CC BY
379
Биосорбция тяжелых металов клеточными оболочками дрожжей saccharomyces cerevisiae
С.Д. Аронбаев
аспирант кафедры неорганической химии ФЕН СамГУ А.М. Насимов
профессор, доктор технических наук, заведующий кафедрой неорганической химии ФЕН СамГУ
Д.М. Аронбаев
кандидат химических наук, доцент кафедры неорганической химии ФЕН СамГУ
Введение
Многочисленные исследования последних лет [1—5]. свидетельствуют о том, что клетки микроорганизмов различных таксономических групп способны концентрировать значительные количества металлов из водной среды, независимо от того, имеют ли эти металлы физиологическое значение или их участие в метаболических процессах не установлено. Практически во всех случаях микробная биомасса может удерживать более или менее значительные количества ионов металлов, что открывает перспективу применения микроорганизмов в биотехнологических способах очистки сточных и природных вод от тяжелых металлов, токсинов и радионуклидов.[ 6—8]. Еще более привлекательным может показаться изучение био-сорбционных процессов с целью создания биосорбентов для извлечения тяжелых металлов, радионуклидов, токсинов из сточных вод с использованием отходов биотехнологических производств фармацевтической и пищевой промышленности : мицелий производства антибиотиков и избыточных пивных или пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae . При этом решается сразу несколько проблем :
1—утилизация самих отходов производства;
2—очистка сточных вод от тяжелых металлов и вредных примесей с целью возвращения их в рецикл. Целью настоящей работы является изучение био-сорбционного потенциала и установление механизма взаимодействия ионов тяжелых металлов с клеточными облочками дрожжей Saccharomyces cerevisiae—круп-нотоннажного отхода пивоваренного производства
В качестве сорбируемых ионов для проведения исследований нами были выбраны ионы Pb+2, Cd+2, Си+2—как наиболее часто встречающиеся антропогенные и природные загрязнители окружающей среды. Экспериментальная часть.
В работе были использованы осадочные дрожжи Saccharomyces cerevisiae, штамм W-37, отобранные из ЦКТ(цилиндро-конического танка) после фильтрации основного продукта—пива. Осадочные дрожжи подвергали следующей обработке: биомассу центрифугировали, осадок дрожжей отмывали дистиллированной водой до получения прозрачного раствора, автоклавировали при 1300С в течение 1,5 час и высушивали в вакуумном шкафу при 650 С. Высушенную биомассу дрожжей размельчали в электромельнице и просеивали через сито с диаметром отверстий 0,3-0,5 мм.
Модельные концентрации ионов тяжелых металлов готовили растворением соответствующих солей
Pb(NO3)2 «2Н2О , Cd(NO3)2 • 4Н2О и CuSO4 • 5H2O квалификации «хч» в дистиллированной воде.
Контактирование навесок дрожжевого биосорбента с растворами индивидуальных солей тяжелых металлов с известной начальной концентрацией проводили в конических колбах Эрленмеера емкостью 250 мл в течении контролируемого времени при встряхивании на горизонтальной качалке АВУ—6С при 150 об/мин.
Сорбционную емкость биомассы рассчитывали по разности концентраций исходного и конечного растворов по формуле:
(C0-C )-V
q— 0 равн7_
4 m
где g—емкость сорбента в мг/г;
C0 и Сравн —начальная и равновесная концентрации
ионов металла
в растворе, мг/л;
V—объем раствора, л
m—масса сорбента, г.
Равновесные концентрации ионов тяжелых металлов в растворах определяли методом переменнотоковой инверсионной вольтамперометрии на компьютеризированном вольтамперометрическом комплексе, созданном на базе универсального полярографа ПУ-1 [9], с использованием трехэлектродной стеклянной ячейки с толстопленочным ртутно-графитовым электродом в качестве рабочего, вспомогательным электродом служил стержень из спектрального углеграфита. В качестве сравнительного электрода служил насыщенный хлорсеребряный электрод ЭВЛ-1М4. В качестве электролита использовали 0,2 н HCl. Концентрации тяжелых металлов определяли методом добавок.
Контроль за рН растворов осуществляли с помощью иономера ЭВ-74 со стеклянным рН-электродом ЭСЛ-63-07.
По полученным данным строили изотермы адсорбции в координатах Фрейндлиха и Ленгмюра. Коэффициенты корреляции R2 и критериальные уравнения находили с помощью расчетов на ПК с использованием программы Advanced Grapher [10] Результаты и их обсуждение
Осадочные, или избыточные дрожжи низового брожения Saccharomyces cerevisiae, являющиеся отходом пивоварения, представляют собой вспененную биомассу, частично разрушенных и частично живых клеток микроорганизмов и состоящей, в основном, из биополимеров. Около 50% массы сухого вещества составляют белки, 10—20%—компоненты клеточной стенки, в том числе полиаминосахариды, 10—20%—РНК, 3-4% -ДНК и приблизительно 10%—липиды. Кроме того, биомасса содержит компоненты питательной среды, главным образом минеральные соли и остаточные количества целевого продукта. [11].
Сорбция иона метала дрожжевой биомассой может осуществляться различными путями и быть активной или пассивной. Очевидно, активная сорбция, или биоаккумуляция, характерна лишь для живых клеток и зависит от их метаболической активности [12—14]. Пассивная сорбция ионов металлов не зависит от метаболической активности клеток и характеризуется биосорбцией и (или) ионным обменом. Такая сорбция может происходить как на поверхности живых, так и мертвых клеток микроорганизмов.
Химические науки
in »
Л>
I
I1 г
и
I«
• лышнитошш
рк; iniiim
Tl
№ IMI IM НЮ ?-4l Jsu
я JO 40 » ■ WW
Рис. 1 Изотермы биосорбции ионов СсГ2 Pb+L и Сu+2 клеточными '
Рис. 2 Влияние pH на биосорбционные свойства дрожжевых клеток
Рис. 3 Кривая потенциометрическоготитрования биомассы дрожжей
Так как в процессе автоклавирования и высушивания дрожжевой биомассы живых клеток не осталось, то в данном случае может осуществляться только биосорбция клеточными оболочками дрожжей, представляющих собой белковополисахаридный комплекс с молекулярной массой 25 -500 кД [15].
На рисунке 1 представлены типичные изотермы адсорбции ионов кадмия, свинца и меди клеточными оболочками дрожжей.
Для расчета параметров биосорбции были использованы методы линеаризации изотерм по уравнениям Фрейндлиха и Ленгмюра .
В таблице 1 сведены характеристические параметры изотерм адсорбции для ионов РЪ+2, Сё+2 и Си+2 в координатах Фрейндлиха и Ленгмюра.
Таблица 1 Характеристические параметры изотерм адсорбции для ионов РЬ+2, Сс1+2 и Си+2 в координатах Фрейндлиха и Ленгмюра*
Сор- би- руе- мый ион Расчеты по уравнению Фрейндлиха Расчеты по уравнению Ленгмюра
n K критериальное R2 Qmax, мг/л b критериальное R2
Pb+2 0,598 2,951 у=0,5441х +0,2988 0,9002 125,0 0,0131 у=0,5491х + 0,0112 0,9866
Cd+2 0,390 6,025 у=0,3738х +0,7846 0,9797 34,48 0,0331 у=0,3119х + 0,0304 0,8409
*—концентрация сорбента (биомассы) 1 г/л, начальная концентрация ионов металлов 100 мг/л, t = 250 С, рН 5,4 частота встряхивания горизонтального шейкера 150 качаний/мин.
Из представленных результатов следует, что биосорб-ционные способности биомассы дрожжей убывает в ряду РЪ+2 > Сё+2 > Си+2.
В ходе исследований была изучена биосорбция указанных ионов в диапазоне рН 3—6,5. Этот диапазон был выбран нами из следующих соображений: во-первых, высокая протонизация раствора может повлиять на деструкцию биополимеров дрожжевой биомассы [15]; во-вторых, увеличение рН > 6 может сместить равновесие гидратационных процессов в сторону образования гидроокисей тяжелых металлов с низкими значениями ПР [16]:
На рисунке 2 представлена зависимость расчетных значений О .от рН
^макс. г
Как мы и предполагали, увеличение рН > 6 приводит к снижению биосорбции указанных ионов. Уменьшение рассчитанных значений О в кислой
макс.
области рН можно объяснить конкуренцией Н+ ионов с двухзарядными ионами тяжелых металлов за места связывания на клеточной стенке.
Таким образом, оптимальными значениями рН для осуществления биосорбции ионов РЪ+2, Сё+2 и Си+2 клеточными оболочками дрожжей ВассЬагошусеБ сегете1ае является диапазон рН 4,5—5,5. При этом смещение оптимального рН к нижней границе характерно для меди.
Интересно отметить, что и для живых дрожжевых клеток оптимальное значение рН в процессе брожения ячменного сусла является 4,5—5,4.[11].
Биосорбционные свойства клеток микроорганизмов зависят от наличия в их структуре определенных функциональных групп, способных к образованию химических связей с ионами тяжелых металлов [12,13]. И здесь, помимо потенциального осаждения ионов тяжелых металлов компонентами клетки, может происходить ионный обмен и комплексообразование между функциональными группами белков, полисахаридов, нуклеиновых кислот, присутствующих в микроорганизме и ионом тяжелого металла.
С целью выявления функциональных групп пептидо-глюкановой цепи биополимера дрожжевой оболочки нами проведено потенциометрическое титрование протонированной биомассы отмытых дрожжевых клеток.
Для этого 1 г высушенной дрожжевой биомассы обрабатывали 50 мл 0,1н. HCl в течении 3 часов при комнатной температуре и встряхивании колб с суспензией на шейкере с частотой 150 качаний/мин. Затем проводили потенциометрическое титрование содержимого колбы 0,1н. NaOH с использованием стеклянного рН-электрода ЭСЛ-63-07 и насыщенного хлорсеребряного сравнительного электрода ЭВЛ-1М3 в качестве индикаторной системы для определения конечной точки титрования. По найденным перегибам на кривой титрования определяли изопо-тенциальные точки, по которым судили о наличии функциональные групп биополимеров клеточных оболочек дрожжей [17].
Кривая потенциометрического титрования и ее интерпретация представлены на рисунке 3 и таблице 2, соответственно.
Таблица 2 Функциональные группы дрожжей S.cerevisiae, выявленные потенциометрическим титрованием.
№/№ pKV Функциональная группа
1. 5,52 ± 0,06 Карбоксильная группа
2. 6,70 ± 0,02 Фосфорильная группа
3. 9,48 ± 0,05 Амины
Таким образом, в биополимере клеточных стенок дрожжей имеются, по крайней мере, три однозначно определяемых и доступных ионам металла функциональные группы: карбоксильные, фосфорильные и амино-группы. Кроме того следует учитывать наличие липидов и сульфоги-дрильных (тиольных) групп, ответственных за осаждение тяжелых металлов на поверхности в виде труднорастворимых сульфидов, которые могут участвовать в процессах комплексообразования, осуществляемых по различному механизму—координационному или хелатирующему.
Образовывать комплексы по хелатирующей схеме в биополимере могут как амино—так и карбоксо-груп-пы, являющиеся монодентатными лигандами.
Карбоксо-, гидроксо—и фосфорильные группы могут образовывать химические связи с ионами металлов координируясь вокруг него с учетом сте-реохимических ограничений. И, наконец, тиольные группы попросту могут взаимодействовать с ионами тяжелых металлов, переводя их в трудно растворимые сульфиды.
Ионный обмен также может сопровождать биосорбцию. Этому способствуют опять-таки карбоксильные, аминные и фосфорильные группы группы, несущие положительный (для анионного обмена) или отрицательный (для катионного обмена) заряд.
Таким образом, рассуждения о механизме биосорбции дают представления о его чрезвычайной сложности и, порой, непредсказуемости: уж очень многие факторы оказывают на него воздействие. Однако, можно с уверенностью сказать, что биосорбция не может протекать по какому-либо одному механизму, а происходит различными путями одновременно.
С целью выявления приоритетности функциональных групп клеточных оболочек дрожжей в биосорбции ионов тяжелых металлов, нами был проведен эксперимент по их последовательной блокировке путем химической модификации биополимера. [17,18], а именно алкилирование аминогрупп, этерификация карбоксильных и фосфорильных групп, химическое связывание сульфогидрильных групп и экстракционное удаление липидов.
Подготовленные таким образом сорбенты подвергались испытаниям и проводили сравнение полученных результатов биосорбции ионов РЬ+2 с контрольным образцом дрожжевой биомассы, не подвергавшейся химической модификации.
Результаты исследования представлены диаграммой на рисунке 4
Рис.4 Диаграмма биосорбции ионов свинца дрожжевыми клетками, подвергнутых химической модификации. (цифрами указано Омакс.,мг/г)
11 Контроль II Метилирование аминов
Таблица 3 Влияние блокирования активных групп биополимеров дрожжевой клетки на эффективность биосорбции ионов РЬ+2
III Этерификация карбоксилов
1IV Экстракция липидов
V Этерификация фосфорильныхгрупп
VI Модификация сульфогидрильных групп
П ш
Как видно, наибольшее влияние на процесс биосорбции ионов РЬ+2 оказывают карбоксильные и аминогруппы пептидо-глюкановой цепи биополимеров клеточных оболочек дрожжей.
В таблице 3 приводятся величины отрицательного эффекта биосорбционных процессов для ионов РЬ+2 вызванного химической блокировкой функциональных групп биополимеров клеточных оболочек дрожжей.
№/№ Метод химической блокировки Снижение сорбционного эффекта, %
1. Метилирование аминов 48,3
2. Этерификация карбоксильных групп 95,8
3. Экстракция липидов 4,2
4. Этерификация фосфорильных групп 33,3
5. Модификация сульфогидрильных групп дитиодипиридином 12,5
Выводы
Проведенное исследование по изучению биосорбционного потенциала осадочных пивоваренных дрожжей показывают, что клеточные оболочки дрожжей БассЬагатусеБ сегете1ае, являясь по сути природным биополимером, содержащим пептидо-глюкановую цепь, обладают удовлетворительными сорбционными свойствами по отношению к ряду тяжелых металлов, при этом вклад функциональных групп биополимера в биосорбцию убывает в следующем ряду: карбоксильные группы > аминогруппы> фосфорильные группы > сульфогидрильные группы > липиды.
Список использованных источников
1. Volesky B. Biosorption and me // Water Research, 2007 v.41, 18, p. 4017-4029
2. Vijayaraghavan K., Yun Ye.-S. Bacterial biosorbents and biosorption // Biotechnology Advances, 2008, v. 26, 3, p. 266-291
3. Cupta G., Keegan B. Bioaccumulation and biosorption of lead by poultry litter microorganisms // Poultry Sci. 1998,77, №3, р. 400—404.
4. White C., Gadd G.M. .Biosorption of Radionuclides by Fungal Biomass.// J.Chem. Tech.Biotechnol. 1990, 49, p. 331-343.
5. Yun-guo Liu, Ting Fan, Guang-ming Zeng, Xin Li, Qing Tong, Fei Ye, Ming Zhou, Wei-hua Xu, Yu-e Huang. Removal of cadmium and zinc ions from aqueous solution by living Aspergillus niger // Transactions of Nonferrous Metals Society of China, 2006, v. 16, 3, p. 681-686
6. Буракаева А.Д., Русанов А.М., Ланух В.П. Роль микроорганизмов в очистке сточных вод от тяжелых металлов: Методическое пособие. Оренбург: ОрГУ, 1999 г., С. 53;
7. Каравайко Г.И., Авакян З.А. Биотехнология очистки промышленных сточных вод от токсичных металлов и твердых взвесей //Биотехнология очистки сточных вод. 2004, c.102—113.
8. Блинов В.А., Иванов А.Б. Использования эффективных микроорганизмов для очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов // ФГОУ ВПО Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова, 2005.
9. Аронбаев С.Д., Насимов А.М., Аронбаев Д.М., Насыров Р.Х. Компьютеризированный аналитический комплекс для инверсионной вольтамперометрии на базе универсального полярографа ПУ-1. // Научный вестник Самаркандского Государственного Университета. 2009, 1(53) с.47-50.
10. Аронбаев С.Д. Клеточные оболочки дрожжей Saccharomyces cerevisiae как сорбенты тяжелых металлов.// Научный вестник Самаркандского Государственного Университета. 2010, 3 (61) с.44-48.
11. Кунел И. Производство солода и пива. Пер.нем., С-Пб., 2004, 652 с.
12. Marques, P.A.S.S., Rosa, M.F., and Pinheiro H.M .pH Effects on the Removal of Cu2+, Cd2+ and Pb2+ From Aqueous Solution by Waste Brewery Biomass.//. Bioprocess Enginnering. 2000, v.23 p.135-141.
13. Blackwell, K.J., I. Singleton and J.M. Tobin. Metal cation uptake by yeast: a review// Appl. Microbiol. Biotechnol., 1995 43: 579-84
14. Engl A., Kunz B. Biosorption of heavy metals by Saccharomyces cerevisiae: effects of nutrient conditions.// J. Chem. Technol. 1995, т. 63, № 3, с.257-261.
15. 15. Бирюзова, В.И. Ультраструктурная организация дрожжевой клетки . М.: Наука, 1993.—224 c.
16. 16. Лурье Ю.Ю. Справочник по аналитической химии. М.Химия, 1971, изд.4-е, 456 с
17. 17.Насимов А.М., Аронбаев С.Д, Холмурадова З.Х. Механизм биосорбционного взаимодействия клеточных оболочек пивоваренных дрожжей с ионами тяжелых металлов // Научный вестник Самаркандского Государственного Университета. 2010, 3(61) с.49-54.
18. 18. Губен-Вейль. Методы органической химии, т.11. Методы
