CC BY
78
Том 154, кн. 4
Естественные науки
2012
УДК 579.842.21:577.152.314:577.151.52
БИОСИНТЕЗ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ Serratia marcescens ПРИ ИНГИБИРОВАНИИ БИОСИНТЕЗА ПУРИНОВ
Р. Шах Махмуд, М.Н. Филимонова Аннотация
Для исследования биосинтеза эндонуклеазы Serratia marcesacens в условиях блокирования биосинтеза пуринов культуру выращивали в присутствии 0.1%-ного 2-(пара-аминобензолсульфамидо)-тиазола и по мере роста оценивали синтез эндонуклеазы по ее активности в питательной среде и периплазме бактерий. Показано, что при добавлении в питательную среду 2-(пара-аминобензолсульфамидо)-тиазола происходит качественное и количественное изменение динамики роста культуры S. marcescens W1050, увеличение биосинтеза и продукции эндонуклеазы, а также уменьшение доли внеклеточного и увеличение доли внутриклеточного фермента.
Ключевые слова: Serratia marcescens, эндонуклеаза, биосинтез, 2-(пара-амино-бензолсульфамидо)-тиазол, норсульфазол, ингибирование биосинтеза пуринов.
Введение
Внеклеточная эндонуклеаза (К.Ф.3.1.30.2) грамотрицательных бактерий Serratia marcescens является наиболее изученным ферментом в ряду бактериальных нуклеаз с широкой специфичностью [1]. Несмотря на значительный прогресс в исследовании эндонуклеазы [2-6], биосинтез и секреция этого фермента изучены недостаточно. Известно, что секреция нуклеазы в окружающую среду обычно происходит во время стационарного роста культуры [7]. Биосинтез эндонуклеазы увеличивается при SOS-ответе клеток на повреждение ДНК и блокирование ее репликации [8, 9]. Установлено, что при ингибировании биосинтеза пуринов происходит угнетение роста бактерий, снижение биосинтеза и продукции внеклеточной эндонуклеазы и смещение пика ее активности на кривой накопления в питательной среде, а также в ответ на добавление 2-(пара-аминобензолсульфамидо)-тиазола (2-ПАБСТ) наблюдается дополнительная секреция эндонуклеазы в окружающую среду [10]. Вместе с этим данных о биосинтезе эндонуклеазы в целом в ответ на блокирование биосинтеза пуринов нет, хотя известно, что секреция эндонуклеазы представляет собой двухэтап-ный процесс, в котором часть синтезированного фермента перед секрецией в окружающую среду задерживается в периплазме на продолжительное время. Поскольку блокирование биосинтеза пуринов, вероятно, замедляет репликацию ДНК, мы предположили, что, по аналогии с SOS-ответом клетки, это может вызвать усиление биосинтеза эндонуклеазы. Таким образом, определение особенностей биосинтеза эндонуклеазы в условиях блокирования биосинтеза пуринов представляло интерес и стало целью исследования, в ходе которого
биосинтез пуринов блокировали с помощью 0.1%-ного 2-ПАБСТ и по мере роста культуры оценивали синтез эндонуклеазы по ее активности в питательной среде и периплазме бактерий.
Материалы и методы
В исследовании использовали бактерии £. marеesеens W1050, любезно предоставленные профессором университета г. Хьюстона (США) М. Бенедиком.
Культуру выращивали 36 ч при 37 °С с принудительной аэрацией (200 об/мин) в отсутствие (контроль) или в присутствии (опыт) 2-(пара-аминобензолсуль-фамидо)-тиазола (1С^ США) на среде следующего состава (г/л): №С1 - 4.7, N^01 - 1.1, №2804 - 0.4, МеСЬ - 0.95, К2НР04-3Н20 - 2.8, глюкоза - 5, гидро-лизат казеина - 1 и дрожжевой экстракт - 3.
Руководствуясь рекомендациями [11], 100 мг 2-ПАБСТ растворяли в 1.5 мл 0.25 М №2С03 с нагреванием (рН раствора 9.0) и добавляли перед внесением посевного материала в питательную среду до конечной концентрации 0.1%.
Посевной материал, которым служила 12-часовая культура, выращенная на жидкой питательной среде в отсутствие сульфаниламида, вносили в свежую среду до оптической плотности 0.05, которую определяли нефелометрически на КФК-2 при 590 нм.
Интенсивность роста культуры оценивали нефелометрически в кювете толщиной 3.06 мм. Количество биомассы выражали в единицах светорассеяния.
Получение периплазмы проводили, взяв за основу ранее опубликованный метод [12, р. 78-79] и внеся необходимые модификации. Для этого бактериальные клетки отделяли от культуральной жидкости центрифугированием в течение 10 мин при 12000 об/мин. Для удаления с поверхности клеток следов внеклеточной эндонуклеазы клетки отмывали 4-5 раз 0.5%-ным №С1, затем при 4 °С 2 раза 10 мМ трис-НС1 буфером, рН 8.0, и собирали каждый раз центрифугированием в течение 15 мин при 5000 об/мин. Для нарушения наружной мембраны и клеточной стенки 10 мг сырой биомассы суспендировали в 0.8 мл раствора, представляющего собой 30 мМ Трис-НС1 буфер, рН 8.0, и 60%-ную сахарозу. К суспензии добавляли 20 мкл фенилметилсульфонилфторида (7 мг/мл), 33 мкл 0.25 М К-ЭДТА, рН 7.0, и 16 мг лизоцима и инкубировали при комнатной температуре 30 мин. Подтверждением нарушения клеточной оболочки служило превращение клеток в сферопласты, которые определяли светлопольной микроскопией после предварительного окрашивания мазков по Граму. Образовавшиеся сферопласты отделяли центрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 мин. Для подтверждения сохранения целостности клеточной мембраны при отделении сферопластов определяли оптическую плотность надосадоч-ной жидкости при 260 и 280 нм и соотношение полученных значений.
Для корректной оценки уровней внеклеточной и внутриклеточной эндо-нуклеазы оценивали целостность клеточной оболочки при отделении бактериальных клеток от культуральной жидкости, для чего проводили анализ динамики маркерного белка - Р-галактозидазы - в периплазме и культуральной жидкости, как рекомендовано [13].
Нуклеазную активность определяли методом кислоторастворимых фракций в соответствии с рекомендациями [14].
Продуктивность культуры рассчитывали как отношение ферментативной активности к оптической плотности культуры.
Биосинтез эндонуклеазы определяли как сумму нуклеазной активности в культуральной жидкости и периплазме. Активность фермента в периплазме (Апп) рассчитывали по следующей формуле:
A•80•B
A _ _™P_
^ 0.01V '
где А - активность образца, ед./мл, 80 - разбавление биомассы лизирующей смесью; 5сыр - количество биомассы в мг, выделенной из питательной среды, V - объем питательной среды (1.5 мл), 0.01 - 10 мг клеток.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью подпрограммы статистического анализа графической программы Sigma plot 8.0 (Jandel Scientific Corporation, США) и программы Microsoft Excel.
Проводили выбраковку данных, находили новые значения среднего арифметического и стандартного отклонения во вновь установленном доверительном 95%-ном интервале.
Определение достоверности разницы проводили с применением критерия Стьюдента, используя значения среднего арифметического и стандартной ошибки, полученные после выбраковки.
Результаты и их обсуждение
Как видно из рис. 1, добавление в среду 0.1%-ного 2-ПАБСТ приводило к подавлению роста культуры, что согласуется с ранее полученными результатами [10] и служит косвенным подтверждением ингибирования биосинтеза пуринов. При этом продолжительность адаптационной и экспоненциальной фаз возрастала в 2-3 раза, а на кривой накопления внеклеточной эндонуклеазы, вероятно, в ответ на добавление 2-ПАБСТ, появлялся дополнительный пик активности, совпадающий по времени с адаптационной фазой роста культуры, что согласовывалось с ранее опубликованными данными [10]. Кроме этого при добавлении 2-ПАБСТ происходило изменение сроков максимального накопления вне- и внутриклеточного ферментов. В присутствии 2-ПАБСТ максимальный уровень эндонуклеазы в питательной среде и периплазме наблюдали соответственно в конце экспоненциальной и стационарной фаз, тогда как в отсутствие 2-ПАБСТ максимальное накопление внутри- и внеклеточной эндонуклеазы наблюдали в середине стационарной фазы роста культуры. При этом уровень внеклеточной эндонуклеазы, накопленной в присутствии 2-ПАБСТ, был в целом ниже, чем в отсутствие 2-ПАБСТ на протяжении всего срока наблюдения, что совпадет с ранее опубликованными данными [10]. А уровень внутриклеточного фермента, синтезированного в присутствии 2-ПАБСТ, по сравнению с уровнем внутриклеточного фермента, синтезированного в отсутствие 2-ПАБСТ, многократно увеличивался при переходе культуры к стационарному росту. С одной стороны, это свидетельствовало о перераспределении эндонуклеазы под действием 2-ПАБСТ между периплазмой и внешней средой (рис. 2), с другой - позволяло предположить усиление биосинтеза эндонуклеазы в условиях подавления биосинтеза пуринов.
Рис. 1. Динамика роста и активности эндонуклеазы £. тагее^еет в отсутствие 2-ПАБСТ (а) и в его присутствии (б); -Д- - ОД59о, -о- - активность в культуральной жидкости (КЖ), -□- - активность в периплазме (1111)
Сравнительный анализ динамики биосинтеза эндонуклеазы (рис. 3, а), который определяли как сумму нуклеазной активности в питательной среде и периплазме, показал, что в присутствии 2-ПАБСТ биосинтез эндонуклеазы увеличивался почти в 2 раза сразу же в ответ на добавление сульфаниламидного препарата (3-й час), а также многократно возрастал в период стационарного роста культуры (27-36-й час). В целом за 36 ч роста культуры в присутствии 2-ПАБСТ было синтезировано примерно в 1.6 раза больше эндонуклеазы, чем в отсутствие 2-ПАБСТ (рис. 3, б). Таким образом, блокирование биосинтеза пуринов приводило не только к подавлению и изменению характера роста культуры £. marcescens, но и к усилению биосинтеза эндонуклеазы, наиболее выраженному в периоды замедления роста культуры. Полученные результаты свидетельствовали о росте продуктивности культуры по эндонуклеазе под действием 2-ПАБСТ.
Рис. 2. Накопление эндонуклеазы в периплазме и питательной среде за 36 ч роста X тагсасет в отсутствие ( □ ) и в присутствии 2-ПАБСТ ( □ )
Рис. 3. Динамика биосинтеза (а) и биосинтез эндонуклеазы в течение 36 ч в отсутствие и в присутствии 2-ПАБСТ (б)
Результаты оценки продуктивности культуры по эндонуклеазе совпадали с результатами оценки ее биосинтеза. Как видно из рис. 4, а, за исключением периода роста культуры с 9-го по 18-й час, в остальное время продукция нук-леазы культурой, растущей в присутствии 2-ПАБСТ, была выше, чем в его отсутствие. В целом под действием 2-ПАБСТ продуктивность культуры возрастала примерно в 2.7 раза (рис. 4, б).
Рис. 4. Динамика продуктивности (а) и продуктивность бактерий по эндонуклеазе за 36 ч роста (б) в отсутствие и в присутствии 2-ПАБСТ
Таким образом, показано, что в результате подавления биосинтеза пуринов с помощью 2-ПАБСТ происходит качественное и количественное изменение динамики роста культуры S. marcescens W1050, сопряженное с увеличением биосинтеза и продукции эндонуклеазы, а также ее перераспределением между периплазмой и культуральной средой.
Summary
R. Shah Mahmud, M.N. Filimonova. Biosynthesis of Serratia marcescens Endonuclease upon Inhibition of Purine Biosynthesis.
To examine the biosynthesis of Serratia marcescens endonuclease upon the inhibition of purine biosynthesis, the culture was grown in the presence of 0.1% 2-(para-aminobenzenesul-fonamide)-thiazole. During the growth, the biosynthesis of the nuclease was estimated by its activity in the nutrient medium and periplasm. It is shown that the addition of 2-(para-amino-benzenesulfonamide)-thiazole into the nutrient medium leads to a qualitative and quantitative change in the growth dynamics of S. marcescens, an increase in the endonuclease biosynthesis and production, and a decrease and an increase in the parts of extracellular and intracellular enzymes, respectively.
Key words: Serratia marcescens, endonuclease, biosynthesis, 2-(para-aminobenzenesul-fonamide)-thiazole, inhibition of purine biosynthesis.
Литература
1. Филимонова М.Н. Эндонуклеаза Serratia marcescens // Труды объединенной меж-дунар. науч. конф. «Новая геометрия природы», Казань, 25 авг. - 5 сент. 2003 г. -Казань: Изд-во Казан. ун-та, 2003. - С. 67-71.
2. Miller M., Tanner J., Alpaugh M., BenedikM., Krause K. 2.1 A structure of Serratia en-donuclease suggests a mechanism for binding to double-stranded DNA // Nat. Struct. Biol. - 1994. - V. 1, No 7. - P. 461-468.
3. Friendhoff P., Kolmes B., Gimadutdinow O., Wende W., Krause K., Pingoud A. Analysis of the mechanism of the Serratia nuclease using site-directed mutagenesis // Nucleic Acids Res. - 1996. - V. 24, No 14. - P. 2632-2639.
4. Педерсен Ю., Филимонова М., Роепсторф П., Бидерманн К. Изоформы нуклеазы Serratia marcescens природного и рекомбинантного штаммов. Сравнительная характеристика плазменно-десорбционной масс-спектрометрией // Биохимия. - 1995. -T. 60, Вып. 3. - С. 450-461.
5. Филимонова М.Н., Гарусов А.В., Сметанина Т.А., Андреева М.А., Богомольная Л.М., Лещинская И.Б. Изоформы нуклеазы Serratia marcescens. Сравнительный анализ субстратной специфичности // Биохимия. - 1996. - T. 61, Вып. 10. - C. 1800-1806.
6. ФилимоноваМ.Н., Губская В.П., Нуретдинов И.А., БенедикМ.Дж., Богомольная Л.М., Андреева М.А., Лещинская И.Б. Изоформы нуклеазы Serratia marcescens. Роль ионов Mg2+ в механизме гидролиза // Биохимия. - 1997. - T. 62, Вып. 9. - C. 1148-1154.
7. Юсупова Д.В., Соколова Р.Б., Петухова Е.В., Пономарева А.З. Влияние налидиксо-вой кислоты и митомицина С на рост и биосинтез Serratia marcescens // Антибиотики и химиотерапия. - 1993. - Т. 38, № 8-9. - С. 16-21.
8. Юсупова Д.В., Соколова Р.Б., Порфирьева О.В., Пономарева А.З. Индукция синтеза внеклеточной эндонуклеазы Serratia marcescens агентами подавляющими репликацию ДНК // Микробиология. - 1991. - Т. 60, № 2. - С. 279-284.
9. Benedik M.J., Strych U. Serratia marcescens and its extracellular nuclease // FEMS Microbiol. Lett. - 1998. - V. 165, No 1. - P. 1-13.
10. Старшинова Н.В., Филимонова М.Н. Особенности биосинтеза нуклеазы и роста Serratia marcescens в присутствии 2-(пара-аминобензолсульфамидо)-тиазола // Микробиология. - 2005. - Т. 74, № 3. - С. 365-369.
11. Машковский М.Д. Лекарственные средства: Пособие по фармакотерапии для врачей. - Кишинев: Картя молдовеняскэ, 1989. - 528 с.
12. Gerhardt P., Murray R.G.E., Wood W.A., Krieg N. R. (eds.) Methods for general and molecular bacteriology. - Washington, D.C.: Am. Soc. Microbiol., 1994. - XII + 791 p.
13. Богомольная Л.М. Влияние условий культивирования и некоторых экзогенных факторов на биосинтез и секрецию изоформ эндонуклеазы Serratia marcescens: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Казань, 2000. - 20 с.
14. Nestle M., Roberts W.K. An extracellular nuclease from Serratia marcescens. I. Purification and some properties of the enzyme // J. Biol. Chem. - 1969. - V. 244, No 19. - P. 5213-5218.
Поступила в редакцию 28.09.09
Шах Махмуд Райхан - аспирант кафедры микробиологии Казанского (Приволжского) федерального университета. E-mail: raihan.shah@gmail.com
Филимонова Мария Николаевна - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник кафедры микробиологии Казанского (Приволжского) федерального университета. E-mail: maria.filimonova@ksu.ru
