CC BY
67
Физиология и иммунология Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2012, № 2 (3), с. 289-294
УДК 618.2:612.017.1.014] .08
ДЕЙСТВИЕ КЛЕТОК ТРОФОБЛАСТА ПЛАЦЕНТЫ ЧЕЛОВЕКА НА МИГРАЦИОННЫЕ СВОЙСТВА ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК IN VITRO
© 2012 г. В.Ю. Талаев, М.В. Плеханова, М.А. Ломунова,
А.В. Матвеичев, О.Н. Бабайкина, И.Е. Заиченко
Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной
talaev@inbox. rn
Поступила в редакцию 25.01.2012
Клетки трофобласта не влияют на экспрессию хемокиновых рецепторов на дендритных клетках, но усиливают продукцию этими клетками хемоаттрактантов, одним из которых является CCL2, а также сами продуцируют этот хемокин. По нашему мнению, локальное усиление продукции CCL2 при беременности играет важную роль в формировании группировки клеток врожденного иммунитета в децидуальной оболочке матки.
Ключевые слова: дендритные клетки, плацента, клетки трофобласта, хемокины, миграция клеток.
Введение
Миелоидные дендритные клетки (ДК) являются наиболее активными антигенпрезентиру-ющими клетками иммунной системы [1]. Эти клетки созревают из моноцитов и циркулирующих в крови костно-мозговых предшественников до стадии незрелых ДК в различных тканях организма, особенно в лимфоидной ткани, в коже и слизистых оболочках [2]. Незрелые ДК поглощают разнообразный материал и подвергают его частичному ферментативному расщеплению без существенного разрушения антигенных детерминант [3]. При распознавании молекулярных паттернов патогенов, т.е. молекул, наиболее типичных для инфекционных агентов, ДК быстро дозревают до стадии зрелых ДК. При этом ДК существенно увеличивают свою способность презентировать собранные антигены, покидают место своей первичной локализации и с током лимфы мигрируют в региональный лимфатический узел для встречи с Т-лимфоцитами [4, 5]. Таким образом, уникальные миграционные характеристики позволяют одной и той же ДК максимально эффективно собирать антигены внутри различных тканей организма, а затем транспортировать их в Т-клеточные зоны лимфоидных органов - место инициации первичного иммунного ответа на антиген.
Следует отметить, что различные ДК, в зависимости от их происхождения, стадии созревания и условий активации, отличаются по своей способности снабжать Т-лимфоцит дополнительными стимулирующими сигналами - ци-
токинами и мембранными молекулами, которые необходимы для выживания активированного лимфоцита и определения пути его дальнейшей дифференцировки. От этих дополнительных сигналов во многом зависит, созреет ли активированный антигеном наивный CD4+ Т-лимфоцит в Т-хелпер первого типа (Тх1), Тх2, Тх17 или в адаптивную регуляторную (супрессорную) Т-клетку [6]. В связи с этим ДК, созревавшие в разных условиях, способны стимулировать различные типы иммунной реакции на антиген: гуморальный иммунный ответ, цитотоксические и воспалительные реакции или иммунологическую толерантность. Кроме того, ДК напрямую участвуют в регуляции воспаления и управляют миграцией клеток за счет продукции про- и противовоспалительных цитокинов и хемокинов. Такая пластичность свойств ДК, а также наличие ДК в тканях, разделяющих организм матери и плода, делает их весьма интересными кандидатами на роль специфических регуляторов, участвующих в предотвращении иммунного конфликта матери и плода [7-10].
Ранее нами было показано, что клетки цито-трофобласта плаценты человека в условиях in vitro существенно влияют на процесс созревания ДК из моноцитов крови [11]. ДК, созревавшие в присутствии клеток трофобласта, имеют специфический фенотип (типичный набор ко-стимулирующих молекул сочетается с сохранением экспрессии моноцитарного маркера CD14 на части клеток) и обладают меньшей способностью стимулировать лимфоциты к продукции интерферона-у и интерлейкина-17 (ИЛ-17) -
ключевых цитокинов, управляющих воспалением и клеточными иммунными реакциями. Кроме того, контактировавшие с трофобластом ДК снижают свою способность изменять путь рециркуляции активированных ими Т-лимфо-цитов. По нашему мнению, результатом этих индуцированных трофобластом изменений является ослабление активации цитотоксических Т-клеток, Тх1 и Тх17, а также угнетение рекрутирования в децидуальную оболочку активированных Т-лимфоцитов, что ведет к снижению вероятности отторжения плода. В данной работе мы продолжили исследование действия клеток трофобласта и секретируемых ими молекул на функциональные свойства ДК, а именно, на миграционные характеристики ДК.
Материалы и методы
Основными объектами исследования были клетки трофобласта плаценты человека и мие-лоидные (моноцитарные) ДК. Клетки трофобла-ста выделяли из проб плаценты, полученных в ходе элективных абортов со сроком 5-11 недель. Пробы хориональных ворсин интенсивно отмывались, разрезались на мелкие кусочки и подвергались ферментативному гидролизу в 0.25%-ном растворе трипсина-ЭДТА (Gibco, USA) в течение 35 мин при 37oC. Полученную суспензию фильтровали через металлическое сито, клетки отмывали центрифугированием и разделяли на 15-40% градиенте перколла (Pharmacia, Sweden). После центрифугирования при 460 g в течение 45 мин клетки из слоя 30% перколла собирали, дважды отмывали и засевали в 24-луночные планшеты (Costar, USA) в концентрации 3*105 клеток/мл в среде DME (Sigma, США) с 10% инактивированной на -греванием фетальной телячьей сыворотки (Биолот, Россия). Клетки культивировали при 37°С в атмосфере с 5% CO2. Чистоту выделения клеток трофобласта верифицировали иммуно-ферментным окрашиванием цитокератина-7 антителами OV-TL 12/30 и набором LSAB2 Sys-tem-HRP (DakoCytomation, Inc., США). Культуры трофобласта с чистотой более 95% использовали в дальнейших экспериментах.
ДК получали из моноцитов периферической крови практически здоровых беременных женщин. Для этого мононуклеарные клетки периферической крови выделяли центрифугированием на Hystopaque-1077 (Sigma, США), дважды отмывали и засевали в 24-луночных планшеты (Costar, США) по 5* 106 клеток на лунку в среде DME с 10% фетальной телячьей сыворотки. Через 3 ч неприлипшие клетки собирали,
и прилипшие клетки (моноциты) культивировали в течение ночи. На следующий день (день 1) моноциты подсчитывали и засевали с клетками трофобласта или без них. Соотношение между моноцитами и клетками трофобласта было 4:1. Отдельно клетки трофобласта засевали в контрольную культуру, в которую затем добавляли те же стимуляторы созревания, что и в культуры моноцитов. Образование незрелых ДК индуцировали добавлением к моноцитам ИЛ-4 (20 нг/мл) и ГМ-КСФ (100 нг/мл) (Invitrogen, США) на 1 и 4 день культивирования. На 7 день надосадки из культур незрелых ДК собирали для определения концентрации хемокина CCL2 (МСР-1) с помощью иммуноферментных тест-систем (Вектор-Бест, Россия). Для получения зрелых ДК клетки стимулировали липо-полисахаридом Salmonella typhi (ЛПС) (Отраслевой стандарт пирогена, ГИСК им Л.А. Тара-севича, Россия) в концентрации 1 мкг/мл или смесью ЛПС в той же концентрации с фактором некроза опухолей-а (ФНО-а) в концентрации 10 нг/мл. Концентрацию CCL2 определяли в надосадках культур через 24 ч после добавления ЛПС. Клетки для исследования экспрессии хемокиновых рецепторов и для экспериментов с миграцией получали двухсуточным культивированием с ЛПС ФНО-а. При этом засевались дополнительные контрольные культуры незрелых ДК, в которые не добавляли стимуляторы созревания.
Трехцветное иммунофлюоресцентое окрашивание поверхностных молекул проводили традиционным способом с использованием антител к молекулам CCR2, CCR5 и CCR7 (BD Biosciences, США), а также антител к молекуле HLA-DR (Сорбент, Россия). Для окрашивания белков, расположенных как на наружной мембране, так и внутри клетки использовали процедуру пермеабилизации мембраны. Для этого перед окрашиванием клетки отмывали, фиксировали 4%-ным параформом, отмывали, обрабатывали 0.1%-ным раствором сапонина и затем окрашивали флюоресцентными конъюгатами антител в присутствии сапонина. Затем клетки отмывали и фиксировали 1 %-ным пара-формом. Окрашенные пробы анализировали на проточном цитофлюориметре FacsCanto II (BD Biosciences, USA) с помощью программы FacsDiva. ДК гейтировали в соответствии с профилем FSC/SSC, а затем в гейт выделяли HLA-DR+ клетки.
Эксперименты по определению хемоаттрак-тивных свойств надосадков проводили традиционным способом с использованием вставок в 24-луночные планшеты ThinCerts (Greiner Bio-
one, Германия) с диаметром пор 8 мкм. Суспензию ДК в среде DME с 10% фетальной телячьей сыворотки вносили в верхнюю камеру (вставку), а в нижнюю камеру (лунку) вносили разведения исследуемых надосадков на среде того же состава. Для определения уровня спонтанной миграции в нижнюю камеру вносили среду без проб надосадков. Планшеты инкубировали от 7 до 17 ч при 37°С в атмосфере с 5% CO2 и затем подсчитывали количество ДК, проникших через поры вставки в нижнюю камеру.
Статистический анализ проводили с использованием t-теста Стьюдента для зависимых и независимых выборок.
Результаты и их обсуждение
Важнейшими факторами, определяющими направленную миграцию клеток иммунной системы, являются продукция и рецепция хе-мокинов - специфических белков-хемоаттрак-тантов. Показано, что ДК, созревшие из моноцитов в присутствии клеток трофобласта, обладают повышенной продукцией CCL2 - хемоки-на, являющегося хемоаттрактантом для моноцитов и незрелых ДК (табл. 1). Концентрация CCL2 в среде 6-суточных культур незрелых ДК под действием трофобласта возрастала в 1.53 ±
0.13 раз, а в культурах зрелых, стимулированных липополисахаридом ДК - в 1.57 ± 0.29 раз. Сами клетки трофобласта продуцировали CCL2, хотя и в значительно меньших концентрациях. Разность значений концентрации CCL2 в смешанных культурах ДК и клеток трофобласта и концентрации CCL2 в контрольных культурах клеток трофобласта достоверно превышает значение концентрации этого хемокина в культурах ДК без трофобласта (табл. 1).
Для определения биологической активности хемокинов, продуцируемых трофобластом и ДК, проводилась оценка способности надосад-ков из различных культур ДК и клеток трофобласта привлекать незрелые ДК. В предварительных экспериментах было показано, что ДК продуцируют в среду хемоаттрактанты, привлекающие другие незрелые ДК. В результате надосадки из культур ДК усиливают миграцию незрелых ДК через поры вставок ThinCerts. По видимому, с продукцией этих хемоаттрактантов связана и характерная морфология культур незрелых ДК, в которых крупные прозрачные, покрытые мелкими отростками клетки собираются в кластеры, высоко поднимающиеся над поверхностью посуды. После созревания индуцированного ЛПС дендритные клетки утрачи-
вают чувствительность к хемоаттракгивному действию надосадков из культур незрелых и зрелых ДК (данные не приведены).
Показано, что наибольшую миграцию незрелых ДК через поры вставок ThmCerts индуцировали надосадки незрелых ДК, росших с клетками трофобласта. В этом случае наблюдалось увеличение количества мигрировавших клеток в 3.09 ± 0.12 раз по сравнению с уровнем спонтанной миграции. Надосадки из культур незрелых ДК, росших без трофобласта, и надосадки из культур клеток трофобласта также демонстрировали значимую хемоаттрактивную активность. Кратность увеличения миграции под действием этих надосадков составляла 2.6 ± 0.21 и 1.92 ± 0.18 соответственно.
Таким образом, показано, что незрелые ДК и клетки трофобласта продуцируют хемоаттрак-танты, эффективно привлекающие незрелые ДК, причем одним из таких хемоаттрактантов является хемокин ССЬ2. По нашему мнению, продукция хемоаттрактантов клетками трофобласта и усиление их продукции дендритными клетками должны приводить к привлечению моноцитов крови в децидуальную оболочку беременной матки, где моноциты созревают в макрофаги и миелоидные ДК. Кроме того, действие этих хемоаттрактантов может определять взаимное расположение клеток внутри децидуальной оболочки, в частности, управлять формированием сети незрелых ДК с локальным повышением их концентрации вблизи островков вне-ворсинчатого трофобласта. Результатом такого пространственного расположения клеток может являться увеличение эффективности регуляторного воздействия трофобласта на функциональные свойства созревающих ДК.
Изучение экспрессии хемокиновых рецепторов проводили с помощью лазерной проточной цитометрии. Нами оценивалась экспрессия рецепторов CCR2 и CCR5, управляющих миграцией незрелых ДК внутри периферических тканей, а также рецептора CCR7, играющего ключевую роль в миграции ДК в лимфатические узлы. Поскольку ДК и клетки трофобласта не полностью разделяются на графиках показателей светорассеивания, при анализе результатов цитометрии мы последовательно выделяли в гейт клетки с типичным для ДК расположением по показателям светорассеивания в осях FSC/SSC, а затем из них выделяли клетки, несущие характерную для ДК молекулу HLA-DR (рисунок).
Цитометрическое исследование экспрессии белка CCR5 (рецептора хемокинов С^4, С^5 и ССЬ8) показало, что при использованных
Таблица 1
Концентрация ССL2 в надосадках культур ДК и клеток трофобласта при раздельном и совместном культивировании (пг/мл)
N Тип пробы* Состав культуры клеток Разность концентраций в культурах ДК, росших с трофобластом, и в культурах трофобласта
ДК ДК, росшие с трофобластом клетки трофобласта
18 1 3540 ± 523 5080 ± 292 ** 498 ± 135 ** 4б98 ± 303 **
25 2 2780 ± 578 4187 ± 535 ** 113 ± 24 ** 4121 ± 66o **
* Тип пробы: 1 - надосадок из культур клеток, росших 6 суток с ИЛ-4 и ГМ-КСФ, отобранный перед внесением ЛПС, 2 - надосадок, взятый через 24 ч после внесения ЛПС;
** различия от значений ДК достоверны прир < 0.01 в парном Г-тесте.
Таблица 2
Поверхностная и внутриклеточная экспрессия хемокиновых рецепторов на ДК, росших с клетками трофобласта и без них
Тип ДК Доля клеток, экспрессирующих соответствующий рецептор (%)
рецептор на наружной поверхности клетки рецептор на поверхности и внутри клетки
CCR5 CCR2 CCR7 CCR2 CCR7
Незрелые ДК 24.32 ± 6.13 5.44 ± 3.19 1.82 ± 0.71 36.34 ± 10.57 4.61 ± 0.5
Зрелые ДК 16.2 ± 5.09 * 5.16 ± 1.4 1.34 ± 0.62 31.69 ± 4.44 8.03 ± 2.78
Незрелые ДК с трофобластом 15.23 ± 3.16 3.59 ± 0.93 1.05 ± 0.25 39.2 ± 14.38 4.26 ± 1.52
Зрелые ДК с трофобластом 14.48 ± 4.52 4.22 ± 1.02 1.22 ± 0.31 37.59 ± 11.94 6.19 ± 1.28
* Различия от значений незрелых ДК достоверны прир < 0.02 в парном f-тесте.
нами условиях культивирования этот рецептор экспрессирует на мембране около четверти незрелых HLA-DR+ ДК (табл. 2). Созревание, индуцированное ЛПС и ФНО-а, достоверно снижало количество экспрессирующих CCR5-клеток до 16% (р < 0.02 в парном Г-тесте). Присутствие клеток трофобласта в культурах незрелых ДК также снижало количество CCR5 HLA-DR+-клеток, однако эти изменения были статистически недостоверными (р = 0.09 в парном Г-тесте), поскольку обладали низким уровнем воспроизводимости: в 6 из 20 экспериментов наблюдалось не снижение, а увеличение экспрессии CCR5 на ДК. Зрелые ДК, росшие с трофобластом и без него, по экспрессии CCR5 не различались.
Другим хемокиновым рецептором, экспрессия которого определялась в данной работе, был ССИ^ - рецептор для хемокинов CCL2, CCL3, CCL6, CCL7, CCL12, CCL13 и CCL27. Экспрессия этого рецептора на поверхности дендритных клеток оказалась весьма низкой и нестабильной. По данным семи независимых экспериментов, среднее количество незрелых ДК, экспрессирующих CCR2 на наружной мембране, составляло 5.3% и незначительно снижалось при добавлении клеток трофобласта (табл.
2). Мы предположили, что такая низкая мембранная экспрессия CCR2 обусловлена быстрой интернализацией рецептора после связывания со своим лигандом CCL2, который активно продуцируется в исследуемых культурах. Для выяснения этого вопроса использовали имму-нофлюоресцентную окраску CCR2, расположенного как на наружной мембране, так и внутри клетки. При этом в процедуру пробоподго-товки ввели дополнительные этапы фиксации и пермеабилизации клеточной мембраны сапонином. В результате количество определяемых CCRl+HLA-DR -клеток возросло до 39.2% у незрелых дендритных клеток и до 31.7% - у зрелых, однако обнаружить существенное действие клеток трофобласта на этот параметр в б независимых экспериментах не удалось (табл. 2).
Экспрессия CCR7 на наружной мембране полученных нами дендритных клетках находилась на крайне низком уровне как по количеству CCR7 -клеток (табл. 2), так и по яркости их флюоресцентного окрашивания. Окраска пермеабилизованных клеток приводила к значительному увеличению выявляемости CCR7+-клеток и яркости их окрашивания, в результате чего мы смогли уверенно дифференцировать
Рис. Пример анализа экспрессии CCR5 на мембране ДК. Клетки окрашены антителами к HLA-DR, меченными РЕ, и антителами к CCR5, меченными FITC. На графиках: выделение незрелых ДК без трофобласта (1) и с трофобластом (2) в гейт 1 по показателям светорассеивания. Дальнейшее выделение ДК, росших с трофобластом, в гейт 2 по наличию молекулы HLA-DR (3 и 4). На графике 4 - клетки окрашены антителами к CCR5, на графике 3 - контроль окрашивания CCR5. Анализ экспрессии CCR5 на выделенных в гейт 2 ДК (5) и ДК с трофобластом (б). Тонкая линия - незрелые ДК, толстая линия - зрелые ДК, гистограмма с закрашенным полем - контроль
несущие эту молекулу клетки. Мы предполагаем, что различие результатов окрашивания поверхностного и внутриклеточного CCR7 обусловлено интернализацией рецептора, взаимодействующего с ССЬ19, который продуцируется в культурах ДК [12]. При окрашивании клеток с перме-абилизованной мембраной среднее количество CCR7+HLA-DR+-клеток в культурах незрелых ДК составило 4.6%, а в культурах ДК, стимулированных ЛПС и ФНО-а - 8.1% (табл. 2). Культивирование ДК с клетками трофобласта не приводило к достоверному изменению экспрессии этой молекулы в 6 независимых экспериментах с окрашиванием мембранного пула CCR7 и 8 экспериментах с окрашиванием CCR7, локализованного как на мембране, так и внутри клетки (табл. 2).
Заключение
Показано, что клетки трофобласта усиливают продукцию дендритными клетками хемоат-трактантов, по крайней мере одним из которых является CCL2. Хемоаттрактанты, продуцируемые ДК и клетками трофобласта, эффективно стимулируют миграцию незрелых ДК. Клетки трофобласта не оказывают существенного влияния на экспрессию дендритными клетками хе-мокиновых рецепторов CCR2, CCR5 и CCR7. По нашему мнению, усиленная продукция хе-моаттрактантов дендритными клетками и трофобластом может участвовать в формировании специфической микроархитектуры децидуальной оболочки беременной матки, обогащать эту ткань клетками системы врожденного иммуни-
тета и увеличивать эффективность иммунорегу-лятороного действия трофобласта на созревающие ДК.
Работа поддержана РФФИ, проект 10-0400304.
Список литературы
1. Steinman R.M. The dendritic cell system and its role in immunogenicity. // Annu. Rev. Immunol. 1991. V. 9. P. 271-296.
2. Wu L., Liu Y-J. Development of dendriticcell lineages // Immunity. 2007. V. 26. P. 741-750.
3. Guermonprez P., Valladeau J., Zitvogel L., Thery C., Amigorena S. Antigen presentation and T cell stimulation by Dendritic Cells // Annu. Rev. Immunol. 2002. V. 20. P. 621-667.
4. Villablanca E. J., Russo V., Mora R. Dendritic cell migration and lymphocyte homing imprinting // Histol. Histopathol. 2008. V. 23. P. 897910.
5. Lammermann T., Sixt M. The microanatomy of T-cell responses // Immunol. Rev. 2008. V. 221. P. 26-43.
6. Annunziato F., Romagnani S. Heterogeneity of human effector CD4+ T cells // Arthritis Research & Therapy. 2009. V. 11. P. 257-265.
7. Ban Y.L., Kong B.H., Qu X., Yang Q.F., Ma Y.Y. BDCA-1+, BDCA-2+ and BDCA-3+ dendritic cells in early human pregnancy decidua // Clin. Exp. Immunol. 2008. V. 151. P. 399-406.
8. Blois S.M., Kammerer U., Alba Soto C. et al. Dendritic cells: key to fetal tolerance? // Biol. Reprod. 2007. V. 77. P. 590-598.
9. Ivanova E., Kyurkchiev D., Altankova I. et al. CD83 monocyte-derived dendritic cells are present in human decidua and progesterone induces their differentiation in vitro // Am. J. Reprod. Immunol. 2005. V. 53. P. 199-205.
10. Kämmerer U., Kruse A., Barrientos G., Arck P.C., Blois S.M. Role of dendritic cells in the regulation of maternal immune responses to the fetus during mammalian gestation // Immunol. Invest. 2008. V. 37. P. 499-533.
11. Talayev V.Yu., Matveichev A.V., Lomunova M.A., Talayeva M.V., Tsaturov M.E., Zaichenko I.Ye., Babaykina O.N. The effect of human placenta cytotrophoblast cells on the maturation and T-cell stimulating ability of dendritic cells in vitro // Clinical end Experimental Immunology. 2010. V. 162. P. 91- 99.
12. Cyster J.G. Chemokines and the homing of dendritic cells to the T cell areas of lymphoid organs // J. Exp. Med. 1999. V. 189. P. 447-450.
THE ACTION OF HUMAN PLACENTA TROPHOBLAST CELLS ON THE MIGRATORY PROPERTIES OF DENDRITIC CELLS IN VITRO
V. Yu. Talaev, M. V. Plekhanova, M.A. Lomunova, A. V. Matveichev, O.N. Babaikina, I.E. Zaichenko
Trophoblast cells do not affect the expression of chemokine receptors on dendritic cells but the latter are stimulated to produce chemoattractants, one of them is CCL2; dendritic cells also produce this chemokine themselves. In our opinion, the local rise of CCL2 production plays an important role in the formation of the pool of innate immunity cells in the uterine decidua.
Keywords: dendritic cells, placenta, trophoblast cells, chemokines, cell migration.
