CC BY
103
УДК 576.316.24
Биотинилированный
компонент
входит в состав
теломеразного
комплекса дрожжей
Saccharomyces
cerevisiae
Д.М. Щербакова, М.Э. Зверева*, О.А. Донцова Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова *E-mail: zvereva@genebee.msu.ru
РЕФЕРАТ Теломераза достраивает теломерные повторы к одноцепочечной ДНК на концах хромосом. Этот фермент представляет собой сложный рибонуклео-протеидный комплекс. В состав теломеразы дрожжей Saccharomyces cerevisiae входят TLC1 РНК, служащая матрицей для синтеза теломерных повторов, теломеразная обратная транскриптаза Est2p, а также ряд вспомогательных белков (Estlp, Est3p, Ku70/Ku80, Sm-комплекс).
Мы обнаружили, что в состав теломеразного комплекса дрожжей входит биотинилированный компонент. Фракция теломеразы, содержащая биотинилированный белок, активна in vitro и составляет небольшую долю от общего количества активной теломеразы, выделенной из клеток. У нас имеются предположения о природе биотинилированного компонента.
Ключевые слова: теломераза дрожжей, биотин, биотинилирование.
Список сокращений: ОТ-ПЦР — обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция, ПААГ — полиакриламидный гель, ДЭАЭ-фракция — теломераза, выделенная из дрожжевого экстракта с помощью хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе, п.о. — пар оснований, н.о. — нуклеотидных остатков.
ВВЕДЕНИЕ Теломераза - это сложный комплекс, состоящий из РНК
На концах хромосом эукариот находятся теломеры. Эти и белков [5, 6]. В состав теломеразного комплекса дрож-
ДНК-белковые структуры защищают хромосомы от дегра- жей Saccharomyces cerevisiae входят обратная теломераз-
дации и слияния концов [1]. Длину теломер поддерживает ная обратная транскриптаза Est2p [7], теломеразная РНК
фермент теломераза, который присоединяет теломерные TLC1 [8], участок которой служит матрицей для синтеза
повторы ДНК к З’-концам хромосомной ДНК [2]. Теломе- теломерных повторов, вспомогательные белки Estlp [9]
раза активна в клетках организма, способных к неогра- и Est3p [10], без которых теломераза не активна in vivo [11],
ниченному делению, в клетках 85% раковых опухолей [3], а также другие белки (Sm-белки [12], Ku-белки [13] и др.).
а также клетках одноклеточных эукариот (простейшие Помимо белков, являющихся субъединицами активного
и дрожжи) [2, 4]. комплекса, для функционирования теломеразы необхо-
димы другие белки, взаимодействующие с компонентами теломеразы, но не входящие в ее состав. Например, белок Cdc13, привлекающий теломеразу на теломеру и необходимый для функционирования теломеразы in vivo [11], не является субъединицей теломеразы [10], хотя и взаимодействует с Est1p [14]. На данный момент детектировано большое количество генов белков, отсутствие которых приводит к укорочению теломер [15]. Известен также ряд белков (шаперон Hsp82p [16] и др.), для которых было показано взаимодействие с отдельными компонентами те-ломеразного комплекса. Возможно, такие белки необходимы для сборки комплекса или входят в состав теломеразы на определенных этапах регуляции. Такая сложная организация теломеразного комплекса связана со сложной регуляцией его функционирования. Известно, что удлинение теломер происходит в поздней S-фазе клеточного цикла [17, 18] и теломераза достраивает теломерные повторы преимущественно на самые короткие теломерные концы [19-21]. Регуляция возможна и на стадии сборки теломе-разного комплекса и деградации его компонентов. Обнаружение новых взаимодействий белков с компонентами теломеразного комплекса и посттрансляционных модификаций белков, участвующих в работе теломеразы, а также выяснение их роли поможет лучше понять процесс функционирования теломеразы в клетке.
Мы обнаружили, что в состав активного теломеразного комплекса дрожжей Saccharomyces cerevisiae входит биотинилированный компонент. Такие теломеразные комплексы составляют менее половины от общего количества активной теломеразы, выделенной из клетки.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Штаммы. В работе использован дрожжевой штамм Saccha-romyces cerevisiae DBY-746 а (ura3-52, leu2-3,112, trpl-289, his3-A1).
Выделение теломеразы с помощью хроматографии на стрептавидин-сефарозе. Культуру клеток дрожжей выращивали в объеме 3.2 л среды SC на глюкозе до оптической плотности А600=1о.е. Клетки осаждали центрифугированием (5 мин, 5000 rpm, ротор JA-10, Beckman, +4°C), промывали водой 4 раза, затем буфером «str» для выделения (20 мМ Трис-НС1 (рН 7.5), 100 мМ NaCl, 2 мМ MgCl2,
1 мМ ДТТ, 0.1 мМ ЭДТА, 10 % (v/v) глицерин, 0.1 % Triton X-100). Полученный осадок клеток механически разрушали перетиранием в жидком азоте и размораживали во льду холодным буфером «str» (10 мл), содержащим ингибиторы протеаз Complete (Roche), PMSF (0.5 мМ) и ингибитор РНКаз RNAsin (Helicon) (40 ед./мл). Клеточный дебрис осаждали центрифугированием (5мин, 5000g; 2 раза по 15 мин, 15000 rpm, ротор JA-20, Beckman, +4 °C). В аликвоте полученного экстракта измеряли суммарную концентрацию белка с помощью наборов реактивов «Compat-Able Protein Assay Kit» и «BCA Protein Assay Reagent» (Pierce Biotechnology). В случае эксперимента с предварительной обработкой экстракта авидином его добавляли в экстракт (10 мкг/1 мг суммарного белка) и инкубировали в течение 10 минут при +4 °C. Далее экстракт (10 мг/мл белка) добавляли к предварительно уравновешенной буфером «str»
стрептавидин-сефарозе (200 мкл суспензии (GE Healthcare) на 10 мл экстракта) и инкубировали при перемешивании в течение 1.5 ч при +4 °C. Затем сорбент промывали 6 раз буфером "str”. Полученную стрептавидин-сефарозу и все остальные фракции замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С для дальнейшего анализа.
Выделение теломеразы с помощью анионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. Теломеразный комплекс выделяли, как описано в работах [4, 22], с небольшими изменениями: для получения фракций, содержащих теломеразу, элюцию с колонки с ДЭАЭ-целлюлозой проводили линейным градиентом концентрации ацетата натрия (от 100 мМ до 1 М). С 10 мл исходного дрожжевого экстракта (10 мг/мл белка) получали 1мл фракции активной теломеразы, который разделяли на аликвоты, замораживали в жидком азоте и хранили при -80 °С для дальнейшего анализа.
Фракционирование S-100 экстракта и фракций, полученных с помощью хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе, в градиенте плотности глицерина.
Культуру клеток дрожжей выращивали, как описано выше, для выделения теломеразы с помощью хроматографии на стрептавидин-сефарозе, но в среде YPD. Аналогично получали дрожжевой экстракт, вместо буфера «str» использовали буфер для лизиса (25 мМ Трис-НС! (рН 7.5), 300 мМ NaOAc, 2 мМ MgCl2, 1 мМ ДТТ, 0.1 мМ ЭДТА, 10 % (v/v) глицерин). Далее получали S-100 экстракт ультрацентрифугированием при 100000g и +4 °C в течение 1 ч, затем концентрировали на центриконах Vivaspin 20 (Sar-torius, Германия, США). 0.5 мл S-100 экстракта (15 мг/мл суммарного белка) или 0.5 мл ДЭАЭ-фракции наслаивали на заранее приготовленные 15-40 %-ные глицериновые градиенты в буфере для лизиса (объем 10.5 мл). Ультрацентрифугирование проводили при 40 000 rpm при +4 °C в течение 24 ч в SW41 роторе. Собирали 22 фракции по 0.5 мл, замораживали и хранили для дальнейшего анализа.
Детекция теломеразной активности in vitro. Для анализа активности в реакции использовали 10 мкл полученной суспензии стрептавидин-сефарозы или ДЭАЭ-фракции или фракции, полученной при ультрацентрифугировании. В конечной смеси (20 мкл) содержалось 50 мМ Трис-НС1 (рН 8.0), 5 мМ MgCl2, 1 мМ ДТТ, 1 мМ спермидина, 0.05 мМ ЭДТА (внесено с теломеразной фракцией), 5 % (v/v) (или больше при анализе проб с градиента) глицерина (внесено с теломеразной фракцией), 100 мкМ dTTP, 20 мкКи [a-32P] dGTP (3000 Ки/ммоль), 5 мкМ олигодезоксирибонуклеоти-да TEL11 (5'-TGGTGTGTGGG-3'). Теломеразная фракция в контрольных реакциях была предварительно проинкубирована с РНКазой А (1 мкл раствора (10мг/мл), 30 мин, 30 °C). Реакцию удлинения TEL11 проводили в течение 1 ч при 30 °C, затем останавливали, добавляя 200 мкл буфера «stop» (20 мМ Tris-НСІ (рН 8.0), 20 мМ ЭДТА, 0.2% Ds-Na) и 3 мкл протеиназы К (20 мг/мл). После инкубации (1 ч, 30 °C) продукты реакции экстрагировали дважды фенолом, один раз смесью хлороформ : изоамиловый спирт (24 : 1), затем осаждали тремя объемами этанола в присутствии 1/10 объема ЗМ NaOAc и 5 мкг тРНК E. coli в качестве соосадителя. Осадок промывали два раза 80%-ным этанолом, сушили, растворяли в формамидном буфере для нанесения на денатурирующий ПААГ (80%-ный деионизо-
ванный формамид, TBE буфер, 0.1 %-ный ксилен цианола и 0.1 %-ный бромфенолового синего). Продукты реакции, а также 5'-[32P]-фосфорилированный TEL11 в качестве маркера длины разделяли электрофорезом в сиквенсном 15 %-ном денатурирующем ПААГ в буфере TBE. Гель сушили и анализировали с помощью электронной авторадиографии на приборе PhosphorImager (Molecular Dynamics).
Вестерн-блоттинг для детекции биотинилированных белков. Белки для анализа проб после ультрацентрифугирования высаживали, постепенно добавляя к пробе пять объемов холодного ацетона, затем выдерживая 24 ч при -20 °C. Осадок промывали холодным ацетоном, сушили и растворяли сначала в буфере, содержащем 8М мочевину и 70 мМ Tris-НСІ (рН 7.5), затем добавляли воду и проводили электрофорез белков в 15 %-ном ПААГ в присутствии Ds-Na по Лэммли [23]. Белки из экстракта и ДЭАЭ-фракций предварительно не высаживали, электрофорез проводили в 10-12 %-ном ПААГ. Белки переносили на нитроцел-люлозную (GE Healthcare) или PVDF мембрану (BioRad). Для детекции биотинилированных белков на мембране использовали конъюгат стрептавидин-пероксидаза хрена [24] и набор реактивов ECL (GE Healthcare).
ОТ-ПЦР анализ. РНК для ОТ-ПЦР анализа получали фенольной экстракцией анализируемых образцов, далее экстракцией смесью хлороформ : изоамиловый спирт (24 : 1) и высаживанием этанолом в присутствии 1/10 объема 3М NaOAc и тРНК E. coli в качестве соосадителя (5 мкг на пробу). Пробы для анализа РНК, связанной на сорбенте, предварительно обрабатывали протеиназой К, как описано выше для детекции теломеразной активности. Все пробы обрабатывали ДНКазой I (1 ед./мкг нуклеиновых кислот или 1 ед. на 100 мкл фракций, полученных при фракционировании в глицериновом градиенте, 1 ч, 37 °C). После этого РНК очищали от белков с помощью экстракции и высаживания, как описано выше. Все пробы растворяли в одинаковом объеме воды (обычно 10 мкл), измеряли концентрацию РНК в образце спектрофотометрически при 260 нм. Для ОТ-ПЦР анализа связывания с сорбентом брали объем, содержащий 0.1 - 0.5 мкг РНК из исходного экстракта, равный объем пробы из несвязавшейся фракции и объем пробы связавшейся фракции с учетом концентрирования TLC1 РНК при связывании ее из экстракта на стрептавидин-сефарозе. При анализе фракций, полученных с градиента, брали на анализ по 1 мкл всех фракций. ОТ-ПЦР анализ проводили с использованием набора реактивов «OneStep RT-PCR Kit» (Qiagen). В качестве ген-специфичных праймеров для анализа TLC1 РНК использовали P2 (5'-GTTTATTCTAGTTTTTTCCG-3') и T8 (5'-CGAAGGCATTAGGAGAAG-3'). Продукты ОТ-ПЦР анализировали методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле в TBE-буфере (89 мМ Tris, 89 мМ борной кислоты,
2 мМ ЭДТА, рН 8.3)
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В состав активного теломеразного комплекса дрожжей входит биотинилированный белок.
Известно, что детектировать активную теломеразу непосредственно в дрожжевом экстракте, полученном при разрушении клеток дрожжей, не удается. Это возможно только при обогащении теломеразного комплекса
или с помощью специфичного связывания на аффинном сорбенте компонентов комплекса (Est1p [25], Est2p [26], Est3p [10]), или с помощью обогащения всего комплекса с помощью анионообменной хроматографии [4, 22]. Мы обнаружили, что при связывании дрожжевого экстракта со стрептавидин-сефарозой на аффинном сорбенте детектируется активная теломераза (рис. 1а). Этот факт свидетельствует о том, что на аффинном сорбенте концентрируется теломераза, так как в исходном экстракте активности нет. Характер детектируемой активности такой
A Б Г
сорбент ДЭAЭ
РНКаза A + — + — авидин — +
• * •
И П С
* •**
!>•* 1
ІІ н.о.*
3 а,
tail
І 2 З 4
—авидин
И ..П С И П С
от -+-+-+ - + -+ - +
І 2 І 2 З 4
+авидин
І000
500
200
п.о.
І 2 З 4 5 6 7 В 9 І0 ІІ І2 ІЗ
Рис. І. Выделение теломеразы дрожжей с помощью хроматографии на стрептавидин-сефарозе: а — анализ активности теломеразы, выделенной на стрептавидин-сефарозе из экстракта, в реакции удлинения олигодезоксирибонуклеотида TELH. РНКаза A(+) и РНКаза A(-) — реакция с предварительной обработкой РНКазой A и без нее соответственно; І, 2 — продукты удлинения TELH теломеразой, выделенной с помощью хроматографии на стрептавидин-сефарозе; З, 4 — то же для теломеразы, выделенной с помощью хроматографии на ДЭAЭ-целлюлозе; б — то же, что и в а с добавлением авидина и без. Aвидин(+)и Aвидин(—) — реакция с предварительной авидином и без нее соответственно; І, 2 — то же, что в позиции а (І, 2); в — ОТ-ПЦР анализ TLd РНК в образцах, полученных при выделении теломеразы на стрептавидин-сефарозе в присутствии авидина и без него. ОТ— и ОТ+ — ОТ-ПЦР анализ без реакции обратной транскрипции и с ней соответственно; І, 2 — продукты ОТ-ПЦР при анализе исходного дрожжевого экстракта (И); З, 4 -то же из несвязавшейся фракции (П) при связывании без добавления авидина; 5, 6 - то же из связавшейся фракции (С) при связывании без добавления авидина; 7 - маркер молекулярных масс; В - ІЗ -то же, что и І - 6 при связывании с добавлением авидина. г - анализ активности теломеразы, выделенной на стрептавидин-сефарозе из ДЭAЭ-фрaкции. І — 5'-[З2Р]-фосфорилированный олигодезокси-рибонуклеотид TELH; 2 — продукты удлинения TELH теломеразой в исходной ДЭAЭ-фрaкции (И); З — то же в несвязавшейся фракции (П); 4 — то же в связавшейся фракции (С), взятой в четырехкратном избытке
В
же, как и активности теломеразы, выделенной с помощью анионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе, т. е. теломераза добавляет лишь один теломерный повтор в реакции in vitro (рис. 1а).
Для проверки того, что наблюдаемое связывание со стрептавидин-сефарозой является результатом взаимодействия «биотин-стрептавидин» (константа диссоциации Kd= 10-14 М [27]) мы провели связывание с предварительной обработкой экстракта авидином. Добавление авидина - стандартный прием для предотвращения связывания со стрептавидин-сефарозой биотинилированных белков из экстракта дрожжей [28], так как взаимодействие «биотин-авидин» (константа диссоциации Kd= 10-15 М [29]) полностью блокирует взаимодействие «биотин-стрептавидин». Действительно, добавление авидина предотвращает связывание теломеразы с аффинным сорбентом (рис. 1б). Этот результат свидетельствует
о специфичности взаимодействия. Связывание теломеразы на сорбенте и предотвращение этого связывания добавлением авидина также подтвержено для TLC1 РНК с помощью ОТ-ПЦР анализа (рис. 1в).
На следующем этапе было проведено связывание с аффинным сорбентом теломеразы, уже очищенной с помощью хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. При этом мы обнаружили, что со стрептавидин-сефарозой действительно связывается активная теломераза, но лишь часть от ее общего количества (рис. 1г) Это может свидетельствовать о том, что биотинилированный белок в своем составе содержит лишь часть комплексов. Также нельзя исключить вероятности того, что при очистке на ДЭАЭ-целлюлозе часть активных теломеразных комплексов «теряет» биотинили-рованный компонент.
Биотинилированный белок-компонент теломеразы имеет массу около 50 кДа и входит в состав лишь части от общего количества активной теломеразы.
Мы провели фракционирование дрожжевого S100 экстракта, а также теломеразы, очищенной на ДЭАЭ-целлюлозе в градиенте масс с помощью ультрацентрифугирования. Центрифугирование обоих типов проб было проведено одновременно и в одинаковых условиях. Известно, что теломеразный комплекс дрожжей при ультрацентрифугировании ведет себя как частица 19S [30]. Мы протестировали полученные фракции на наличие TLc1 РНК, теломеразной активности, а также биотинили-рованных белков (рис. 2, рис. 3). На рис.2а и рис.2в показано распределение активной теломеразы по фракциям, а на рис. 2б и рис. 2в показано распределение по фракциям TLC1 РНК.
С помощью Вестерн-блоттинга мы детектировали био-тинилированные белки в исходном дрожжевом экстракте (рис. 3а) и исходной ДЭАЭ-фракции (рис. 3б), а также распределение биотинилированных белков по фракциям после ультрацентрифугирования (рис. 3в и 3г).
В экстракте и обогащенной на ДЭАЭ-целлюлозе фракции детектируется три наиболее яркие полосы, соответствующие массам 47, 120 и 200 кДа (рис. 3а и 3б). Биотини-лированных белков дрожжей известно немного: Acc1 (250 кДа [31]), Hfa1p (242 кДа [32]), Pyc1p (130 кДа [33]), Pyc2p (130 кДа [33]), Dur1,2p (202 кДа [34]) и Arc1p (42 кДа [35]). В целом, детектируемые нами полосы соотносятся с при-
S1GGэкстракт
1000-
500-
п.о.
фракции 1 — 10 фракции 11—22
1 2 3 4 5 б 7 В 9 1G 11
12 3 4 5 б 7 В 9
ДЭАЭ-фракция
1000-
500-
п.о.
фракции 1 — 10 фракции 11—22
1 2 3 4 5 б 7 В 9 1G
12 345 б 7 В 9
Рис. 2. Анализ фракций, полученных при ультрацентрифугировании в глицериновом градиенте (всего было получено 22 фракции с одного градиента): а — Анализ активности теломеразы во фракциях, полученных при ультрацентрифугировании S100 экстракта, в реакции удлинения олигодезоксирибонуклеотида TEL11; 1 — 9 -продукты удлинения ТЕЬ11 теломеразой во фракциях 1 — 9 соответственно; б — ОТ-ПЦР анализ ТЬС1 РНК во фракциях, полученных при ультрацентрифугировании S100 экстракта; 1 — 9 — продукты ОТ-ПЦР при анализе фракций 1 — 22 соответственно, по две соседние фракции в каждой позиции (1 — 1-я и 2-я фракции, 2 — 3-я и 4-я фракции и т.д.); в — то же, что и в позиции а для фракций, выделенных при ультрацентрифугировании ДЭАЭ-фракции; г — то же, что и в позиции б для фракций, выделенных при ультрацентрифугировании ДЭАЭ-фракции
веденными в литературе [35] и ожидаемыми в соответствии с массами известных белков.
В случае фракционирования обогащенной на ДЭАЭ-целлюлозе теломеразы видно, что вместе с комплексом ко-мигрирует и обогащается биотинилированный белок с массой в районе 50 кДа. Это видно при сопоставлении рис. 2в и 3в. В случае фракционирования экстракта провести соотнесение наличия теломеразной активности в конкретной фракции с наличием биотинилированного белка не представляется возможным из-за того, что во всех фракциях на Вестерн-блоттинге детектируется серия полос, соответствующих всем возможным биотинилированным белкам, аналогичная серии полос в исходном экстракте (данные не показаны).
обсуждение результатов и выводы
Мы показали, что в состав теломеразного комплекса дрожжей входит биотинилированный белок. Однозначно установить, что это за белок и какова его функция, нам пока не удалось. Из-за малого количества теломеразы в клетке (примерно 29 молекул на клетку гаплоидных дрожжей [36]) и того, что не все теломеразные комплексы содержат
A
Б
В
Г
В
. Яг;1
- ж<-43
34
123456789 а.о.
Г
- ч
123456789
Рис. 3. вестерн-блоттинг анализ биотинилированных белков в исходных S100 экстракте, ДЭАЭ-фракции и фракциях, полученных при ультрацентрифугировании в глицериновом градиенте: а -вестерн-блоттинг анализ белков в исходном S100 экстракте; 1 — 3 -биотинилированные белки в раститровке экстракта в уменьшающихся количествах от позиции 1 к позиции 3; б — биотинилированные белки в ДЭАЭ-фракции; 1, 2 - биотинилированные белки в расти-тровке ДЭАЭ-фракции в уменьшающихся количествах от позиции 1 к позиции 2; в — Вестерн-блоттинг анализ белков во фракциях, полученных при ультрацентрифугировании ДЭАЭ-фракции; 1 —
8 — биотинилированные белки во фракциях 1 — 8 соответственно;
9 — биотинилированные белки в исходной ДЭАЭ-фракции; г — то же, что и в позиции в при короткой экспозиции на пленку
биотинилированный белок, наши попытки идентифицировать искомый белок с помощью MALDI-TOF спектрометрии не увенчались успехом. Также нужно отметить, что элюция белков, связанных на стрептавидин-сефарозе взаимодействием «биотин-стрептавидин», представляет собой отдельную задачу и не проходит количественно из-за прочности взаимодействия [37].
Из рис.2в и 3в очевидно, что обнаруживаемый био-тинилированный белок комигрирует с более легкими теломеразными комплексами. Из этих данных и того факта, что биотинилированный белок содержит менее половины активных теломеразных комплексов, выделенных на ДЭАЭ-целлюлозе (рис. 1г), можно сделать интересное предположение. Возможно, биотинилиро-ванный белок входит в состав не всех, а более легких те-ломеразных комплексов, например, еще находящихся в процессе созревания, но уже включающих в себя Est2p и TLC1 РНК, которые обеспечивают активность in vitro. Мы проверили это предположение для фракций, полученных при ультрацентрифугировании S100 экстракта. Две активные тяжелые фракции были объединены, две легкие так же были объединены. Далее было проведено связывание со стрептавидин-сефарозой. Действительно, активная теломераза из более тяжелых фракций не связывается на стрептавидин-сефарозе, тогда как из более легких фракций - связывается (рис. 4). Полученный результат также свидетельствует против гипотезы о том, что биотинилированный компонент «теряется» при очистке на ДЭАЭ-целлюлозе, так как и без очистки с помощью анионообменной хроматографии лишь часть теломеразных комплексов содержит биотинилированный белок.
A Б
S100 экстракт ДЭAЭ
47 ^ ^ “
а.о. I
1 2 З 12
Рис. 4. Анализ связывания со стрептавидин-сефарозой тяжелой (2-я и 3-я фракции) и легкой (4-я и 5-я фракции) фракций, полученных при ультрацентрифугировании S100 экстракта в глицериновом градиенте. РНКаза А(+) и РНКаза А(—) — реакция удлинения TEL11 с предварительной обработкой РНКазой А и без нее соответственно: 1,2 — продукты удлинения TEL11 тело-меразой в исходной тяжелой фракции (И); 3, 4 — то же в связавшейся фракции (С), взятой в четырехкратном и десятикратном избытке, соответственно; 5 — 8 — то же, что и 1 — 4 для легкой фракции
Из полученных нами данных (молекулярная масса белка-кандидата составляет около 50 кДа) и сведений из литературы можно делать предположения о природе биотинилированного белка и его функции. Как было отмечено выше, биотинилированных белков дрожжей известно немного. Это три типа карбоксилаз, содержащих биотин в качестве кофактора: ацетил-КоА-карбоксилазы Асс1р (250 кДа [31]), Ша1р (242 кДа [32]); пируват-карбоксилазы Рус1р (130 кДа [33]), Рус2р (130 кДа [33]); амидолиа-за мочевины Dur1,2p (202 кДа [34]); а также белок Агс1р (42 кДа [35]), который является кофактором аминоацил-тРНК-синтетаз [38]. Про белок Агс1р также известно, что он связывает G-квадруплексы ДНК [39]. Среди этих белков по молекулярной массе только Агс1р находится ближе других известных биотинилированных белков к найденному белку. Интересно, что Агс1р не содержит канонической последовательности для биотинилирования биотин-лигазой и биотинилирование не является важным для выполнения белком своих функций [35]. Как РНК-связывающий белок и белок, связывающий квадруплексы ДНК, Агс1р кажется вероятным кандидатом на роль биотинилированного компонента теломеразы. Возможно, что в состав теломеразы входит белок, для которого еще не показано биотинилирование, взаимодействующий, как и Агс1р, с биотин-лигазой Вр11р и также не имеющий канонической последовательности для биотинилирования.
«Интересен вопрос о возможной функции биотинилированного компонента в теломеразном комплексе. Мы обнаружили, что только более легкая фракция теломеразных комплексов содержит в своем составе биотинилированный белок. Известно, что основными компонентами теломера-зы, которые осуществляют реакцию удлинения теломерной ДНК, являются теломеразная обратная транскриптаза Est2p и теломеразная РНК Г^С1, а остальные компоненты необходимы для регуляции, сборки, созревания и деградации комплекса [5]. Некоторые из них входят в состав тело-меразы лишь временно, на определенной стадии клеточного цикла. Например, белки Est1p и Est3p, необходимые
тяжелая легкая
фракция фракция
И С И С
РНКаза A + - - - + - - -
4|г! ~*й *1 — -
II И.о.в^. і і
1 2 З 4 5 6 7 З
для функционирования теломеразы in vivo, входят в состав комплекса только в поздней S/G2 фазе клеточного цикла [18]. Полученные нами результаты указывают на то, что биотинилированный белок не является постоянным ком-
понентом теломеразного комплекса, а входит в его состав временно, на определенном этапе сборки, регуляции или деградации теломеразы, и, возможно, принимает участие в этих процессах.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. de Lange Т. 2002 Oncogene, 21, 532-40.
2. Greider C.W., Blackburn E.H. 1987 Cell, 51, 887-98.
3. Kim N.W., Piatyszek M.A., Prowse K.R., Harley C.B., West M.D., Ho P.L., Coviello G.M., Wright W.E., Weinrich S.L., Shay J.W. 1994 Science, 266, 2011-5.
4. Cohn M., Blackburn E.H. 1995 Science, 269, 396-400.
5. Cech T.R. 2004 Cell, 116, 273-9.
6. Collins K. 2006 Nat Rev Mol Cell Biol, 7, 484-94.
7. Counter C.M., Meyerson M., Eaton E.N., Weinberg R.A. 1997 Proc Natl Acad Sci U S A, 94, 9202-7.
8. Singer M.S., Gottschling D.E. 1994 Science, 266, 404-9.
9. Zhou J., Hidaka K., Futcher B. 2000 Mol Cell Biol, 20, 1947-55.
10. Hughes T.R., Evans S.K., Weilbaecher R.G., Lundblad V. 2000 Curr Biol, 10, 809-12.
11. Lendvay T.S., Morris D.K., Sah J., Balasubramanian B., Lundblad V. 1996 Genetics,
144, 1399-412.
12. Seto A.G., Zaug A.J., Sobel S.G., Wolin S.L., Cech T.R. 1999 Nature, 401, 177-80.
13. Peterson S.E., Stellwagen A.E., Diede S.J., Singer M.S., Haimberger Z.W., Johnson C.O., Tzoneva M., Gottschling D.E. 2001 Nat Genet, 27, 64-7.
14. Evans S.K., Lundblad V. 1999 Science, 286, 117-20.
15. Ungar L., Yosef N., Sela Y., Sharan R., Ruppin E., Kupiec M. 2009 Nucleic Acids Res,
16. Toogun O.A., Dezwaan D.C., Freeman B.C. 2008 Mol Cell Biol, 28, 457-67.
17. Fisher T.S., Taggart A.K., Zakian V.A. 2004 Nat Struct Mol Biol, 11, 1198-205.
18. Osterhage J.L., Talley J.M., Friedman K.L. 2006 Nat Struct Mol Biol, 13, 720-8.
19. Chang M., Arneric M., Lingner J. 2007 Genes Dev, 21, 2485-94.
20. Hector R.E., Shtofman R.L., Ray A., Chen B.R., Nyun Т., Berkner K.L., Runge K.W.
2007 Mol Cell, 27, 851-8.
21. Sabourin M., Tuzon C.T., Zakian V.A. 2007 Mol Cell, 27, 550-61.
22. Lue N.F., Peng Y. 1998 Nucleic Acids Res, 26, 1487-94.
23. Laemmli U.K. 1970 Nature, 227, 680-5.
24. Hoja U., Wellein C., Greiner E., Schweizer E. 1998 Eur J Biochem, 254, 520-6.
25. Steiner B.R., Hidaka K., Futcher B. 1996 Proc Natl Acad Sci U S A, 93, 2817-21.
26. Friedman K.L., Cech T.R. 1999 Genes Dev, 13, 2863-74.
27. Green N.M. 1990 Methods Enzymol, 184, 51-67.
28. Srisawat C., Engelke D.R. 2001 Rna, 7, 632-41.
29. Green N.M. 1963 Biochem J, 89, 585-91.
30. Lingner J., Hughes T.R., Shevchenko A., Mann M., Lundblad V., Cech T.R. 1997 Science, 276, 561-7.
31. Hasslacher M., Ivessa A.S., Paltauf F., Kohlwein S.D. 1993 J Biol Chem, 268, 10946-52.
32. Hoja U., Marthol S., Hofmann J., Stegner S., Schulz R., Meier S., Greiner E., Schweizer E. 2004 J Biol Chem, 279, 21779-86.
33. Brewster N.K., Val D.L., Walker M.E., Wallace J.C. 1994 Arch Biochem Biophys, 311, 62-71.
34. Genbauffe F.S., Cooper T.G. 1991 DNA Seq, 2, 19-32.
35. Kim H.S., Hoja U., Stolz J., Sauer G., Schweizer E. 2004 J Biol Chem, 279, 42445-52.
36. Mozdy A.D., Cech T.R. 2006 Rna, 12, 1721-37.
37. Rybak J.N., Scheurer S.B., Neri D., Elia G. 2004 Proteomics, 4, 2296-9.
38. Simos G., Segref A., Fasiolo F., Hellmuth K., Shevchenko A., Mann M., Hurt E.C. 1996 Embo J, 15, 5437-48.
39. Frantz J.D., Gilbert W. 1995 J Biol Chem, 270, 20692-7.
