CC BY
137
Journal of Stress Physiology & Biochemistry, Vol. 4, No. 3, 2008, pp. 4-8. ISSN 1997-0838 Original Text Copyright © 2008 by Shafikova, Boyarkina, Omelichkina, Tauson, Fedoseeva.
ORIGINAL ARTICLE
POTATO RING ROT PATHOGEN DETECTION BY POLYMERASE CHAIN
REACTION IN POTATO TUBERS
Shafikova T.N., Boyarkina S.V., Omelichkina J.V., Tauson E.L., Fedoseeva I.V.
Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry, Siberian Division of the Russian Academy of Sciences, Irkutsk,
tel.: (395-2)42-50-09, fax: (395-2)51-07-54, e-mail: shafikova@sifibr. irk. ru
Received June 2, 2008
Abstract - Bacterial ring rot caused by Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus is a widespread disease of potato resulting in significant economic lost in agriculture and seed growing. A latent form of this infection makes difficulties for diagnostics and facilitates the quick disease propagation. Polymerase chain reaction is the best method for the disease control.
Key words: potato/ ring rot/ tuber/pathogen/polymerase chain reaction method./ Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus
ДИАГНОСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯ КОЛЬЦЕВОЙ ГНИЛИ .
ORIGINAL ARTICLE
ДИАГНОСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯ КОЛЬЦЕВОЙ ГНИЛИ В КЛУБНЯХ КАРТОФЕЛЯ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
Шафикова Т. Н., Бояркина С.В., Омеличкина Ю.В., Таусон Е.Л.,
Федосеева И.В.
Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН. 664033 Иркутск, а/я 1243, ул. Лермонтова, 132
тел.: (395-2)42-50-09, fax: (395-2)51-07-54,
e-mail: shafikova@sifibr.irk.ru ; omelichkina@ya.ru
Поступила в редакцию 2 июня 2008 г.
Бактериальная кольцевая гниль, вызываемая Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, - широко распространенное заболевание картофеля, наносящее значительный экономический ущерб сельскому хозяйству и семеноводству. Наличие латентной формы инфекции затрудняет диагностику болезни и способствует быстрому и незаметному распространению патогена. На сегодняшний день наиболее эффективным методом контроля данного заболевания является ПЦР диагностика.
Key words: картофель/ кольцевая гниль/ клубень/ патоген/метод полимеразной цепной реакции/
Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.
Картофель - уникальная сельскохозяйственная культура, используемая для продовольственных и кормовых целей. Расчетная потенциальная продуктивность картофеля в оптимальных условиях может достигать 60-100 т/га. Однако картофель восприимчив к возбудителям вирусных, грибных и бактериальных болезней, что связано, прежде всего, с его вегетативным размножением клубнями. Поэтому важным резервом увеличения производства этой культуры является планомерная борьба с болезнями, потери от которых в последние годы составляют более четверти полученного урожая.
Бактериальная кольцевая гниль картофеля -широко распространенное заболевание, наносящее серьезный экономический ущерб семеноводству и сельскому хозяйству многих стран мира (Easton G.D., 1979). Оно
распространено во всех странах северного полушария, но особенно вредоносно в странах Балтии, Белоруссии, европейской части России,
Полесских и лесостепных районах Украины, на Востоке и Дальнем Востоке. Возбудитель данного заболевания Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (Cms) является объектом международного карантинного контроля и
включен в список А2 Европейской организации по защите растений.
Основными симптомами заболевания является вилт (увядание) надземной части растения и кольцевая гниль клубней (рис. 1, рис. 2).
Диагноз кольцевой гнили обычно ставится при обнаружении этих признаков болезни и биотестом на баклажане, альтернативном растении-хозяине Ст&\ Однако эти методы не позволяют обнаружить латентный период течения болезни, во время которого визуально определить заболевание невозможно.
Наличие латентной (скрытой) формы инфекции, в течение которой растения не имеют явно выраженных симптомов, а инфицированные клубни визуально не отличаются от здоровых, способствует быстрому и незаметному распространению патогена и наносит экономический ущерб.
Эффективный контроль заболевания с использованием молекулярно-генетических
методов диагностики позволит определить наличие возбудителя кольцевой гнили картофеля независимо от формы заболевания. На сегодняшний день одним из ключевых методов идентификации патогенов и диагностики
Shafikova et al
инфекционных заболеваний у растительных и животных организмов является полимеразная цепная реакция.
Цель нашей работы - определить наличие патогена Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus в клубнях картофеля методом полимеразной цепной реакции.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для работы использовали культуру бактерий возбудителя кольцевой гнили картофеля Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (штамм 5369, вирулентный, мукоидный), которую выращивали в течение двух суток, при температуре 25°С на жидкой или агаризованной среде C (Meletzus D. and Eichenlaub R., 1991). Экстракцию ДНК бактерий осуществляли по методу быстрого выделения ДНК из грам-положительных бактерий (Pospiech A. and Neumann B., 1995).
Стерильные клубни были получены из пробирочных растений картофеля (сорта -Луговской, Лукъяновский). Часть клубней была инокулирована суспензией бактерий Cms (штамм 5369, титр инокулюма 1*108, период инкубации 3,5 месяца). Также в работе использовали клубни картофеля, выращенные в условиях фитотрона и в поле. ДНК из клубней картофеля выделяли по методу быстрой экстракции ДНК бактерий из зараженных клубней (Niepold F., 1999).
Диагностику Cms в клубнях картофеля осуществляли по методу определения Cms в зараженных клунях с помощью ПЦР (Pastrik K.H., 2000), с некоторыми модификациями. Для проведения амплификации использовали праймеры к нуклеотидной последовательности
межгенного спейсера 16S-23S pРНК, синтезированные СИНТОЛ: PSA-F (5'-ctc ctt gtg ggg tgg gaa aa-3') и PSA-R (5'-tac tga gat gtt tca ctt ccc c-3').
Реакционную смесь объемом 50 мкл, состоящую из 2 фаз и воска (15 мкл) для их разделения, готовили в микропробирках для ПЦР, поочередно добавляя реактивы. Нижняя фаза содержала 3 мкл Н2О, 5 мкл дНТП и по 1 мкл каждого праймера; верхняя - 10 мкл ПЦР-буфера (5х), 7 мкл Н2О, 2,5 мкл MgSO4, 0,5 мкл Taq-полимеразы. На поверхность ПЦР-смеси наносили 15 мкл Н2О и 5 мкл исследуемой ДНК, после чего пробирки помещали в амплификатор (БИС, модель-109).
Протокол амплификации включал: 1 цикл
продолжительностью 3 мин при температуре 95°С; 10 циклов при 95°С в течение 1мин, 64°С -1мин, 72°С - 1мин; 25 циклов при 95°С - 30 с, 62°С - 30 с, 72°С - 1мин. После последнего цикла реакционную смесь выдерживали при 72°С в течение 5 мин и в последующем хранили при температуре 4°С.
Для разделения ПЦР-продуктов проводили электрофорез в 1,5 % агарозном геле. Для визуализации ДНК гель в течение 25 мин инкубировали в растворе бромистого этидия (0,5 мкг/мл) и просматривали в ультрафиолете на приборе Gel Doc XR ("Bio Rad").
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Согласно нашим наблюдениям,
инфицированные клубни картофеля спустя 3,5 месяца после инокуляции суспензией бактерий Ст^' штамм 5369 визуально не отличались от здоровых клубней (рис. 3).
Рис. 1. Хлороз и некроз листьев, вилт надземной части картофеля.
ДИАГНОСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯ КОЛЬЦЕВОЙ ГНИЛИ
Рис. 2. Гниль по сосудистому кольцу клубней.
Рис. 3. Клубни картофеля сорта Лукъяновский:
А - неинфицированный клубень,
Б - клубень, инфицированный бактерией Ст^' (штамм 5369). Период инкубации 3,5 месяца.
и».
1 2 3 4 5 6 7
Рис. 4. Результаты ПЦР анализа ДНК из клубней картофеля сорта Лукъяновский. Стрелкой отмечены фрагменты ДНК размером 502 п.о.
1 - маркер молекулярного веса ДНК (100-1000 и1500 п.о.);
2-4 - отрицательный контроль (стерильные клубни in vitro);
5 - положительный контроль (бактерии Cms штамм 5369)
6 - клубни, искусственно инфицированные Cms штамм 5369
7 - клубни, выращенные в полевых условиях
Shafikova et al
8
Полученные результаты согласуются с
литературными данными о наличии у
бактериальной кольцевой гнили латентной (скрытой) формы инфекции, во время которой стебли и клубни растения не имеют выраженных признаков болезни. Однако при благоприятных для инфекции условиях, латентная форма может развиться в заболевание со всеми характерными для него симптомами: вилт надземной части растений и гниение клубней картофеля.
Поэтому молекулярно-генетические подходы в диагностике латентных инфекций, с помощью которых идентифицируют ДНК патогена в клубнях, должны иметь явные преимущества по сравнению с методами, которые основываются на визуальном осмотре клубней при отборе посадочного материала.
В настоящей работе для выделения ДНК использовали бактериальную культуру Cms штамм 5369, стерильные клубни пробирочных растений картофеля, клубни, искусственно зараженные суспензией бактерий Cms штамм 5369, а также клубни, взятые с поля.
ПЦР анализ ДНК бактерий штамма 5369 с праймерами PSA-F и PSA-R выявил у бактерий фрагмент ДНК ожидаемого размера - 502 п.о. (рис. 4).
Полученные результаты подтвердили видовую принадлежность бактерий штамма 5369 как Clavibacter michiganensis. ssp. sepedonicus (Cms). При амплификации ДНК, выделенных из искусственно зараженного картофеля и ДНК из клубней, взятых с поля, были выявлены ПЦР-продукты того же размера (502 п.о.), что и при амплификации ДНК бактерий Cms. Таким образом, было установлено наличие инфекции в искусственно зараженных клубнях и в клубнях с поля и определена их идентичность бактериям Cms штамма 5369.
В настоящее время полимеразная цепная реакция является наиболее точным и чувствительным диагностическим методом, позволяющим быстро выявлять латентную инфекцию различных фитопатогенов, в том числе бактерий Cms, вызывающих кольцевую гниль картофеля.
ЛИТЕРАТУРА
Easton, G. D. (1979) The biology and epidemiology of potato ring rot. American Potato J., 56, 459-460.
Meletzus, D. and Eichenlaub, R. (1991) Transformation of the phytopathogenic bacterium Clavibacter michiganense subsp. michiganense by electroporation and development of a cloning vector. J Bacteriol, 173 (1), 184-190.
Pospiech, A. and Neumann, B. (1995) A versatile quick-prep of genomic DNA from Gram-positive bacteria. Trends Genet., 11, 217-218.
Niepold, F. (1999) A simple and fast extraction procedure to obtain amplifyable DNA from Ralstonia (Pseudomonas) solanacearum and Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus inoculated potato tuber extracts and naturally infected tubers to conduct a polymerase chain reaction. J. Phytopathology, 147, 249-256.
Pastrik, K.H. (2000) Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by multiplex PCR with coamplification of host DNA. European J. of Plant Pathology, 106, 155 - 165.
