CC BY
50
КЛИНИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ
clinical pharmacology
ДЕФЕКТЫ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ НЕЙТРОФИЛОВ ПРИ ХРОНИЧЕСКИХ ГАСТРОДУОДЕНИТАХ У ДЕТЕЙ
Агафонова Е. В.1, Маланичева Т. Г.1, Денисова С. Н.2, 3
1 Казанский государственный медицинский университет
2 Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова, Москва
3 Детская городская клиническая больница № 9 имени Г. Н. Сперанского, Москва
Маланичева Татьяна Геннадьевна
E-mail: tgmal@mail.ru
РЕЗЮМЕ
В настоящее время хронические гастродуодениты (ХГД) занимают одно из ведущих мест в структуре заболеваний желудочно-кишечного тракта у детей. В этиологии ХГД наряду с ведущим патогеном Helicobacter pylori (Hp) возрастает роль грибковой флоры.
Целью работы была оценка функциональной активности нейтрофилов при ХГД, ассоциированным с Hp и грибами рода Candida у детей.
У детей 110 детей в возрасте от 7 до 17 лет с хроническими гастродуоденитами, ассоциированными с Helicobacter pylory (Нр), а также при ассоциации Hp с грибами рода Candida и маркерами вторичной иммунологической недостаточности проводили исследование фагоцитарной активности и иммунофенотипа нейтрофилов методом проточной цитофлюориметрии. Выявлены дифференцированные особенности фагоцитарной активности нейтрофилов при ассоциации с бактериальными патогенами (Hp) и грибковой флорой. Трансформация иммунофенотипа сочеталась со значительной депрессией фагоцитарной и микробицидной функций, более выраженной при ассоциации Нр и грибов рода Candida. Циркулирующий маннанопротеиновый антиген Candida albicans влиял на поверхностный фенотип нейтрофилов, усиливая экспрессию проапоптотического и HLADR-рецепторов и уменьшая экспрессию рецепторов адгезии и цитолиза. Таким образом, при хронических гастродуоденитах у детей отмечалась значительная трансформация фенотипа нейтрофила, имеющая дифференцированные особенности при ассоциации с бактериальными (Hp) патогенами и грибковой флорой. Полученные данные необходимо учитывать при проведении лечебных мероприятий и включать в состав комплексной терапии ХГД, ассоциированных с грибами рода Candida, препараты, направленные на иммунокоррекцию выявленных нарушений. Ключевые слова: хронический гастродуоденит; дети; грибы рода Candida; нейтрофилы.
CD О
SUMMARY
At present, chronic gastroduodenitis (CGD) occupies one of the leading places in the structure of diseases of the gastrointestinal tract in children. In the etiology of CGD, along with the leading pathogenic Helicobacter pylori (HP), the role of the fungal flora increased. The aim of the work was to evaluate the functional activity of neutrophils in children with the CGD, associated with HP and Candida albicans.
Among 110 children in the age from 7 to 17 years with chronic gastroduodenitis, associated with Helicobacter pylory (HP), as well as the association of HP with Candida albicans and the markers of secondary immune insufficiency, a study of the phagocytic activity and immune phenotype of neutrophils by flow cytofluorimetry was conducted. Differentiated peculiarities of the phagocytic activity of neutrophils in association with bacterial pathogens (HP) and fungal flora were identified. The transformation of the immune phenotype was combined with a significant depression of the phagocytic and microbicidal functions, more pronounced with the association of HP and Candida albicans.
Circulating mannano protein antigen of Candida albicans influenced on the surface of phenotype of neutrophils, increasing the expression of protopathic and HLADR-receptors, and decreasing the expression of adhesion receptors and cytolysis. Thus, in case of chronic gastroduodenitis in children, there was a considerable transformation of the phenotype of neutrophil with differentiated characteristics at the association with bacterial (HP) pathogens and fungal flora. The obtained data should be taken into account when carrying out medical activities, and the doctors should include in the composition of complex therapy of CGD, associated with Candida albicans, drugs, aimed at immunocorrection of the identified violations Keywords: chronic gastroduodenitis, children, Candida albicans, neutrophils.
В,
' настоящее время хронические гастродуодениты (ХГД) занимают одно из ведущих мест в структуре заболеваний желудочно-кишечного тракта у детей. В этиологии ХГД наряду с ведущим патогеном Helicobacter pylori (Hp) возрастает роль грибковой флоры. Ассоциативная характеристика патогенов и клиническое течение ХГД у детей во многом зависит от состояния иммунного ответа организма. Нейтрофилы — важнейшие эффекторы врожденного иммунитета, доказана их роль в патогенезе синдромов, ассоциированных с хронической персистенцией патогенов [1]. Нарушение элиминации возбудителей может возникать на фоне ранее имевшихся дефектов функционирования нейтрофилов, а также их несостоятельность усугубляется воздействием ассоциаций патогенов. Фагоцитарная функция и микроби-цидная активность находится в непосредственной зависимости от фенотипа нейтрофилов [1; 2]. В последние годы появились работы, доказывающие регу-ляторную роль нейтрофилов в системе иммунитета, однако малоизученными являются дифференцированные особенности нейтрофилов при хронических заболеваниях желудочно-кишечного тракта у детей, ассоциированных с грибами рода Candida.
Исходя из вышеизложенного, целью работы явилась оценка фенотипической характеристики и функциональной активности нейтрофилов при ХГД, ассоциированным с Нр и грибами рода Candida у детей.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Под наблюдением находилось 110 детей с ХГД в возрасте от 7 до 17 лет. Из них 62 ребенка с ХГД, ассоциированным с Нр (первая группа), а также 48 детей с ХГД, ассоциированным с грибами рода Candida (вторая группа). Обследуемые дети имели клинические маркеры иммунной недостаточности, представленные заболеваниями носоглотки, кожи, частыми острыми респираторно-вирусными заболеваниями (ОРВИ), рецидивирующими бактериальными инфекциями дыхательных путей.
Формирование кандидоза подтверждалось культуральными микологическими исследованиями биоптатов слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки и определением в сыворотки крови циркулирующего кандидозного антигена методом иммуноферментного сенсора. Контрольную группу составили условно здоровые дети, сопоставимые по возрасту с первой и второй группами пациентов.
Фагоцитарная активность изучалась по модифицированной схеме [2], включающей оценку ок-сидазных микробицидных систем в спонтанном (НСТсп) и индуцированном вариантах (НСТст.) НСТ-теста с расчетом коэффициента мобилизации (КМ) и фагоцитарного резерва (ФР). Подсчитывали фор-мазан-позитивные клетки (ФПК) в НСТсп, а также абсолютный фагоцитарный показатель (АФПКсп).
Определялись коэффициент мобилизации (КМ) и фагоцитарный резерв (ФР). Функцию поглощения патогена изучали с использованием 2 млрд. взвеси Staphilococcus aureus. Исследовали содержание активно фагоцитирующих нейтрофилов (ФИ), число фагоцитирующих нейтрофилов в 1 л (АФИ), среднее число фагоцитированных микробов на один активный нейтрофил (ФЧ), среднее число фагоцитированных микробов в 1 л (АФП). Завершенность фагоцитоза оценивали по проценту переваривания (% П) — отношение числа убитых бактерий к общему числу фагоцитированных бактерий, а также интегральному показателю переваривающей активности (ИППА).
Рецепторы на нейтрофилах оценивались методом проточной цитофлюориметрии (Becton Dickinson, США). Клетки метили анти-CD45 моноклональными антителами для наложения оптимального окна дискриминации для N. Исследовали экспрессию молекул адгедии (CD11b, CD62L), цитолиза (CD16+), маркера апоптоза (CD95+) и гисто-совместимости II класса (HLADR).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Анализ результатов проведенного исследования показал, что у детей с ХГД, ассоциированными с Нр и грибами рода Candida, чаще встречалась эрозивная морфологическая форма (в 45,7% случаев), реже— гипертрофическая (25,5%) и редко — поверхностная (13,7%). При всех морфологических формах по частоте встречаемости на первом месте находились грибы рода Candida albicans, на втором — Candida kruzei, а на третьем месте — Candida stellatoidea. Другие виды грибов рода Candida — Candida tropicalis и Candida gulliermondi — встречались в единичных случаях и только при эрозивной форме. Было замечено, что чем продолжительнее сроки от начала заболевания, тем чаще высевались грибы рода Candida. При ХГД с колонизацией слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки грибами рода Candida в 100% случаев в сыворотке крови определялся циркулирующий кандидозный антиген, что указывало на переход от кандидозной колонизации к инвазии гриба с развитием осложненного течения заболевания кандидозной инфекцией или висцеральным кандидозом.
Изучение фагоцитарной активности нейтрофилов показало, что в первой группе больных по сравнению с контрольной группой (табл. 1) на фоне высокой активности оксидантных микро-бицидных систем (ФПКсп., p < 0,05) имело место уменьшение содержания «активных» фагоцитов (ФИ, p < 0,05; АФИ, p < 0,05). Также было выявлено
Б >
ст
So
I- Е
О го
h О г
V о.
Л Е 2|
а
ID
■е
Б
га
V Ü Ш J S X
S
<
Таблица 1
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ
ПРИ ХГД У ДЕТЕЙ, АССОЦИИРОВАННЫХ С НР И ГРИБАМИ РОДА СANDIDA
Показатели фагоцитарной активности Контрольная группа Первая группа Вторая группа
ФИ % 70,5 ± 5,1 55,7 ± 4,3* 48,17 ± 4,12*
АФИ (х 10 л/9) 1,9 ± 0,1 1,18 ± 0,12* 0,95 ± 1,08*
ФЧ 7,5 ± 0,6 5,06 ± 0,38* 4,36 ± 0,38 *
АФЧ (х 10 л/9) 21,2 ± 2,0 11,07 ± 1,31* 8,63 ± 0,79*
АФП 14,9 ± 1,5 6,49 ± 0,43 4,15 ± 0,42*
% П 66,3 ± 5,8 53,86 ± 4,85* 45,65 ± 3,91*
ИППА 130,9 ± 11,4 63,55 ± 4,72* 53,36 ± 3,61*
ФПК % сп. 13,3 ± 1,5 26,6 ± 2,8* 33,9 ± 2,9*/**
АФПК (х 10 л/9) 0,3 ± 0,03 0,55 ± 0,03* 0,67 ± 0,05*
ФПК % ст. 47,8 ± 5,3 40,77 ± 5,66* 39,74 ± 3,78*
АФПК (х 10 л/9) 1,3 ± 0,09 0,89 ± 0,09 * 0,79 ± 0,04*
ФР 34,6 ± 2,8 13,77 ± 1,18* 5,82 ± 0,48 */**
КМ 2,8 ± 0,3 1,9 ± 0,24* 1,14+0,02*/**
* — различия достоверны по сравнению с контрольной группой ^ < 0,05). ** — различия достоверны между группой 1 и группой 2 (р < 0,05).
Таблица 2
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИММУНОФЕНОТИПА НЕЙТРОФИЛОВ
ПРИ ХГД У ДЕТЕЙ, АССОЦИИРОВАННЫХ С НР И ГРИБАМИ РОДА СANDIDA
Показатель Контрольная группа Группа 1 Группа 2
CDllb+% Абс. кол-во 27,8 ± 2,3 0,78 ± 0,01 37,3 ± 2,7* 0,83 ± 0,07 19,2 ± 0,2*/** 0,38 ± 0,01*/**
CD62L+% 38,3 ± 0,6 49,6 ± 0,4* 20,8 ± 0,3*/**
Абс. кол-во 0,82 ± 0,02 1,09 ± 0,11 0,42 ± 0,05*/**
CD16+% 19,0 ± 0,7 6,9 ± 0,4* 3,6 ± 0,2*/**
Абс. кол-во 0,53 ± 0,03 0,15 ± 0,03* 0,08 ± 0,01*/**
CD95+% 13,6 ± 0,2 39,5 ± 10,4* 49,5 ± 0,4*/**
Абс. кол-во 0,38 ± 0,01 0,87 ± 0,07* 1,05 ± 0,01*
HLADR+ % 10,4 ± 0,9 17,2 ± 1,9* 10,3 ± 0,9*/**
Абс. кол-во 0,29 ± 0,03 0,38 ± 0,0,02* 0,21 ± 0,01*/**
* — различия достоверны по сравнению с контрольной группой ^ < 0,05).
**— различия достоверны между группой 1 и группой 2 (р < 0,05).
OJ
снижение объема захваченного патогена (АФП,p < 0,05), угнетение мобилизационной активности (КМ, p < 0,05), снижение способности к перевариванию и киллингу патогенов (% П, p < 0,05; ИППА, p < 0,001; ФР, p < 0,001).
В сравнительном аспекте во второй группе пациентов по сравнению с первой имела место более высокая активность оксидантных микробицид-ных систем (% ФПКсп, p < 0,05, КМ, p < 0,05), более низкие переваривающая и киллинговые функции
(тенденции к снижению% П, ИППА и достоверное снижение ФР; p < 0,05).
Таким образом, у детей с ХГД, ассоциированными с Ц9, с грибами рода Сandida, отмечались более выраженное ингибирование внутриклеточной био-цидности, мобилизация нейтрофилов и способность к киллингу патогенов.
При исследовании поверхностного фенотипа нейтрофилов (табл. 2) были получены разнонаправленные изменения в сравниваемых группах
детей. В первой группе больных по сравнению с контрольной группой условно здоровых детей отмечалось достоверное повышение относительного количества CD11b+ (p < 0,05) и CD62L+ (p < 0,05). Это можно объяснить тем, что CD11b-, CD62L-рецепторы принимают участие в хемотаксисе и фагоцитозе, индукции респираторного взрыва, адгезии нейтрофилов и макрофагов к сосудистой стенке [1].
Во второй группе больных по сравнению с первой группой отмечалось снижение относительного и абсолютного количества CD62L+-нейтрофилов (p < 0,001), а также CD11b+-нейтрофилов (р < 0,05). Субпопуляция нейтрофилов, экспрессирующая рецептор цитолиза (CD16+), достоверно снижалась в обеих группах пациентов по сравнению с контрольной группой детей (p < 0,05). При этом во второй группе имели место более низкие значения, что было более значимым для абсолютных показателей (p < 0,001). CD16 является субъединицей низкоаффинного Fc-рецептора нейтрофилов. В работах последних лет было показано, что маннан-протеи-новый антиген Candida albicans затрудняет адгезию грибов к фагоцитам, которая обеспечивается через рецепторы к Fc-фрагменту антител и рецептору к комплементу [3]. Также были получены достоверные корреляции KM-CD11b+% нейтрофилов (r = -0,56,p < 0,05), КМ-CD62L+-нейтрофилов (r = -0,66, p < 0,05), ИППА — абс. количество CD16+ (r = 0,71, p < 0,05) во второй группе.
Полученные данные показали, что снижение экспрессии рецепторов нарушало фагоцитоз,
предотвращая поглощение патогенов, в том числе и захват грибковой клетки, что подтверждало концепцию о «мобилизационном стазе» нейтрофилов при кандидозной инвазии [4]. Достоверно более высокие показатели CD95+ были в обеих группах больных по сравнению с контрольной группой условно здоровых детей (p < 0,001). При этом наиболее высокий уровень данного показателя отмечался во второй группе (p < 0,001). Экспрессия CD95 на нейтрофилах могла быть обусловлена повышенным уровнем противовоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6, IFN-g и др.), которые индуцируются под влиянием антигенов и метаболитов Нр и грибов рода Candida.
Таким образом, при хронических гастро-дуоденитах у детей отмечалась значительная трансформация фенотипа нейтрофила, имеющая дифференцированные особенности при ассоциации с бактериальными (Нр) патогенами и грибковой флорой. Трансформация фенотипа нейтрофила сочеталась со значительной депрессией фагоцитарной и микробицидной активности, более выраженной при ассоциации Нр и грибов рода Candida. Полученные данные необходимо учитывать при проведении лечебных мероприятий и включать в состав комплексной терапии ХГД, ассоциированных с грибами рода Candida, препараты, направленные на иммунокоррекцию выявленных нарушений.
Б >
ст
So
I- Е
О ги
h О г
V о.
Л Е 2|
а
л ■&
Б Л
V Ü Ш J S X
S
<
ЛИТЕРАТУРА
1. Elghetany M. T. Surface Antigen Changes during 4. Normal Neutrophilic Development: A Critical Review / M. T. Elghetany // Blood Cells, Molecules, and Diseases. — 1998. — № 2. — Р. 112-118.
2. Нестерова И. В. Алгоритмы обследования пациентов со вторичными иммунодефицитными состояниями, сопровождающимися ведущим синдромом вирусно-бактериальной инфекции / И. В. Нестерова // Inter. J. Immunorehabliteition. — 2000. — № 1. — C.72-86
3. Han Y. Candida albicansmannan extract-protein conjugates induce immune response against experimental candidiasis / Y. Han, M. A. Ulrich, J. E. Cutler // J. Infect. Dis. — 2009. — Vol. 179, № 6. — P. 1477-1484.
4. Moraes-Vasconcelos D. Characterization of the cellular immune function of patients with chronic mucocutaneous candidiasis / D. Mo-raes-Vasconcelos, N. M. Orii, C. C. Romano et al. // Clin. Exp. Immunol. — 2008. — Vol. 123, № 2. — P. 247-253.
m
•о
