CC BY
42
ДЕТЕКЦИЯ ЭЛЕМЕНТОВ ГЕНОМА ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА ТИПА 16 В КЛЕТКАХ ОПУХОЛЕЙ И ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПАЦИЕНТОВ, СТРАДАЮЩИХ РАКОМ МОЧЕВОГО
ПУЗЫРЯ
Г.И. МЯНДИНА, П.Э. ПЯГАЙ, А. В. ИТКЕС
Кафедра биологии и общей генетики РУДН. Москва, 117198, ул. Миклухо-Маклая, д. 8.
Медицинский факультет Л.Э. ЗАВАЛИШИНА, Г.А. ФРАНК Отделение патологичаской анатомии МНИОИ им. П. А. Герцена. Москва, 125284, 2-й
Боткинский п., д.3.
В настоящей работе представлены результаты исследования инфицированности пациентов с опухолями различных органов мочеполовой системы, в том числе мочевого пузыря, вирусом папилломы человека (ВГ1Ч ) типа 16. Методом ПЦР (полимеразной цепной реакции) были выявлены последовательности ДНК ВПЧ типа 16 в периферической крови грех пациентов из одиннадцати, страдающих раком мочевого пузыря (28,3%). В опухолевых клепках мочевого пузыря методом гибридизации in situ также были обнаружены последовательности вирусного генома ВПЧ типа 16. Результаты настоящего исследования позволяют предполагать вовлеченность вируса папиллом человека в процесс развития опухолей мочевого пузыря.
Ключевые слова, вирус папилломы человека, рак мочевого пузыря, полимеразная цепная реакция, гибридизация in situ.
Вирус папилломы человека (ВПЧ) относится к группе паповавирусов. Он является онкогенным ДНК-содержащим вирусом, инфицирующим базальные клетки многослойного плоского эпителия кожи или мембраны слизистой оболочки. В большинстве случаев в инфицированных клетках выявляется вирусная ДНК, продукция вирусных частиц отсутствует. Функциональный вирусный геном стимулирует пролиферацию эпителиальных клеток организма-хозяина, что может приводить к появлению папиллом.
ВПЧ представляет собой одну из наиболее гетерогенных групп вирусов. В настоящее время идентифицировано более 90 типов этого вируса, причем не менее 35-ти из них демонстрируют выраженный тропизм к клеткам слизистой оболочки урогенитальной области как мужчин, так и женщин[1]. Известно, что до 30% здоровых мужчин имеют в клетках половых органов последовательности ВПЧ, являясь, таким образом, естественным резервуаром этого вируса [2].
В зараженных клетках вирусный геном может существовать в двух формах: в эпи-сомальной (внехромосомной или «минихромосомной») и интегрированной. Эписомаль-ная форма характерна для собственно инфицированных клеток (для литической инфекции) и для доброкачественных опухолей. Переход от предраковых состояний к раковым сопровождается интеграцией вирусной ДНК в клеточный геном. Интеграция сопровождается делецией фрагмента вирусного генома и структурными перестройками, приводящими к изменению генетической программы вирусной и клеточной ДНК.
Вообще геном вирусов группы ВПЧ представлен кольцевой ДНК размером около 8 тысяч пар нуклеотидов и функционально разделен на два участка: ранний (Е) и поздний (L). В позднем участке идентифицированы 2 открытые рамки считывания (ORF): L1 и L2, контролирующих синтез двух структурных белков вирусного капсида. Экспрессия генов L1 и L2 не является необходимой для клеток доброкачественных или злокачественных опухолей для поддержания их фенотипа.
В раннем участке, составляющем 60% вирусного генома, имеется 7 генов (El - Е7) , часть из которых перекрывается. Ранний участок контролирует репликацию вирусной ДНК и трансформацию клеток. Ни один из белков, продуктов ранних генов, не входит в состав зрелых вирусных частиц. Интеграция вирусного генома сопровождается потерей L участка и части Е участка, но при этом всегда сохраняются гены Е6 и Е7. Основным онкогеном является ген Е6, его продукт инактивирует противоопухолевый ген р53 [3,4].
Онкогенный потенциал ВПЧ существенно варьирует. Кроме доброкачественных поражений, они вызывают промежуточные формы опухолей, к числу которых относятся остроконечные кондиломы, способные перерождаться в злокачественные карциномы. По-видимому, разные формы поражений связаны с различными типами ВПЧ. К настоящему времени выявлена ассоциация ВПЧ- 16 и ВПЧ - 18 с опухолями цервикальной области у женщин. Изучение биопсий шейки магки позволило сделать вывод, что 50% опухолевых клеток имеют ДНК ВПЧ типа 16 и 20% опухолей имеют ДНК ВПЧ типа 18 [5].
В связи с тем, что за последние десятилетия значительно увеличилась частота заболеваемости раком мочевого пузыря, изучение возможной роли ВПЧ в развитии этой группы опухолей представляется весьма актуальным.
Ранее была выявлена ассоциированность вируса папиллом крупного рогатого скота типа 2 с развитием рака мочевого пузыря у животных [ 6]. Однако, сведения о роли ВПЧ в генезе опухолей мочевого пузыря у человека весьма противоречивы. Согласно данным разных авторов частота инфицированное™ клеток опухолей мочевого пузыря колеблется от 0% до 80% [ 7 ].
В настоящей работе представлены результаты изучения частоты инфицированности вирусом папилломы человека типа 16 клеток опухолей мочевого пузыря и других органов мочеполовой системы.
Контингент больных, материалы и методы исследования
Была проанализирована группа пациентов из 36 человек с опухолями органов мочеполовой системы различной локализации.
ПЦР-анализ.
Всех больных исследовали на наличие элементов генома вируса папилломы человека типа 16 (ВПЧ -16) в клетках периферической крови методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). В качестве матрицы для ПЦР использовали ДНК, выделенную из клеток периферической крови пациентов по стандартной методике [8]. Для идентификации вирусных последовательностей использовали две пары олигонуклеотидных праймеров:
1) первая пара праймеров, специфичных для гена Е6 :
Е6 L : ttgcttttcgggatttatgc;
Е6 R: caggacacagtggcttttga.
2) вторая пара праймеров, специфичных для гена L1 :
LIL : ttgcctcctgtcccagtatc;
LIR : aatggctgaccacgacctac.
Амплификацию проводили по стандартной методике (8). Анализируемый фрагмент гена Е6 имеет размер 200 пар нуклеотидов (п.п.), фрагмент гена L1 - 300 п.н. Продукты ПЦР разделяли методом электрофореза в полиакриламидном геле, гель окрашивали азотнокислым серебром [8].
Гибридизация in situ.
Гибридизацию in situ проводили с использованием набора «МИКРОВИРУС» HPV 16/18 (ЭП Медико-биологических препаратов РК НПК М3 РФ, Москва, Россия) по методике, прилагаемой к набору.
Эта методика позволяет анализировать стандартные парафиновые срезы и включает следующие стадии:
депарафин ирование, обработку протеиназой К,
гибридизацию с биотинилированными олигонуклеотидными зондами, детекцию с использованием коньюгата щелочной фосфатазы и стрептавидина. Окрашенные препараты анализировали под световым микроскопом.
Результаты и обсуждение.
В рамках данной работы была проанализирована группа из 36 пациентов с опухолями органов мочеполовой системы различной локализации, в том числе: почек - 10, мочеточников - 2, яичников - 3, яичка - 2,простаты - 5, молочной железы - 3 и мочевого пузыря - 11 пациентов. Всех доноров исследовали на наличие элементов генома ВПЧ типа 16 в клетках периферической крови методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). При этом мы исходили из предположения о наличии в крови пациентов некротических клеток опухоли или циркулирующих опухолевых клеток, способных к метастазированию, которые, если первичная опухоль индуцирована вирусом, могут содержать интегрированные фрагменты вирусного генома.
При использовании первой серии праймеров, специфичных для участка гена Е6 вируса ВПЧ типа 16, соответствующий продукт ПЦР размером 200 п.н. был обнаружен в трех образцах ДНК, выделенной из крови пациентов, страдающих раком мочевого пузыря (рис. 1). В ДНК, выделенной из клеток крови доноров с опухолями другой локализации, соответствующие продукты ПЦР зарег истрированы не были. Следует отметить, что при использовании второй пары праймеров, специфичных для области гена Ы вируса папилломы типа 16, продукт ПЦР, соответствующий размеру 300 п.н., не был обнаружен ни в одном из исследуемых образцов ДНК.
Как следует из приведенных данных, трое из одиннадцати обследованных пациентов, страдающих раком мочевого пузыря, инфицированы ВПЧ типа 16. Полученная частота инфицированности данным вирусом среди пациентов с опухолями мочевого пузыря составила 28,3%, что согласуется с данными, приведенными в работах других авторов [9,10].
Существенно, что в нашем определении в крови пациентов были обнаружены вирусные последовательности, специфичные только для гена Е6, который является главным онкогеном ВПЧ. Отсутствие во всех исследованных образцах ДНК последовательностей Ь1, кодирующего вирус-ного свил етел ьству-ет,
11
13
15
19
20
Рис. 1. Электрофоретическое разделение продуктов аиплификаиионного анализа. II, 15, 19 — пробы от пациентов с раком мочевого пузыря, содержащие последовательность гена Е6 ВИЧ-16. 13, 20 — пробы от пациентов с раком мочевого пулыря, не содержащие последовательность гена Е6 ВПЧ-16. ш маркер длины ДНК (риС19\М'хр1). Специфический фрагмент ДНК (200 пар нуклеотидов) указан стрелкой.
гена белок капсида, по-
видимому, об утере этого элемента вирусного генома.
Данный факт полностью соответствует хорошо известным особенностям жизненного цикла ВПЧ. При литической инфекции вирус существует как автономно, в виде так называемой «минихромосомы», так и в интегрированной форме в составе ДНК клетки-хозяина. При инициации процесса канцерогенеза вирус не просто переходит в интегрированную форму, но, как уже упомянуто выше, в большинстве случаев теряет значитель-
ную часть генома; обязательными компонентами такого интегрированного вируса являются только онкогены Е6 и Е7 и, как правило, ген Е1.
Таким образом, присутствие в исследуемых образцах крови ДНК Е6, но не Ы означает, что в крови циркулируют лишь опухолевые клетки, содержащие ВПЧ, но не вирусные частицы и не клетки в состоянии литической или лизогенной инфекции.
Рис. 2. Типичная гибридизация ш situ среза боипсийного препарата переходно-клеточного рака мочевого пузыря. Гибридизацию in situ проводили с использованием набора «МИКРОВИРУС)' HPV 16/18 (ЭГ1 Медико-биологических препаратов РК HI7K М3 РФ, Москва, Россия). Положительные гибридизационные сигналы, показывающие наличие ВПЧ типа 16, указаны стрелками.
Для подтверждения присутствия ВПЧ у исследованных больных и для доказательства ассоциированности вируса с опухолевыми клетками мы провели анализ операционного материала опухолей методом гибридизации in situ. В качестве зондов были использованы олигонуклеотиды, специфичные к ДНК гена L1 ВПЧ типа 16. В результате анализа у больных, являющихся носителями вируса, гибридизационный сигнал был обнаружен в ядрах опухолевых клеток (рис. 2).
Полученные результаты гибридизационного анализа согласуются с приведенным выше утверждением о присутствии ВПЧ в клетках опухоли мочевого пузыря (примерно в 30% случаев). Инфицированные клетки и, вероятно, клетки на ранних стадиях образования опухоли, содержат полный вирусный геном и могут быть зарегистрированы в гистологических препаратах. Такой вирус не встречается вне инфицированных эпителиальных клеток и не может быть обнаружен в кровотоке. Когда же в крови начинается циркуляция опухолевых клеток, геном которых содержит интегрированные копии онкогенов ВПЧ, они могут быть зарегистрированы методом ПЦР.
Полученные в настоящем исследовании данные указывают на возможную существенную роль ВПЧ в развитии рака мочевого пузыря и позволяют считать носительство ВПЧ типа 16 важным фактором риска для этого заболевания.
Литература
1. Lopez - Beltran A.. Escudero A.L. Human pappilomavirus and bladder cancer// Biomed. Pharmacother - 1997. -V.57.-P. 252 - 257.
2. Cecchini S.. Cipparone /., Confortini M. Urethral cytology of cytobrush specimens// Acta Cytol. - 1998. - V.32. -P. 314 -317.
3. Savelieva E.. Belair C.D.. Newton M.A. et.ai. 20q gain associates with immortalization: 20ql3.2 amplification correlates with genome instability in human uroepithelia! cells// Oncogene. - 1997. V.14. - P. 551 - 560.
4. Park T.W.. Fujiwara H.. Wright T.C. Molecular biology of cervical cancer and its precursors// Cancer. - 1995. -V.76. - P. 1902 -- 1913.
5. Alani R.M., Munger K. Human papillomavirus and associated malignancies// .1. Clin. Oncol. - 1998. - V.16. - P.
330-337.
6. Campo M.S., Jarreti W.F., Barron R. et.al. Association of bovin papillomavirus type 2 and bracen fern with bladder cancer in cattle// Cancer Res. — 1992. - V .52. - P. 6898 - 6904 ,
7. Griffits TRL., Mellon J.K. Human papillomavirus and urological tumors: И. Role in bladder, prostate, renal and testicular cancer// BJU. Int. - 2000. - V.85. - P. 21 I - 217.
8. Мяндина Г.И., Имамова Л.Р., Островская А.В. и др. Полиморфный элемент гена EBNA-3C вируса Эпштейна-Барра первичная характеристика и схема использования для определения моно- и поликлональной природы инфицированных клеток// Докл.акад.наук. --2000. - Т.373. №3. - С. 20 -23.
9. Ciaetany C D., Ferrari С.. Righi Е. et.al. Detection of human papillomavirus DNA in urinary bladder carcinoma by in situ hybridisation// .1.Clin.Pathol. - 1999. - V.52. - P. 103 -106.
10. Ludwig М.. Kochel H.G., Fisher С et.al. Human papilloma virus in tissue of bladder and bladder carcinoma spe-simens// Eur.Urol. - 1996. - V,30. - P.96--102.
DETECTION OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE 16 GENOMIC ELEMENTS IN TUMORS’ CELLS AND PERIPHERAL BLOOD OF THE PATIENTS WITH BLADDER CARCINOMA
G.I. MYANDINA, P.E. PYAGAI, A.V. ITKES
Department of Biology and General Genetics, Faculty of Medicine,
Peoples Friendship University of Russia, Moscow, 117198, Miklukho-Maklay str., 8 L.E. ZAVALISHINA, G.A. FRANK Department of pathological anatomy, P. A. Gertzen Moscow Oncological Research Institute,
Moscow,125284, 2-nd Botkin road., 3
The association of human papillomavirus (HPV) type 16 with bladder cancer development was studied. The HPV DNA was detected by polymerase chain reaction (PCR) method in the blood cells of 3 patients from total number 1 1 (28,3%) with bladder carcinoma, but not with other types of cancer. The presence of HPV DNA in bladder carcinoma cells was confirmed by in situ hybridization technique.
Key words: human papillomavirus, bladder carcinoma, polymerase chain reaction, in situ hybridization.
