CC BY
405
Марина Игоревна Лукашина1, Анна Вячеславна Смирнова1, Вячеслав Афандиевич Алиев2, Игорь Вячеславович Самойленко1, Николай Николаевич Семенов3, Владимир Петрович Вейко4, Ирина Николаевна Михайлова5, Юрий Андреевич Барсуков2, Анатолий Юрьевич Барышников1
ДЕНДРИТНЫЕ ВАКЦИНЫ В ТЕРАПИИ КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА
1 Лаборатория экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
2 Отделение проктологии НИИ клинической онкологии ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
3 Отделение химиотерапии и комбинированного лечения злокачественных опухолей НИИ клинической онкологии ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
4 ГосНИИгенетики и селекции промышленныхмикроорганизмов
(117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1)
5 Отделение биотерапии НИИ клинической онкологии ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
Адреса для переписки: 115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24, НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, лаборатория экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, Лукашина Марина Игоревна; e-mail: mlukashina@mail.ru; 115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24, НИИ клинической онкологии ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, отделение биотерапии,
Михайлова Ирина Николаевна; e-mail: inmih@nm.ru
В настоящее время для определения оптимальных схем лечения больных колоректальным раком проводятся многочисленные клинические исследования. Одним из современных подходов в лечении колоректального рака является иммунотерапия. Цель настоящего исследования заключалась в оценке возможности использования дендритных клеток для лечения больных колоректальным раком. В исследование были включены 18 больных с метастатическим колоректальным раком после циторедуктивной операции с удалением первичного очага. Дендритные клетки культивировали из прикрепившихся на пластик моноцитов периферической крови в присутствии гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, интерлейкина-4, фактора некроза опухолей а и простагландин Е2. Нагрузку проводили пептидом или аутологичным лизатом. ДК вводили подкожно. У 8 из 18 пациентов развилась реакция гиперчувствительности замедленного типа. Достигнуто увеличение количества клеток CD8 + и CD16 + , экспрессии маркеров активации на лимфоцитах. Отмечена удовлетворительная переносимость лечения, при этом терапия не оказывала негативного влияния на качество жизни пациентов.
Ключевые слова: вакцинотерапия, дендритные клетки, колоректальный рак, субпопуляции лимфоцитов.
Колоректальный рак — одно из наиболее часто регистрируемых онкологических заболеваний. В России раком ободочной кишки ежегодно заболевают 23 000 человек, умирают от данного заболевания 17 000 человек; при раке прямой кишки эти показатели составляют 18 800 и 14 600 человек соответственно. Отсутствие ранних
специфических симптомов данного заболевания и позднее обращение больных приводят к тому, что в 80% случаев опухолевое поражение диагностируется на поздних стадиях, когда имеются отдаленные метастазы [1; 2]. Комплексный подход к лечению колоректального рака, включающий хирургическое удаление первичной опу-
холи, химио- и лучевую терапию, существенно улучшает результаты лечения, но даже в этом случае только 50% больных живут более 5 лет [13].
В настоящее время для определения оптимальных схем лечения больных колоректальным раком проводятся многочисленные клинические исследования. В число их задач входит определение группы пациентов, лечение которых будет наиболее эффективным.
Один из современных подходов в лечении колоректального рака — иммунотерапия. Создание противоопухолевых вакцин с использованием дендритных клеток (ДК) является перспективным направлением в терапии онкологических заболеваний, так как позволяет активировать защитные системы организма больного, используя естественные пути распознавания опухолевых антигенов и их последующую элиминацию. Опухолевые антигены, полученные из разрушенных клеток опухоли, в большей степени подходят для нагрузки ДК, так как в этом случае в клетку попадает весь набор опухолеассоциированных/опухолеспецифических антигенов (ОАА/ ОСА). Пептиды также могут быть использованы для нагрузки ДК, но существенным ограничением в этом подходе являются особенности презентации комплекса пептид—молекула главного комплекса гистосовместимости (HLA) I или II класса. Для развития эффективного иммунного ответа необходимо проводить HLA-типирование пациентов. Тем не менее возможность стандартизации и массовой наработки пептидов очень привлекательна для дальнейшего использования в терапии.
Большинство эпителиом экспрессируют в большом количестве муцин MUC-1, который способен индуцировать эффективный противоопухолевый цитотокси-ческий ответ [8; 9]. Тандемные повторы корового белка содержат антигенные эпитопы, которые могут быть распознаны цитотоксическими лимфоцитами [16]. Эта способность является основной причиной интереса молекулярных онкоиммунологов к MUC-1.
ДК принято считать наиболее мощными стимуляторами иммунных реакций организма. Показана способность ДК распознавать и представлять антигены в комплексе с молекулами HLA I и II Т- и В-лимфоцитам. ДК экспрессируют большое количество HLA I и II классов, кости-муляторные молекулы (B7.1/CD80, B7.2/ CD86) и демонстрируют высокую способность презентировать ОАА in vitro [7] и in vivo [23]. Однако функциональная активность ДК у онкологических больных значительно снижена [5; 15]. Основной причиной этого считают нарушения в процессе созревания ДК до функционально-активных форм [6]. Несмотря на ожидания высокой эффективности ДК-вакцинотерапии опухолей, результаты клинических исследований, опубликованные к настоящему времени, остаются противоречивыми и относятся главным образом к лечению меланомы [23; 25; 27]. Клинические исследования ДК-вакцин для лечения колоректального рака малочисленны [19; 22].
© М. И. Лукашина, А. В. Смирнова, В. А. Алиев,
И. В. Самойленко, Н. Н. Семенов, В. П. Вейко,
И. Н. Михайлова, Ю. А. Барсуков, А. Ю. Барышников, 2008
УДК 616.34/.35-006.6-085.371:611.018.83
Цель настоящего исследования состояла в определении возможности использования ДК для лечения больных колоректальным раком.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В исследование включены 18 больных: 8 женщин и 10 мужчин в возрасте от 41 до 69 лет (в среднем 56,3 ± 8,5 года) с метастатическим колоректальным раком после циторедуктивной операции с удалением первичного очага. У всех больных выявляли множественные метастазы в печени, верифицированные при цитологическом исследовании, стадия T3—4. Пациенты на первом этапе комплексного лечения получали аутологичную вакцину на основе ДК, и затем им проводили химиотерапию по схеме: ралтитрексед 2,6 мг/м2 в/в в течение 15 мин в 1-й день и капецитабин 2000 мг/м2/сут в течение 14 дней.
Получение и культивирование ДК
ДК культивировали из мононуклеаров периферической крови (МПК), прикрепившихся на пластик, по ранее описанной методике с некоторыми модификациями [4]. Цельную гепаринизированную кровь центрифугировали в градиенте плотности фиколл—уро-графин (р = 1,077) в течение 30 мин при 300 об/мин. Выделенные МПК отмывали средой RPMI-1640. После этого ресуспендировали в среде RPMI 1640, содержащей инактивированную сыворотку человека IV группы (2%), L-глутамин (2 мМ), буфер HEPES (10 мМ), гентами-цин (40 нг/мл), пируват (2 мМ), смесь витаминов 1х (далее полная среда — ПС). Плотность МПК доводили до 5 млн/мл в ПС, вносили в чашку Петри (d = 100 мм) в
10 мл ПС и инкубировали в термостате (5% СО2, 37 °С). Через 1,5 ч удаляли неприкрепившиеся клетки, а к ад-гезировавшим на пластик МПК добавляли свежую ПС, содержащую гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) («Leucomax», «Shering-Plough») в конечной концентрации 80 нг/мл и интерлейкин-4 (ИЛ-4) («R&D Systems», США) в конечной концентрации 10 нг/мл. На 2-е и 4-е сутки культивирования добавляли по 1 мл свежей ПС, содержащей 800 нг ГМ-КСФ и 100 нг ИЛ-4. Спустя 7 дней культивирования проводили замену среды, после чего в культуру клеток вносили опухолевые антигены, исходя из соотношения 1 часть ДК на 1,5—2 части лизированных опухолевых клеток или 100 мкг/мл общего белка.
В последующем для окончательной дифференциров-ки ДК в культуру добавляли фактор некроза опухолей а («ICN», США) и простагландин Е2 («ICN», США) в конечной концентрации 20 и 500 нг/мл соответственно. Через 48 ч клетки собирали, осаждали центрифугированием, отмывали в 0,9% изотоническом растворе NaCl, содержащем 1% сывороточного альбумина человека. После этого осадок клеток ресуспендировали в 0,9% растворе NaCl, содержащем 1% сывороточного альбумина человека, из расчета 106 клеток в 300 мкл.
Для характеристики полученных ДК их окрашивали моноклональными антителами (МКА), конъюгированными с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), к антигенам CD14, CD83, CD80, CD86 («Caltag», США) и HLA-DR («МедБиоСпектр», Россия) и соответствующим изоти-пическим контролям («Caltag», США).
Опухолевые антигены
Опухолевый лизат
Источником опухолевых антигенов служил материал, полученный у пациента при хирургической операции. После удаления соединительнотканной капсулы, жировой ткани опухолевый материал механически измельчали, затем, используя гомогенизатор Поттера, аккуратно выдавливали клетки из кусочков ткани, отмывали несколько раз в среде RPMI1640. После этого клетки ресуспендировали в среде RPMI1640, определяли их плотность и переносили в криопробирки. Для получения опухолевого лизата клеточную суспензию подвергали 4 циклам замораживания в жидком азоте и оттаивания в водяной бане (температура З7°С). Разрушенные клетки осаждали центрифугированием (2 мин при 12 ООО об/мин), супернатант, содержащий опухолевые антигены, собирали, стерильно фильтровали, измеряли концентрацию белка и разливали по микропробиркам из расчета 1ОО мкг/мл белка в одну ампулу. Пробирки хранили до момента использования при температуре —8О°С.
Рекомбинантный пептид
Кроме того, для нагрузки ДК использовали рекомбинантный пептид в нанограммовых концентрациях на основе сконструированного в НИИ генетики гена ОАА MUC-I. Конструкция представляла собой 22 тандемных повтора гена MUC-I, названного VNTR22, использовалась в качестве антигена при создании противоопухолевой вакцины.
Схема вакцинации
Трансплантацию аутологичных ДК проводили подкожно в паховую область, затем, после заживления операционного шва, — в пупочную. Все больные получили по 4 введения ДК с интервалом между введениями 2—З нед. Первую инъекцию ДК выполняли через 2 нед после операции, затем еще З введения. Через 2—З нед после последней вакцинации больному назначали химиотерапию по указанной выше схеме.
Иммуногистохимические исследования
Для определения экспрессии антигена MUC-1 в опухолевых образцах использовали иммуногистохимиче-ское окрашивание парафиновых срезов МКА против этого антигена ICO25 («МедБиоСпектр», Россия), VNTR III-2 и VNTR III-4 (любезно предоставленные В. Л. Юриным). Образцы депарафинировали по стандартной методике и проводили демаскировку антигенов на водяной бане (температура 95°С) в цитратном буфере (pH 6,О). Затем образцы охлаждали при комнатной температуре. Эндогенную пероксидазу блокировали З% раствором перекиси водорода, а участки неспецифической сорбции иммуноглобулинов — 1% раствором бычьего сывороточного альбумина. После этого наносили первичные антитела и инкубировали в течение ночи при температуре 4°С. Образцы промывали в трех сменах фосфатносолевого буфера (PBS рН 7,2—7,4). Для визуализации иммунологической реакции применяли систему «LSAB + Detection System» («Dako Corp.») согласно инструкции. Пероксидазную активность определяли с помощью аминоэтилкарбазола. Срезы докрашивали гематоксилином Кораччи, заключали в глицериновый гель. Подсчет
результатов реакции проводили полуколичественно в областях, содержащих максимальное количество положительно окрашенных опухолевых клеток, используя микроскоп «Axiolab» («Zeiss», Германия) при увеличении х100 и х400.
Определение экспрессии поверхностных маркеров лимфоцитов
Для определения иммунологического фенотипа МПК использовали мышиные МКА к поверхностным диффе-ренцировочным антигенам лейкоцитов человека. В прямой реакции поверхностной иммунофлуоресценции использовали полученные в ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН МКА серии ИКО (CD3, CD4, CD8, CD16, CD20, CD25, CD71, CD38, CD95), меченные FITC. В качестве изотипического контроля были использованы мышиные МКА против IgG1 и IgG2a человека («Becton-Dickinson», США).
Прямая реакция поверхностной иммунофлуоресценции
Инкубировали 100 мкл цельной крови с 20 мкл МКА, FITC-конъюгированных, в течение 30 мин при температуре 4°С. Образцы отмывали PBS центрифугированием в течение 7 мин при 1200 об/мин. Затем лизировали эритроциты, после чего клетки дважды отмывали PBS и ресуспендировали в PBS, содержащем 1% формалин. Экспрессию антигенов на клетках анализировали методом проточной цитофлюорометрии.
Статистическая обработка данных
Полученные данные анализировали с применением пакета статистических программ Statistica 6.0. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В результате культивирования получали ДК с фенотипом CD14-, CD83 + , CD80 + , CD86+ и MHCII+ (табл. 1). Больным подкожно вводили ДК от 3 до 6 раз (в среднем 4), от 1,0 до 6,0 млн клеток (в среднем 2,1 ± 1,4 млн клеток) в изотоническом растворе NaCl, содержащего 1% сывороточного альбумина человека, из расчета 1 млн клеток в 300 мкл раствора в одну точку. Отмечена удовлетворительная переносимость лечения: на фоне вакцинотерапии с использованием ДК у пациентов наблюдали лихорадку, чувство усталости, недомогания, миалгию, потливость, локальные реакции в месте введения (гиперемия, индурация, зуд, болезненность). Следует отметить, что все проявления токсичности не превышали I степень (согласно критериям CTCAE v.3). Токсичности, лимитирующей дозу препарата, не было отмечено, так как увеличение количества вводимых ДК не приводило к усилению побочных эффектов вакцинотерапии.
Экспрессия MUC-1 в опухолевых образцах
У 10 больных, которые получали в качестве вакцины ДК, нагруженные рекомбинантным пептидом, экспрессия MUC-1 в опухолевых клетках была определена им-муногистохимическим методом. Экспрессия MUC-1 выявлялась во всех исследованных образцах в большинстве опухолевых клеток с выраженной интенсивностью при
окраске антителами 1С025 (рис. 1, А). Реакция с МКА УЫТЯ Ш-2 по интенсивности окрашивания и количеству выявляемых положительных клеток была сравнима с МКА 1С025 (рис. 1, Б).
Реакция гиперчувствительности замедленного типа
Реакцию гиперчувствительности замедленного типа (РГЗТ) считали положительной при развитии гиперемии в зоне размером более 5 мм в точках введения вакцины в течение 3 дней после очередного введения ДК. Размер зоны гиперемии составлял от 8 до 15 мм. РГЗТ развивалась у 8 больных после 2, 3 и 4-го введений. Следует отметить, что РГЗТ развилась у 4 (66,7%) из 6 пациентов, которым вводили ДК, нагруженные аутологичным лизатом, и у 4 (33,3%) из 12 больных, которые получали ДК, нагруженные рекомбинантным пептидом.
Оценка изменений основных субпопуляций лимфоцитов
На фоне терапии ДК определяли фенотип основных субпопуляций лимфоцитов периферической крови. Были проанализированы изменения Т-клеточного звена (СБ3, СБ4, СБ8), В-клеточного (СБ20), натуральных киллеров — ЫК-клеток (СБ16) (табл. 2), маркеров, появляющихся при активации (НЬЛ-БЯ, СБ25, СБ71, СБ38, СБ95) (табл. 3). На фоне терапии существенных изменений в субпопуляционном составе лимфоцитов не наблюдалось. Отмечено увеличение количества цитотоксических лимфоцитов СБ8+ с 35,0 до 43,6%, что несколько выше средних значений в норме. Иммунорегуляторный индекс уменьшался, так как соотношение СБ4/СБ8 сдвигалось в сторону лимфоцитов СБ8 + . Наблюдалась тенденция к увеличению числа клеток СБ16 до нормы с 8,9 до 15,9%. Значительно увеличивалась экспрессия маркеров активации на лимфоцитах: СБ25 с 2,7 до 8,3%, СБ38 — с 22,3 до 36,4% и СБ71 — с 3,3 до 9,4%.
Анализ продолжительности жизни
Анализ общей продолжительности жизни проводили по методу Каплана—Мейера в следующих группах: 1-я — 12 пациентов, получавших вакцину и полихимиотерапию; 2-я — 28 человек, которым проведена только полихимиотерапия (группа контроля); 3-я — 6 больных, получавших только вакцину. Следует отметить, что в 3-й
Таблица 1
Характеристика ДК, полученных в результате культивирования
Маркер Доля положительных клеток, %
CD14 3—5
CD83 30—50
CD80 20—40
CD86 50—80
HLA-DR 70—80
Рисунок 1. Иммуногистохимическое окрашивание парафиновых срезов для определения экспрессии MUC-1 антигена у больных, вакцинированных дендритными клетками, нагруженными рекомбинантным пептидом VNTR22 (световая микроскопия, Х400).
А. Экспрессия MUC-1, выявляемая МКА !^25. Б. Экспрессия MUC-1, выявляемая МКА VNTR Ш-2.
группе 2 больных отказались от химиотерапии, двум химиотерапия не была показана вследствие сопутствующих заболеваний, двое получили только по 3 инъекции, умерли из-за прогрессирования основного заболевания. В 1-й группе медиана продолжительности жизни не достигнута; во 2-й группе составила 23,6 мес; в 3-й — 8,3 мес (рис. 2).
ОБСУЖДЕНИЕ
В настоящее время в мировой клинической практике проводятся более 100 исследований по оценке эффективности противоопухолевых вакцин, половина которых посвящена лечению меланомы. Продемонстрировано, что у большинства больных, которым провели вакцинацию ДК,
развивается антигеноспецифический иммунный ответ, а у 30% происходит регрессия метастазов. Во всех описанных случаях исследователями наблюдался смешанный антигеноспецифический иммунный ответ. Выявление специфических 1дМ, а также ЫК- и Т-клеток СБ8 + в опухоли на фоне вакцинотерапии ДК является благоприятным прогностическим фактором у пациентов, у которых вакцинацию проводили до начала полихимиотерапии [11; 14; 20; 23].
В проведенном нами пилотном исследовании больные колоректальным раком IV стадии с множественными метастазами в печень были вакцинированы ДК, нагруженными опухолевым лизатом или рекомбинантным пептидом МиС-1. ДК, использованные в качестве вакцины, были получены из МПК пациентов.
Многие исследования, в которых для нагрузки ДК были использованы рекомбинантные муцины, включали больных раком яичника, молочной железы и легкого, так как эти опухоли экспрессируют муцин МиС-1, количество которого может в значительной степени различаться в зависимости от нозологии [9; 17]. Проведенное нами иммуногистохимическое исследование 10 образцов, полученных от пациентов, которые были включены в исследование, позволило выявить, что 100% опухолей были положительны по МиС-1 с различной степенью интенсивности, а это согласуется с ранее опубликованными данными [10; 18].
РГЗТ может служить индикатором именно клеточноопосредованных реакций иммунитета, так при введении нагруженных зрелых ДК создается депо, из которого высвобождаются антигены в межклеточное пространство [26]. При проведении клинических исследований вакцинотерапии РГЗТ рассматривают как позитивную реакцию на терапию [17]. Исходя из полученных нами и другими авторами данных можно предположить, что использование лизата опухолевых клеток с более разнообразным набором антигенов является более целесообразным для индукции иммунного ответа у больных по сравнению с рекомбинантным пептидом.
По данным ранее проведенного исследования I—
II фаз, зрелые ДК, нагруженные пептидами МиС-1 и Нег-2/пеи, вызывали цитотоксический иммунный ответ уже после 3-й вакцинации у 5 из 10 больных раком молочной
Таблица 2
Изменения основных субпопуляций лимфоцитов
100 90 -80 -70 -
5 60 -
3
т
| 50 -
.0
т
* 40 -
о
4
30 -
20 -10 -
0 10 20 30 40 50 60 70
Время наблюдения, мес
Рисунок 2. Общая выживаемость больных в зависимости от метода лечения (по Каплану—Мейеру). На графиках темными значками отмечены умершие больные, светлыми — живые. 1 — терапия ДК, нагруженными пептидом, и полихимиотерапия (медиана продолжительности жизни не достигнута); 2 — только полихимиотерапия (медиана продолжительности жизни 23,6 мес); 3 — терапия только ДК, нагруженными лизатом (медиана продолжительности жизни 8,3 мес).
железы и яичника. Лимфоциты периферической крови продуцировали интерферон у, индуцировавший пролиферацию цитотоксических лимфоцитов. Кроме того, было показано, что сочетание для нагрузки ДК сразу двух пептидов (Нег-2/пеи и МиС-1) может быть более имму-ногенным, чем их применение по отдельности [8]. Нами отмечены увеличение количества цитотоксических лимфоцитов СБ8+ и клеток СБ16; мы предполагаем, что у пациентов после иммунотерапии развивался иммунный ответ, ключевыми звеньями которого являлись цитоток-сические лимфоциты и ЫК-клетки. Было установлено статистически значимое увеличение экспрессии маркеров активации (СБ25, СБ38, СБ71). Данные показатели
1л|,
Ш*г— -Н-Ай--| □:
•--1 1 1 1 1д ■ !оо □ □ 1 МП
*01 1 1 г 1 1 Ц 1 Д-|
1 1 ,
1 1 1 | 1 ! 1 ! 1 1 1 1 | 1 1 1 6 3 1-4 2
Маркер Норма, % До лечения, % Наибольший ответ, % р
003 60—80 69,0 ± 17,8 74,4 ± 8,1 0,37
004 35—50 38,5 ± 10,2 36,0 ± 9,9 0,57
008 19—40 35,0 ± 9,0 43,6 ± 9,0 0,04
004/008 ,0 2, 1 ,5 1,22 ± 0,5 0,9 ± 0,4 0,07
0016 10—20 8,9 ± 0,6 15,9 ± 10,2 0,07
0020 5—16 7,5 ± 4,9 9,4 ± 3,9 0,31
Таблица 3
Оценка экспрессии маркеров активации
Маркер Норма, % До лечения, % Наибольший ответ, % р
HLA-DR 7—15 12,0 ± 6,0 14,8 ± 4,2 0,22
CD25 0—5 2,7 ± 2,0 8,3 ± 5,3 0,004
CD38 24—40 22,3 ± 8,6 36,4 ± 11,1 0,003
CD71 0—5 3,3 ± 1,6 9,4 ± 5,3 0,001
CD95 15—40 31,8 ± 16,3 45,1 ± 13,6 0,056
считаются характерными для развития цитотоксическо-го иммунного ответа [3; 21; 24]. Возможно, эти изменения связаны с применением ДК в качестве адъюванта, способного секретировать во внеклеточное пространство факторы, стимулирующие пролиферацию/дифферен-цировку лимфоцитов, а также комплексы молекулы ИЬЛ I или II классов с иммуногенным пептидом (пептидами).
По данным литературы, наиболее выраженные результаты были получены в исследованиях, проведенных с участием больных с I—III стадиями заболевания и с ограниченной распространенностью опухолевой экспансии. В нашем исследовании у пациентов была IV стадия заболевания, имелись распространенные метастатические поражения печени, единичные — в кости и в легкие. Все эти факторы являются неблагоприятными для проведения какой-либо терапии, в том числе иммунной. Тем не менее анализ продолжительности жизни позволил выявить некоторое преобладание сочетанного применения иммуно- и химиотерапии над остальными. Вероятно, в процессе адъювантной иммунотерапии пролиферируют, а затем сохраняются в кровеносном русле клетки памяти. На фоне дальнейшей химиотерапии массовая гибель опухолевых клеток стимулирует выброс опухолевых антигенов. Антигены, будучи распознаны клетками памяти, становятся индукторами развития клеточного, преимущественно цитотоксического ответа [12; 20].
По результатам проведенных исследований можно сделать вывод, что в среднем примерно в 32% случаев вакцинация ДК, нагруженными антигенами различных видов, приносила определенный успех (полный ответ на лечение, частичный ответ, минимальный ответ, смешанный ответ или стабилизацию состояния). Более того, в большинстве случаев клинический ответ (или стабилизация состояния) наблюдался у больных только в том случае, если удавалось достичь иммунологического ответа, что делает связь вакцинации и клинического ответа более тесной.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
На фоне вакцинотерапии с использованием ДК токсичность у пациентов не превышала I степени и проявлялась гриппоподобным синдромом: лихорадка, усталость, недомогание; локальные реакции в месте введения (гиперемия, зуд). Токсичности, лимитирующей дозу, не отмечено (увеличение количества вводимых ДК не приво-
дило к усилению побочных эффектов вакцинотерапии). Отмечена удовлетворительная переносимость лечения. Выраженных побочных эффектов вакцинотерапии ДК, обусловливающих необходимость симптоматической терапии или прекращения лечения, не отмечено. Терапия не оказывала негативного влияния на качество жизни пациентов; несмотря на проводимое лечение, большинство пациентов вели активный образ жизни.
Мы убеждены, что, ДК, нагруженные антигеном, не станут терапией повсеместного выбора, но в скором времени будут определены условия, при которых применение данного вида иммунотерапии окажется наиболее эффективным.
Работа выполнена при финансовой поддержке Правительства Москвы, в рамках Научно-технической программы. ««Разработка и внедрение в медицинскую практику новых методов и средств диагностики и лечения онкологических и других заболеваний».
ЛИТЕРАТУРА
1. Ананьев В. С., Царюк В. Ф. Рак ободочной кишки / Давыдов М. И., Вышковский Г. Л. (ред.). Энциклопедия клинической онкологии: руководство для практикующих врачей. — М.: РЛС-
2004. — С. 305—310.
2. Барсуков Ю. А., Николаев А. В., Перевощиков А. Г. Рак прямой кишки / Под ред. М. И. Давыдова, Г. Л. Вышковского. Энциклопедия клинической онкологии: руководство для практикующих врачей. — М.: РЛС, 2004. — С. 311—318.
3. Лесков В. П., Чередеев А. Н., Горлина Н. К. и др. Клиническая иммунология для врачей. — М.: Фармарус Принт, 1997. — 120 с.
4. Чкадуа Г. З., Заботина Т. Н., Буркова А. А. и др. Адаптирование методики культивирования дендритных клеток человека из моноцитов периферической крови для клинического применения // Рос. биотер. журн. — 2002. — № 3. — С. 55—62.
5. Almand B., Resser G. R., Lindman B. et al. Clinical significance of defective dendritic cell differentiation in cancer // Clin. Cancer Res. — 2000. — Vol. 6. — P. 1755—1766.
6. Amand B., Clarc J., Nikitina I. et al. Increased production of immature myeloid cells in cancer patients: a mechanism of immunosuppression in cancer // J. Immunol. — 2001. — Vol. 166. — P. 678.
7. Bakker A. B., Morland G., de Boer A. J. et al. Generation of antimelanoma cytotoxic T lymphocytes from healthy donors after presentation of melanoma-associated antigen-derived epitopes by dendritic cells in vitro // Cancer Res. — 1995. — Vol. 55. — P. 5330—5334.
8. Brossart P., Heinrich K. S., Stuhler G. et al. Identification of HLA-A2-restricted T-cell epitopes derived from the MUC-1 tumor antigen for broadly applicable vaccine therapies // Blood. — 1999. — Vol. 93. — P. 4309—4317.
9. Brossat P., Wirths S., Stuhler G. et al. Induction of cytotoxic T-lym-phocyte responses in vivo after vaccinations with peptide-pulsed dendritic cells // Blood. — 2000. — Vol. 96. — P. 3102—3108.
10. Byrd J. C, Bresalier R. S. Mucins and mucin binding proteins in colorectal cancer // Cancer Met. Rev. — 2004. — Vol. 23. — P. 77—99.
11. Coca S., Perez-Piqueras J., Martinez D. et al. The prognostic significance of intratumoral natural killer cells in patients with colorectal carcinoma // Cancer. — 1997. — Vol. 79. — P. 2320—2328.
12. Correale P., Cusi M. G., Del Vecchio M. T. et al. Dendritic cell-mediated cross-presentation of antigens derived from colon carcinoma cells exposed to a highly cytotoxic multidrug regimen with gemcitabine, ox-aliplatin, 5-fluorouracil and leucovorin, elicits a powerful human antigen-specific CTL response with antitumor activity in vitro // J. Immunol. —
2005. — Vol. 175. — P. 820—828.
13. De Gramont A., Boni C., Navarro M. et al. Oxaliplatin/5FU/LV in the adjuvant treatment of stage II and stage III colon cancer: efficacy results with a median follow-up of 4 years // ASCO Annual Meeting, Orlando, 13—17 May, 2005. — P. 3501.
14. Funada Y., Noguhi T, Kikuci R. et al. Prognostic significance of CD8+ T-cell and macrophage pretumoral infiltration in colorectal cancer // Oncol. Rep. — 2003. — Vol. 10. — P. 309—313.
15. Gabrilovich D. Mechanisms and functional significance of tumor-induced dendritic cell defects // Nat. Rev. Immunol. — 2004. — Vol. 4. — P. 941—952.
16. Kontani K., Taguchi O, Narita T. et al. Autologus dendritic cells or cells expressing both B7-1 and MUC-1 can rescue tumor specific cytotoxic T lymphocytes from MUC1-mediated apoptotic cell death // J. Leuc. Biol. — 2000. — Vol. 68. — P. 225—232.
17. Kontani K., Taguchi O., Ozaki Y. et al. Dendritic cell vaccine immunotherapy of cancer targeting MUC1 mucin // Int. J. Mol. Med. — 2003. — Vol. 12. — P. 493—502.
18. Li A., Goto M., Horinouch M. et al. Expression of MUC1 and MUC2 mucines and relationship with cell reactivity in human colorectal neoplasia. // Pathol. Int. — 2001. — Vol. 51. — P. 853—860.
19. Morse M. A., Nair S. K., Mosca P. J. et al. Immunotherapy with autologous, human dendritic cells transfected with carcinoembryonic antigen mRNA // Cancer Invest. — 2003. — Vol. 21. — P. 341—349.
20. Mosolits S., Ullenhag G., Mellstedt H. Therapeutic vaccination in patients with gastrointestinal malignancies. A review of immunological and clinical results // Ann. Oncol. — 2005. — Vol. 16. — P. 847—862.
21. Musso T., Delgado S., Franco L. et al. CD 38 expression and functional activities are up-regulated by INF- on human monocytes and monocytic cell lines // J. Leukoc. Biol. — 2001. — Vol. 69. — P. 605—612.
22. Nair S. K., Morse M., Boczkowski D. et al. Induction of tumor-specific cytotoxic T lymphocytes in cancer patients by autologous tumor RNA-transfected dendritic cells // Ann. Surg. — 2002. — Vol. 235. — P. 540—549.
23. Nestle F. O., Alijagic S., Gilliet M. et al. Vaccination of melanoma patients with peptide— or tumor lysate-pulsed dendritic cells // Nat. Med. — 1998. — Vol. 4. — P. 328—332.
24. Nussenzweig M., Golstein P. Lymphocyte activation and effector functions // Current Opinion in Immunol. — 2000. — Vol. 12, N 3. — P. 239—241.
25. Schuler-Thurner B., Schultz E. S., Berger T. G. et al. Rapid induction of tumor-specific type 1 T helper cells in metastatic melanoma patients by vaccination with mature, cryopreserved, peptide- loaloaded monocyte-derived dendritic cells // J. Exp. Med. — 2002. — Vol. 195. — P. 1279—1288.
26. Stern L. J., Brown J. H., Jadetzky T. S. et al. Crystal structure of the human class II MHC protein HLA-DR1 complexed with an influenza virus peptide // Nature. — 1994. — Vol. 368. — P. 2215—2221.
27. Whiteside T. L., Zhao Y., Tsukishiro T. et al. Enzyme-linked immu-nospot, cytokine flow cytometry, and tetramers in the detection of T-cell responses to a dendritic cellbased multipeptide vaccine in patients with melanoma // Clin. Cancer Res. — 2003. — Vol. 9. — P. 641—649.
Поступила 24.10.2007
Marina Igorevna Lukashina1, Anna Vyacheslavovna Smirnova1, Vyacheslav Afandiyevich Aliyev2, Igor Vyacheslavovich Samoylenko1, Nikolay Nikolayevich Semenov3, Vladimir Petrovich Veiko4,
Irina Nikolayevna Mikhailova5, Yury Andreyevich Barsukov2,
Anatoly Yurievich Baryshnikov1
DENDRITIC CELL BASED VACCINES IN COLORECTAL CANCER THERAPY
1 Laboratory of Tumor Experimental Diagnosis and Biotherapy, Tumor Experimental Diagnosis and Therapy Research Institute, N. N. Blokihin RCRC RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, 115478, Russian Federation)
2 Proctology Department, Clinical Oncology Research Institute, N. N. Blokihin
RCRC RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, 115478, Russian Federation)
3 Chemotherapy and Combination Treatment Department, Clinical Oncology Research Institute, N. N. Blokihin RCRC RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow,
115478, Russian Federation)
4 State Research Institute of Genetics and Selection of Industrial Microorganisms (1, 1 Dorozhny pr., Moscow, 117545, Russian Federation)
5 Biotherapy Department, Clinical Oncology Research Institute, N. N. Blokihin RCRC RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, 115478, Russian Federation)
Addresses for correspondence: Lukashina Marina Igorevna, Laboratory of Tumor Experimental Diagnosis and Biotherapy, Tumor Experimental Diagnosis and Therapy Research Institute, N. N. Blokihin RCRC RAMS, 24, Kashirskoye sh., Moscow, 115478, Russian Federation; e-mail: mlukashina@mail.ru Irina Nikolayevna Mikhailova, Biotherapy Department, Clinical Oncology Research Institute, N. N. Blokihin RCRC RAMS, 24, Kashirskoye sh., Moscow, 115478, Russian Federation; e-mail: inmih@nm.ru
A vast clinical study is currently in progress worldwide to find optimal treatment strategies in colorectal cancer. Immunotherapy is one of modern approaches to colorectal cancer treatment. The purpose of this study was to evaluate dendritic cell-based modalities in the treatment of colorectal cancer. The study was performed in 18 patients with metastatic colorectal cancer receiving surgical cytoreduction with removal of the primary tumor.
Dendritic cells were cultured from plastic-adhering monocytes from peripheral blood in the presence of granulocyte macrophage colony stimulating factor, interleukine-4, tumor necrosis factor-a, and prostaglandin E2 with peptide or autologous lysate loading. Dendritic cells were administered subcutaneously. 8 of the 18 patients developed late-onset hypersensitivity reaction. The treatment resulted in increase in CD8+ and CD16+ cell counts and expression of activation markers on lymphocytes. Treatment was well tolerated and did not deteriorate patients' quality of life.
Key words: vaccine therapy, dendritic cells, colorectal cancer, lymphocyte subpopulations.
