CC BY
105
64
Оригинальные исследования
ДЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗАЦИЯ АОРТАЛЬНЫХ АЛЛОГРАФТОВ И ИХ МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА
А.В. Лаврешин, А.С. Насрединов, Д.И. Курапеев, С.В. Анисимов,
Л.Б. Митрофанова, О.В. Бещук
Федеральный центр сердца, крови и эндокринологии им. В.А. Алмазова, Санкт-Петербург, Россия
Detsellyulyarizatsiya of aortic allografts and their morphological assessment
A.V. Lavreshin, A.S. Nasredinov, D.I. Kurapeev, S.V. Anisimov, L.B. Mitrofanov, O.V. Beschuk Federal Almazov Medical Research Centre, Saint-Petersburg, Russia
Большое количество осложнений, ассоциированных с имплантацией искусственных клапанов сердца, диктует необходимость развития новых технологий в производстве и применении артифициальных клапанов. В статье рассматривается эффективность одного из методов тканевой инженерии — децеллюляризации. Предложена новая комбинация реагентов для быстрого и эффективного удаления клеток из структуры корня аорты без повреждения экстра-целлюлярного матрикса.
Корень аорты человека подвергался децеллюляризации с использованием комбинации детергентного и энзиматического методов. Оценивалось их влияние на структуру створок и стенки аорты с помощью гистологических и иммуногистохимических методов.
Получены оптимальные комбинации реагентов, позволяющие эффективно удалять клеточные элементы из структур корня аорты с минимальным воздействием на матрикс. Были апробированы различные комбинации реагентов для децеллюляризации корня аорты. Протокол децеллюляризации требует дополнительного совершенствования для унификации и достижения аналогичного эффекта на восходящей аорте.
Ключевые слова: протезирование клапанов сердца, тканевая инженерия, децеллюляризация, экстрацеллюляр-ный матрикс.
Операции по поводу заболеваний клапанного аппарата сердца занимают весомую долю среди всех кардиохирургических вмешательств. Несмотря на то, что качество, дизайн и свойства протезов клапанов сердца постоянно совершенствуются, они не могут сравниться по своим свойствам с нативными клапанами [1]. Наиболее частыми осложнениями после имплантации механических протезов являются тромбоэмболии и протезный эндокардит, профилактика которых требует проведения постоянной антикоагулянтной терапиии, которая сопряжена с кровотечениями и гемодинамическими расстройства. Применение биологических протезов позволило решить некоторые из этих осложнений, однако их применение связано с развитием кальцификации и биодеградации, требующих репротезирования через 10—15 лет, отсутствием возможности роста и протезным эндокардитом [2]. Необходимость устранения этих осложнений, а также максимального приближения к структуре и функции естественных клапанов сердца, побуждает сделать следующий шаг в разработке и производстве протезов клапанов сердца. Этим логическим шагом является использование методов тканевой инженерии [3]. Клапан сердца, изготовленный с применением тканеинженерных подходов, должен не только успешно адаптироваться к функциональным нагрузкам, но также обладать соответствующими гибкостью, прочностью, быть легко имплантируемым, долговечным, устой-
е-mail: a.v.lavreshin@gmail.com
A high amount of complications after heart valve prostheses implantation dictates the necessity to develop the new technologies for artificial heart valve production and implantation. One of tissue engineering methods, a decellularization, is discussed in this article in aspect of efficacy. We offer the new reagent combination that provided fast and full cell elimination from aortic root structures without damaging of extracellular matrix.
Human aortic roots were decellularized with the combination of enzymatic and detergent methods. The influence of these methods was assessed with histological and immunohistochemical analyses.
We obtained the new optimal combination for effective aortic root decellularization procedure with minimal matrix impact. Different detergent-based aortic root decellularization protocols were approved. The decellularization protocol requires further improvement to be unified and provides analogous results in case of ascending aorta.
Key words: prosthesis of heart valve, tissue engineering, decellularization, extracellular matrix.
чивым к инфекции, атромбогенным, и, что особенно актуально для детской кардиохирургии, обладать способностью к ремоделированию и росту вместе с ростом других структур сердца.
Одним из вспомогательных методов тканевой инженерии клапанов сердца является децеллюляри-зация. Задачей данного метода является создание бесклеточного матрикса, обладающего схожими с нативными тканями биомеханическими свойствами, способностью к заселению стволовыми клетками реципиента, а также минимальной анти-генностью. Для снижения антигенного потенциала ткани во время процесса децеллюляризации необходимо полное устранение клеточных компонентов, а именно: мембран и связанных с ней мембранных белков, клеточных органелл, ядер и содержащихся в них нуклеиновых кислот (ДНК и РНК). Кроме того, клетки донора и их элементы могут служить источником различных заболеваний, например, вирусных, способных передаваться через молекулы РНК [4]. Удаление клеток из донорской ткани позволяет клеткам реципиента мигрировать в трехмерный матрикс клапана и инициировать процессы ремоделирования с восстановлением гистотипической архитектоники.
Наша работа посвящена поиску оптимального метода децеллюляризации створок аортального клапана и восходящей аорты для создания бесклеточного матрикса с целью дальнейшего ее использования в качестве основы тканеинженерного аллографта.
Гены & Клетки Том IX, № 1,2014
Оригинальные исследования
65
Материалы и методы
Эксплантация корня аорты
Створки аортального клапана и участок восходящей аорты длиной 5 см забирали единым блоком с фрагментом миокарда левого желудочка. Эксплантация осуществлялась во время проведения секционного исследования на базе патологоанатомических отделений, согласно разрешению Министерства Здравоохранения РФ и РАМН (приказ №596/76, регистрационный номер 10330 от 11.09.2007, приказ № 223н/38 от 6.05.2008).
Критерии включения доноров:
— давность смерти не более 12 ч;
— возраст: 18—65 лет.
Критерии исключения доноров:
— трансмиссивные инфекции (ВИЧ, гепатиты B и C, сифилис, туберкулез);
— протозоонозные инфекции (Бруцеллез, лихорадка Q);
— наличие активного инфекционного процесса, септицемии;
— отягощенный онкологический анамнез;
— заболевания соединительной ткани;
— неустановленная причина смерти;
— врожденные пороки сердца.
После изъятия сердца во время патологоанатомического исследования производилось отсечение выходного отдела левого желудочка с участком восходящей аорты длиной 5 см от окружающих тканей. Препарат обрабатывался раствором хлорида натрия (физиологический раствор) (БиоЛот, Россия) для эвакуации крови и ее свертков и помещался в стерильный контейнер объемом 100 мл, содержащий фосфатно-солевой буферный раствор без ионов кальция и магния (ФСБ Ca-/Mg-) (Био-Лот, Россия) в сочетании с антибактериальными средствами [5]:
— ванкомицин (Лек, Словения) 6 мг/мл;
— метронидазол (Гедеон Рихтер, Венгрия) 6 мг/мл;
— амикацин (Синтез, Россия) 6 мг/мл ;
— ципрофлоксацин (KRKA, Словения) 1,5 мг/мл;
— амфотерицин (Гедеон Рихтер, Венгрия) 25 мг/мл.
После забора тканей в протоколе исследования фиксировались ФИО донора, возраст, причина смерти, дата смерти и вскрытия, диагноз. Контейнеры с материалами доставляли в лабораторию и помещали в холодильник при температуре +4°С на срок не менее 24 ч для стерилизации.
Выделение аллографта
Выделение аллографта производили в специальном помещении, в ламинарном шкафу 2 класса. Микробиологический контроль фильтра, помещения, рабочей установки, проверка систем кондиционирования воздуха проводились каждые 6 мес. Аллографт рассекали по комиссуре между правой коронарной и некоронарной створками с использованием пинцета и ножниц (рис. 1А). Затем оценивали макроскопические свойства створок клапана и аорты на предмет наличия атеросклеротических изменений и кальциноза створок, фиброзного кольца и восходящей аорты, фиброза створок и комиссур, фенестраций и вегетаций на створках, расширения синусов Вальсальвы. В случае отсутствия вышеуказанных признаков аллографт признавался годным к дальнейшему исследованию. Все створки
отсекались от фиброзного кольца клапана, из восходящей аорты выкраивали 2 полоски размером 5x2 см.
Оставшаяся часть аллографта утилизировалась. Створки аортального клапана и участки восходящей аорты обильно отмывались в стерильном ФСБ Ca-/Mg- от крови, сгустков и инородных тел. Одна створка аортального клапана и один участок аорты забирали как материалы контроля. Их помещали в контейнер объемом 25 мл со стерильным буферным раствором и антибиотиками и хранили в холодильнике при +4°С, либо сразу фиксировали в формальдегиде. Остальные створки аортального клапана и участок аорты после отмывки были готовы к последующим исследованиям (рис. 1Б).
Рис. 1. Подготовка тканей для исследования:
А — рабочее место и инструменты для выполнения обработки;
Б — обработанные ткани, готовые для дальнейших исследований
Децеллюляризация аллографтов
Методика децеллюляризации аллографтов включает в себя ряд последовательных действий, приводящих к полной элиминации клеток из тканей при условии минимального влияния на экстрацеллюляр-ный матрикс.
Первый этап децеллюляризации состоял в обработке тканей с целью разрушения клеточных мембран комбинацией детергентов (для створки аортального клапана), а также детергентами и трипсином (для восходящей аорты). На этом этапе использовались следующие реагенты в различных концентрациях: трипсин (Самсон-Мед, Россия;
Гены & Клетки Том IX, № 1,2014
66
Оригинальные исследования
Gibco, США), додецилсульфат натрия, дезоксихо-лат натрия (Sigma, США), 0,2% этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (БиоЛот, Россия). Все растворы готовились на основе стерильного ФСБ Ca-/Mg- (БиоЛот, Россия). Этот этап децеллюля-ризации осуществлялся в течение 48 ч при +37°С в условиях постоянного перемешивания.
Второй этап децеллюляризации заключался в разрушении нуклеиновых кислот, содержащихся в образцах. Для этого использовались растворы ДНКазы в концентрации 150 мкг/мл и РНКазы в концентарции 100 мкг/мл (БиоЛот, Россия) вместе с раствором 50 ммоль хлорида магния (MgCl2) (Био-Лот, Россия) и 0,2% ЭДТА. В качестве пермеаби-лизатора в раствор добавлялся 0,1% Тритон Х-100 (Sigma, США). Этап разрушения нуклеиновых кислот проводился в течение 24 ч при +37°С в условиях постоянного перемешивания [6].
Третий этап децеллюляризации — отмывка образцов от реагентов и клеточного дебриса. Для этого участки аорты и створки аортального клапана последовательно помещались в 3 стерильные емкости по 50 мл с ФСБ Ca-/Mg- (время экспозиции в каждой из них — 15 мин при комнатной температуре), а затем переносились в емкость с 50 мл ФСБ Ca-/Mg- на 24 ч при +4°С в условиях постоянного перемешивания [6]. Хранение тканей производили в растворе ФСБ Ca-/Mg- с добавлением антибиотиков в комбинации, описанной выше.
Гистологическая и иммуногистохимическая
оценка
Участки исследуемых тканей помещали в 4% формалин на 4 ч, дегидратировали в спиртах и заливали в парафиновые блоки по стандартной программе на автоматическом тканевом процессоре Leica TP 1020 (Leica, Германия). С помощью микротома делали серии поперечных срезов тканей толщиной 5 мкм. Для определения равномерности проведённой децеллюляризации исследовали срезы, выполненные по краям и в центре препарата.
Гистохимическое исследование. Изготовленные срезы депарафинировали и окрашивали гематоксилином и эозином для общей оценки препарата и визуализации ядер клеток. Оценивалось количество сохраненных ядер в исследуемых образцах тканей по сравнению с контролем, а также наличие повреждений и целостности экстрацеллюлярного матрикса. Изучение микропрепаратов проводится на световом микроскопе Leica DM1000 с фотокамерой с увеличением от х10 до х1000 (Leica, Германия). Эффективность децеллюляризации оценивали по количеству ядер, оставшихся после обработки тканей, по сравнению с контрольной створкой аортального клапана или участком аорты того же донора. Также оценивалось наличия или отсутствия повреждений, разрывов, пустот экстрацеллюлярного матрикса по сравнению с контролем.
Иммуногистохимическое исследование. Использовали непрямой двойной метод визуализации EnVision (Dako, Дания). В качестве первичных антител применяли моноклональные антитела к антигенам CD34 (PECAM-1) и к а-гладкомышечному актину (а-SMA) (Dako, Дания). Иммуногистохимические препараты дополнительно докрашивали гематоксилином. Изучение микропрепаратов проводится на
световом микроскопе Leica DM1000 с фотокамерой с увеличением от х10 до х1000 (Leica, Германия). Позитивная окраска тканей считалась неудовлетворительным эффектом децеллюляризации, негативная окраска свидетельствовала об эффективной и успешной децеллюляризации.
Флуоресцентное исследование. Для оценки наличия нуклеиновых кислот в образцах тканей использовали реакцию с DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид), тропным к ДНК и РНК фрагментов нефиксированных тканей в проходящем поляризованном свете. Контрольные и децеллюляризиро-ванные створки аортального клапана отмывались от красителя в ФСБ Ca-/Mg-, децеллюляризированные створки аортального клапана окрашивались раствором красителя в течение 20 мин, после чего снова отмывались. Отсутствие характерного свечения ядер клеток в поляризованном свете считалось удовлетворительным эффектом выполненного протокола децеллюляризации.
Результаты и обсуждение
Поиск эффективного протокола
децеллюляризации
В процессе нашей работы стало понятно, что часто описываемые в литературе протоколы децел-люляризации, основанные на использовании детергентов [6—11] (первый этап), не способны полностью элиминировать клетки из структур створки клапана и стенки аорты. В поисках эффективного протокола децеллюляризации мы проводили определение минимально необходимых концентраций и времени воздействия реагентов для достижения эффекта децеллюляризации и оценивали клеточный состав тканей путем подсчета оставшихся ядер клеток при их окраске гематоксилином и эозином, а также с использованием других методов, описанных выше.
За основу была взята методика, описанная E. Rieder в 2005 г. [6]. В этом исследовании на первом этапе децеллюляризации створки аортального клапана и участка аорты использовался только 0,05% раствор дезоксихолата натрия (протокол 1, табл. 1). Мы апробировали данную методику, однако полученные результаты показали, что в структуре створки аортального клапана и участках аорты сохранялось до 90% ядер клеток, что является неудовлетворительным результатом. Поэтому была проведена модификация протокола децеллюляри-зации.
Вначале мы решили увеличить концентрацию де-зоксихолата натрия и проверить модифицированный метод на створке аортального клапана. Нами были опробованы протоколы с увеличением концентрации используемого детергента в 2, 4 и в 10 раз (протокол 2, табл. 1), но они не привели к желаемому результату: по-прежнему при окраске обзорными красителями в структуре створки аортального клапана и стенке аорты сохранялось около 80—90% ядер клеток. Использование гипотонического 0,45% раствора хлорида натрия или дистиллированной воды (протокол 3, табл. 1) в качестве веществ, вызывающих осмотический шок и лизис клеток, в течение 6 и 12 ч перед обработкой детергентом также не имело результата.
Гены & Клетки Том IX, № 1,2014
Оригинальные исследования
67
Таблица 1. Эффекты апробированных протоколов децеллюляризации створки аортального клапана
Номер протокола Протокол децеллюляризации (1-й этап) Эффект Влияние на структуру матрикса
i 0,05% дезоксихолат натрия Отсутствует, сохранность 90% ядер клеток Не влияет
2 0,1% / 0,2% / 0,5% дезоксихолат натрия Отсутствует, сохранность 80% ядер клеток Не влияет
3 0,5% дезоксихолат натрия + дистиллированная вода /0,45% раствор хлорида натрия Отсутствет, сохранность 80% ядер клеток Не влияет
4 0,05% трипсин + 0,05% дезоксихолат натрия + 0,05% додецилсульфат натрия + 0,2% ЭДТА Отчетливый, полное отсутствие ядер клеток Деструкция - наличие разрывов и пустот
5 0,05% дезоксихолат натрия + 0,05% додецилсульфат натрия + 0,2% ЭДТА Слабый, сохранность 50% ядер клеток Не влияет
6 0,075% дезоксихолат натрия + 0,075% додецилсульфат натрия + 0,2% ЭДТА Непостоянный, в ряде случаев сохранность до 30% ядер клеток Не влияет
7 0,1% дезоксихолат натрия + 0,1% додецилсульфат натрия + 0,2% ЭДТА Отчетливый, полное отсутствие ядер клеток Не влияет
В процессе дальнейшего поиска эффективного протокола децеллюляризации створки аортального клапана, несмотря на имеющиеся указания в литературе о негативном влиянии раствора додецилсульфа-та натрия и раствора трипсина на свойства матрикса [12—14], было решено попробовать протоколы с их использованием. Были апробированы методы децеллюляризации створки аортального клапана с использованием комбинации растворов додецил-сульфата натрия и дезоксихолата натрия в концентрациях 0,05%, 0,075% и 0,1%, с добавлением и без добавления 0,05% раствора трипсина. Также на первом этапе обработки тканей мы добавили 0,2% раствор ЭДТА. Оказалось, что использование трипА
сина в концентрации 0,05% в течение 3 ч ускоряет процесс удаления клеток из структуры створки аортального клапана, а последующая обработка створок аортального клапана 0,05% раствором детергентов и 0,2% ЭДТА в течение 48 ч (протокол 4, табл. 1) приводит к полной децеллюляризации. Однако при этом отмечалось повреждение матрикса створки аортального клапана: «разрыхление» структуры створки и увеличение промежутков между слоями по сравнению с контролем (рис. 2Б). При этом использование 0,05% раствора детергентов с 0,2% ЭДТА без предварительной обработки трипсином (протокол 5 , табл. 1) не приводило к удалению клеток из структуры створки аортального клапана (рис. 2В).
*
В ,
I ' '
-t.
' F---------------
I ^
Г=
Рис. 2.
Створка аортального клапана: А — нативная;
Б — после децеллюляризации с использованием 0,05% трипсина и 0,05% растворов детергентов;
В — после децеллюляризации с использованием только 0,05% растворов детергентов;
Г — после децеллюляризации с использованием 0,075% растворов детергентов.
Окр.: гематоксилин и эозин. Ув. х40
Б
Гены & Клетки Том IX, № 1,2014
68
Оригинальные исследования
Использование детергентов в концентрации 0,075% (протокол 6, табл. 1) в сочетании с 0,2% ЭДТА в ряде случаев сопровождалось полной де-целлюляризацией створки аортального клапана, при этом предварительная обработка 0,05% раствором трипсина в течение 3 ч была необязательна (рис. 2Г).
Использование детергентов в концентрации 0,1% (протокол 7, табл. 1) в сочетании с 0,2% ЭДТА вне зависимости от предварительной обработки створок аортального клапана 0,05% раствором трипсина приводит к полной децеллюляризации.
Таким образом, мы сделали вывод, что минимально достаточной концентрацией детергентов для достижения эффекта полной децеллюляризации является 0,05% в сочетании с 0,2% ЭДТА и предварительной обработкой 0,05% трипсином (протокол 4, табл. 1), либо необходимо использование 0,1% раствора детергентов и 0,2% ЭДТА без предварительной обработки трипсином (протокол 7, табл. 1, рис. 3).
Учитывая разрушающее влияние трипсина на матрикс, предпочтительным является использование комбинации додецилсульфата натрия и дезоксихо-лата натрия в концентрации 0,1% в течение 2 сут. с последующей обработкой раствором нуклеаз.
Итоговый эффективный протокол децеллюляризации створки аортального клапана выглядит следующим образом:
Этап I (разрушение клеточных мембран): 0,1% додецилсульфат натрия + 0,1% дезоксихолат натрия + 0,2% ЭДТА в течение 48 ч при +37°С в условиях постоянного перемешивания.
Этап II (элиминация нуклеиновых кислот): ДНКаза 150 мкг/мл + РНКаза 100 мкг/мл + 0,2% ЭДТА + 50 ммоль MgCl2 + 0,1% Тритон Х-100 в течение 24 ч при +37°С в условиях постоянного перемешивания.
Этап III (отмывка матрикса от детергентов и клеточного дебриса): отмывка тканей в 3 стерильных емкостях с 50 мл с ФСБ Ca-/Mg-. Время экспозиции в каждой из них — 15 мин при комнатной температуре. Затем перемещение в емкость с 50 мл ФСБ
Ca-/Mg- на 24 ч при +4°С в условиях постоянного перемешивания.
Хранение производится в растворе ФСБ Ca-/Mg-с добавлением антибиотиков при +4°С.
Далее мы апробировали полученный эффективный протокол децеллюляризации створок аортального клапана для обработки участков восходящей аорты (протокол 1, табл. 2). При окраске гематоксилином и эозином препаратов стенки аорты, обработанной таким способом, была выявлена сохраненность ядер всех слоев сосуда. Учитывая тот факт, что минимально достаточные для децеллюляризации створки аортального клапана концентрации и комбинации детергентов не способны элиминировать клетки из структуры стенки восходящей аорты, мы приняли решение отказаться от единого протокола децеллю-ляризации створок аортального клапана и аорты, и проводить децеллюляризацию этих тканей по разным протоколам.
Приступив к поиску эффективного протокола децеллюляризации восходящей аорты, мы вновь использовали метод увеличения концентраций используемых детергентов. Было показано, что использование 1%, 2% и даже 3% растворов детергентов (протокол 2, табл. 2) не приводит к полной децеллюляризации стенки аорты. При этом отмечалось удаление клеток из интимы и адвентиции, но сохранение их в структуре медии (рис. 4Б).
Однако предварительное использование 0,5% трипсина с 0,2% ЭДТА в течение 5 ч в комбинации даже с небольшими концентрациями (0,1%) детергентов (протокол 3, табл. 2) способствовало более «глубокой» децеллюляризации, устранению клеток медии. При этом эффект повреждения внеклеточного матрикса, наблюдаемый во время использования трипсина в протоколе децеллюляризации створок аортальных клапанов, отсутствовал. Матрикс аорты, обладая более прочными свойствами, демонстрирует сохранность структуры после трипсинизации (рис. 4В). Использование 0,25% раствора трипсина также является эффективным в случае более длительной экспозиции.
Рис. 3. Створка аортального клапана:
А — нативная; Б — после децеллюляризации с использованием 0,1% детергентов без трипсина. Окр.: гематоксилин и эозин.
Ув. х100
Гены & Клетки Том IX, № 1,2014
Оригинальные исследования
69
Таблица 2. Эффекты апробированных протоколов децеллюляризации восходящей аорты
Номер протокола Протокол децеллюляризации (1-й этап) Эффект Влияние на структуру матрикса
i 0,1% дезоксихолат натрия + 0,1% додецилсульфат натрия + 0,2% ЭДТА Отсутствует, сохранность ядер всех слоев стенки Не влияет
2 1% / 2% / 3% дезоксихолат натрия + 1% / 2% / 3% додецилсульфат натрия + 0,2% ЭДТА Слабый, сохранность ядер клеток медии Не влияет
3 А. 0,5% трипсин + 0,2% ЭДТА Б. 0,1% дезоксихолат натрия + 0,1% додецилсульфат натрия + 0,2% ЭДТА Отчетливый, полное отсутствие ядер клеток Не влияет
Рис. 4. Восходящая аорта:
А — нативная;
Б — после децеллюляризации с использованием 3% растворов детергентов;
В — после децеллюляризации с использованием 0,5% трипсина и 0,1% растворов детергентов.
Окр.: гематоксилин и эозин.
Ув. х100
Таким образом, итоговый протокол децеллюляризации аортальной стенки отличается от протокола децеллюляризации створок аортального клапана необходимостью предварительной обработки тканей 0,5% трипсином и 0,2% ЭДТА в течение 5 ч.
Иммуногистохимическое исследование
Окраска препаратов створки аортального клапана и стенки аорты, обработанных по нашим протоколам, на a-SMA и CD34, показала негативную реакцию ис-
следуемых образцов по сравнению с контролем (рис. 5), что означает отсутствие в структуре децел-люляризированных тканей гладкомышечных волокон и эндотелиальных клеток.
Окраска DAPI
Окрашивание створок аортального клапана с помощью DAPI подтвердило отсутствие нуклеиновых кислот в их структуре. При этом в контрольной нативной створке определялось характерное свечение ядер в поляризованном свете (рис. 6).
Гены & Клетки Том IX, № 1,2014
70
Оригинальные исследования
Рис. 5. Створка аортального клапана (САК) и восходящая аорта (ВА): А, Д - нативная;
Б, Е - ВА после децеллюляризации;
В, Ж - нативная САК; Г, З - САК после децеллюляризации.
Иммуногистохимическая реакция с антителами к:
А-Г - CD34; Д-З - a-SMA.
Докраска ядер гематоксилином. Ув. х100
Заключение
Многочисленные работы, посвященные проблеме децеллюляризации клапанов сердца, свидетельствуют о том, что единого «рецепта» для получения экстрацеллюлярного матрикса с оптимальными свойствами не существует. Очевидно, что минимизация воздействий на донорские ткани позволяет максимально сохранить их качества и приблизить аллографт по своим морфологическим, биомеханическим и гемодинамическим свойствам к нативному клапану. В числе подобных работ существуют и те, успехи которых позволили исследователям дойти до клинических испытаний и опробовать свой продукт в реальных операциях. Так, D. Gabbieri с соавт. (2007) опубликовали не только результаты успешного применения полученных в результате децеллюляризации аллографтов в операциях Росса у детей [15], но и удовлетворительные показатели работы этих клапанов спустя 10 лет после имплантации [16]. F.D. da Costa и соавт. (2005) сообщили об 11 успешно выполненных операциях Росса с использованием де-целлюляризованных аллографтов, изготовленных по авторизированной технологии AutoTissue [17]. При этом техника децеллюляризации использует всего один детергент — дезоксихолат натрия [18].
Нам не удалось достичь желаемого результата с использованием одного детергента. Апробация
Рис. 6. Створка аортального клапана:
А - нативная;
Б - после децеллюляризации.
Окр.: DAPI. Микроскопия в поляризованном свете. Ув. х10
различных протоколов децеллюляризации створок клапана аорты позволила нам сделать вывод, что минимально достаточной концентрацией детергентов для полного устранения клеток и клеточного дебриса из структуры створки аортального клапана и стенки восходящей аорты человека является 0,1% для дезоксихолата натрия и додецилсуль-фата натрия. Использование этих компонентов по отдельности даже в больших концентрациях и при большей экспозиции не приводят к желаемому результату. Единого протокола децеллюляризации створок аортального клапана и восходящей аорты нет [18—20]. Для достижения эффекта полной децеллюляризации восходящей аорты к протоколу децеллюляризации створок аортального клапана требуется добавить 0,5% раствор трипсина.
Для уточнения влияния предложенного метода на биомеханические свойства ткани и ее способности к рецеллюляризации in vitro и in vivo необходимы дополнительные исследования. Однако очевидно, что прогресс на данном этапе достижим.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке гранта Министерства образования и науки Российской Федерации (Соглашение No 8161).
Гены & Клетки Том IX, № 1,2014
Оригинальные исследования
71
ЛИТЕРАТУРА:
1. Yacoub M.H., Takkenberg J.J. Will heart valve tissue engineering change the world? Nat. Clin. Pract. Cardiovasc. Med. 2005; 2(2): 60-1
2. Mendelson K., Schoen F.J. Heart valve tissue engineering: concepts, approaches, progress, and challenges. Ann. Biomed. Eng. 2006 Dec; 34(12): 1799-819.
3. Yacoub M.H., Cohn L.H. Novel approaches to cardiac valve repair: from structure to function. Circulation 2004; 109(8): 942-50.
4. Dohmen P.M., Konertz W. Tissue-engineered heart valve scaffolds. Ann. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2009; 15(6): 362-7.
5. Jashari R., Van Hoeck B., Vanderkelen A. Banking of the human heart valves and the arteries at the European homograft bank (EHB) - overview of a 14-year activity in this International Association in Brussels. Cell and tissue banking 2004; 5: 239-51.
6. Rieder E., Seebacher G., Kasimir M.T. Decellularized porcine and human valve scaffolds differ importantly in residual potential to attract monocytic cells. Circulation 2005; 111(21): 2792-7.
7. Ning-tao F., Shang-zhe X., Song-mei W. et al. Construction of tissue-engineered heart valves by using decellularized scaffolds and endothelial progenitor cells. Chin. Med. J. 2007; 120(8): 696-702
8. Cebotari S., Mertsching H., Kallenbach K. et al. Construction of Autologous human heart valves based on an acellular allograft matrix. Circulation 2002; 106(suppl. I): I63-I68.
9. Elkins R.C., Dawson P.E., Goldstein S. et al. Decellularized human valve allografts. Ann. Thorac. Surg. 2001; 71: S428-32.
10. Guo-feng L., Zhi-juan H., Da-ping Y. et al. Decellularized aorta of fetal pigs as a potential scaffold for small diameter tissue engineered vascular graft. Chin. Med. J. 2008; 121(15):1398-406.
11. Zou Y., Zhang Y. Mechanical evaluation of decellularized porcine thoracic aorta. J. Surg. Res. 2012; 175(2): 359-68.
12. Samouillan V., Dandurand-Lods J., Lamure A. et al. Thermal analysis characterization of aortic tissues for cardiac valve bioprostheses. J. Biomed. Mater. Res. 1999; 46(4): 531-8.
13. Korossis S.A., Booth C., Wilcox H.E. et al. Tissue engineering of cardiac valve prostheses II: biomechanical characterization of decellularized porcine aortic heart valves. J. Heart Valve Dis. 2002; 11(4): 463-71.
14. Rieder E., Kasimir M.T., Silberhumer G. et al. Decellularization protocols of porcine heart valves differ importantly in efficiency of cell removal and susceptibility of the matrix to recellularization with human vascular cells. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2004; 127(2): 399-405.
15. Gabbieri D., Dohmen P.M., Linneweber J. et al. Ross procedure with a tissue-engineered heart valve in complex congenital aortic valve disease. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2007; 133(4): 1088-9.
16. Dohmen P.M., Lembcke A., Holinski S. et al. Ten years of clinical results with a tissue-engineered pulmonary valve. Ann. Thorac. Surg. 2011; 92(4): 1308-14.
17. da Costa F.D., Dohmen P.M., Duarte D. et al. Immunological and echocardiographic evaluation of decellularized versus cryopreserved allografts during the Ross operation. Eur. J. Cardiothorac. Surg. 2005; 27(4): 572-8.
18. Dohmen P.M., Konertz W. Decellularization of xenogenic biologic tissue. Ann. Thorac. Surg. 2008; 85(6): 2163.
19. AKaTOBB.C., MypaTOBP.M., ФадееваИ.С. и др. Изучение биосовместимости трансплантатов клапанов сердца, девитализиро-ванных антикальцинозным способом. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2011; V(2): 36-41.
20. Акатов B.C., Фесенко Н.И., Соловьев В.В. и др. Подавление кальцификации трансплантатов клапанов сердцапутем их девитали-зации. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2011; V(1): 41-46.
Поступила 10.09.2013
Гены & Клетки Том IX, № 1,2014
