, N. Y., 2013; 167-211 p.
8. Saveliev VS, Buyanov VM, Ognev JV. Acute pancreatitis. M: Medicine, 1983; 240 p. Russian (Савельев В. С., Буянов В. М., Огнев Ю. В. Острый панкреатит. М.: Медицина, 1983; 240 с.).
9. Uhl W, Warshaw A, Clement. Imrie and al IAP Guidelines for the Surgical: Management of Acute Pancreatitis. Pancreatology 2002; (2): 565-573.
10. Alexandrov DA, Timoshina PA, Tuchin VV, Maslyakova GN, et al. Dynamics of laser speckle imaging of blood flow and morphological changes in tissues with a full time local ischemia of pancreas. Saratov Journal of Medical Scientific Research 2014; 10 (4): 596-600. Russian (Александров Д. А., Тимошина П. А., Тучин В. В., Маслякова Г. Н. и др. Динамика показателей лазерной спекл-визуализации кровотока и морфологических изменений в тканях при полной временной локальной ишемии поджелудочной железы. Саратовский научно-медицинский журнал 2014; 10 (4): 596-600).
