CC BY
65
тттт
ш
Исследование безопасности использования аутогенных, аллогенных и ксеногенных культур клеток-предшественниц из подкожной жировой ткани
B.C. Мелихова 2, И.Н. Сабурина 2, А.А. Орлов1, B.C. Репин 2, Н.И. Новикова 3, А.Н. Мурашов 3
1 Городская клиническая больница № 85, Москва
2 НИИ Общей патологии и патофизиологии РАМН, Москва
3 НИИ Биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.Б. Овчинникова РАН, Пущино
Biosafety Preclinical Trials of Xenogenic, Allogeniec and Autologous Progenitor Cells from Fat Tissue
V.S. Melikhova 2, I.N. Saburina 2, A.A. Orlov1, V.D. Repin 2, N.I. Novikova 3, A.N. Murashev 3
1 Clinical Hospital № 85, Dentistry Clinics Dental Academy
2 Institute of General Pathology and Pathophysiology, Moscow
3 Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS, Puschino
В связи с широким распространением новых методов регенеративной медицины на основе стволовых клеток появилась острая необходимость в стандартизации методик их применения. Начальным этапом внедрения новой технологии [после получения результатов предварительных экспериментов) является ее доклиническое исследование. Нами были проведены эксперименты по определению биобезопасности применения аутогенных, аллогенных и ксеноген-ных культур клеток человека и крыс на модели с использованием стандартных условий проведения доклинических экспериментов, применяемых в современной фармакологической практике.
Ключевые слова: стволовые клетки, доклинические исследования.
Введение
В результате быстрого развития новых методов регенеративной медицины на основе достижений в области стволовых клеток появилась острая необходимость в стандартизации методик их применения. Результаты исследований свойств как эмбриональных, так и стволовых клеток взрослых позволяют клиницистам задумываться об их возможном применении в своей практике. В большинстве случаев, для дальнейшего применения предполагается использовать клетки, подвергшиеся экспансии in vitro. Известно также, что в процессе культивирования клетки могут накапливать генетические аберрации и трансформироваться [1, 2]. Поэтому существует необходимость в тестировании клеток до их предполагаемого применения, а также в разработке параметров тестирования клеток после этапа культивирования.
Начальным этапом внедрения новой технологии (после получения результатов предварительных экспериментов) является ее доклиническое исследование. Первые эксперименты, как правило, проводят на мелких лабораторных животных (грызунах), доклинические исследования эффективности методики подтверждают на крупных млекопитающих (собаки, свиньи).
Как в международной, так и в российской практике нет четких законодательных актов, регулирующих доклинические исследования в области использования клеточных технологий, в частности стволовых клеток. Поэтому большинство клиницистов и исследователей опирается на документы, разработанные для введения в практическое использование новых фармакологических препаратов и адаптируют эти нормативные акты к работе со стволовыми клетками.
На территории РФ основным документом, регулирующим доклинические исследования новых препаратов является
Due to wide spread of new methods of regenerative medicine on basis of stem cells it has become increasingly necessary to establish standards of techniques using them. Preclinical trial of a new technology after receiving preliminary experiment results is a primary stage of its adoption. We carried out the experiments to assess biosafety of autogenous, allergenic and xenogeneic cultures of human and rat cells in models under standard preclinical experiments conditions used in a presentday pharmacological practice.
Key words: stem cells, preclinical trials.
«Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» [1], а также Федеральный Закон «О лекарственных средствах» [2]. Американским аналогом данных документов можно считать список рекомендаций «Good Laboratory Practice for Nonclinical Laboratory Studies».
Основаниями для регистрации нового лекарственного средства являются его эффективность, безопасность и качество. Доклинические исследования безопасности лекарственных средств включают следующие мероприятия.
1. Изучение общетоксического действия фармакологических веществ (в нашем случае - клеток). Целями этого исследования являются установление характера и выраженности повреждающего действия на организм экспериментальных животных трансплантируемых клеток и оценка их безопасности.
2. Оценка аллергизирующих свойств фармакологических веществ (способность того или иного вещества вызывать при введении в организм состояние повышенной чувствительности (гиперсенсибилизация).
3. Оценка иммунотоксического действия фармакологических средств.
4. Изучение репродуктивной токсичности фармакологических веществ.
5. Оценка мутагенных свойств фармакологических веществ.
6. Оценка канцерогенных свойств фармакологических веществ и лекарственных средств.
7. Оценка безопасности применения лекарственных средств в клинике на основании результатов доклинических токсикологических экспериментов.
I I I I I
m
Результаты доклинических исследований и экспертизы вместе с проектом протокола клинических исследований и проектом инструкции предоставляются в Росздравнадзор для решения вопроса о возможности проведения клинических исследований. Проведение доклинических токсикологических исследований фармакологических веществ в соответствии с правилами GLP гарантирует получение достоверных и воспроизводимых результатов.
Целью нашего исследования было выявление безопасности использования аутогенных, аллогенных и культур кле-ток-предшественниц из подкожной жировой ткани крыс.
Объектом исследования являлись культуры клеток, выделенных из подкожной жировой ткани человека и самцов крыс линии Sprague Dowley (SD). В существующий порядок доклинических исследований были введены некоторые изменения. Нами были выбраны следующие параметры оценки биобезопасности используемого объекта:
- пирогенное и местно-раздражающее действие ксено-генной культуры из подкожной жировой ткани человека при однократном подкожном введении крысам SD;
- пирогенное и местно-раздражающее действие ауто-и аллогенных (крысиных) культур клеток при однократном подкожном введении крысам SD.
Материал и методы
В исследовании использовали 12 взрослых самцов крыс SD. Животные получены из НПП «Питомник лабораторных животных» РАН, г. Пущино. Животные были разведены специально для данного эксперимента и ранее не участвовали в исследованиях. Поставщик животных предоставил данные последнего контроля здоровья животных, подтверждающие их SPF-статус (животные, свободные от патогенов). «Сертификат здоровья животных» приложен в первичные данные по исследованию. Прибывшие животные до начала исследования были помещены в отдельную комнату содержания на период адаптации при групповом содержании в клетках. Во время этого периода у животных контролировали проявление признаков отклонения в состоянии здоровья. Перед формированием опытных групп проводили клинический осмотр. К началу введения клеток возраст животных составлял 8-9 нед. Крыс содержали по 1 особи в клетке, каждому животному был присвоен индивидуальный номер в соответствии с номером группы. Основные правила содержания и ухода соответствовали нормативам, данным в руководстве Guide for Care and Use of Laboratory Animals. ILAR publication, 1996, National Academy Press.
Все процедуры по рутинному уходу за животными выполняли в соответствии с правилами лаборатории. Записи рутинных процедур вели в «Листе рутинных процедур комнаты содержания животных», которые приложены в соответствующую документацию лаборатории.
Стандартный экструдированный корм для содержания крыс и мышей Агро-1 (Ассортиментагро, Россия) давали ad libitum при периодическом анализе образцов корма на микробиологическую контаминацию. Результаты анализов, а также данные о составе и качестве корма от производителя хранятся в документации лаборатории. Контаминации корма, способной повлиять на результаты исследования, не выявлено. Животные получали воду, подготовленную в системе Milli-RO (Millipore) ad libitum.
Животных содержали в контролируемых условиях окружающей среды (температура -18-26°C и 30-70% -относительная влажность, 12 часовой цикл освещения и, по крайней мере, 10-ти кратная смена объема воздуха комнаты в час). Показатели температуры и влажности постоянно контролировали в каждой экспериментальной комнате и вручную документировали раз в день. На 3 и 7 сут. после
введения клеток животных выводили из эксперимента в С02-камере.
Для выделения клеток стромальной фракции у животных брали фрагменты подкожного жира из области живота и выделяли по модифицированному протоколу [3]. Для этого, под общей анестезией рассекали кожу, отсепаровывали гиподерму от мышц брюшной стенки, отрезали фрагмент подкожного жира и помещали его в среду для культивирования клеток, кожу зашивали. Полученный фрагмент ткани в стерильных условиях измельчали, получив мелкие фрагменты проводили их инкубацию в растворе колланеназы 1-го типа (0,07%) и диспазы (0,025%) в течение 25-30 мин. После окончания инкубации добавляли полную среду культивирования и центрифугировали в течение 5 мин. при 1000 об/мин. Затем, слив супернатант, полученный осадок ресуспендировали в полной среде и пропускали через нейлоновый фильтр. Полученную суспензию клеток помещали на чашки Петри и культивировали в течении 10 сут. Аналогично проводили выделение клеток человека. Смену среды проводили каждые 3 сут., пассирование осуществляли на 4-е и 8-е сут. после выделения. Полная среда культивирования имела следующий состав: DMEM/F12 с глутамином, 1% пенициллин-стрептомицин, 10% FCS.
В дальнейшем (через 10 сут. культивирования) животные-реципиенты были разделены на 3 экспериментальные группы: №1 - клетки трансплантировали подкожно в меж-лопаточную область, инъекцию ксеногенных клеточных культур осуществляли в двух концентрациях. Перед введением культуры клеток и физраствора у животных измеряли температуру тела в течение 5 мин. После введения культуры клеток и физраствора температура тела измеряли по схеме: в течение 60 мин. непрерывно, далее через каждые 30 мин. в течение трех часов (через 90, 120, 150, 180 мин.). После регистрации температуры тепа животных помещали в индивидуальные клетки.
Далее, через 3 и 7 сут. проводили исследование пиро-генного эффекта и гистологическое исследование кожи в области пересадки. Образцы тканей фиксировали в 4% нейтральном растворе формалина. Образцы были обезвожены, залиты в парафиновые блоки. Изготавливали гистологические срезы толщиной 5-7 мкм. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, по Ван-Гизону.
Объем исследований первого этапа представлен в таблице 1.
Таблица 1. Объем исследований первого этапа эксперимента
№ группы Кол-во животных № животных Тестируемый препарат Кол-во клеток Объем (мл)
1 4 1-4 культура клеток человека 10х106 2
2 4 5-8 культура клеток человека 106 2
3 4 2 -1 физраствор 0 2
Целью второго этапа исследования было выявление безопасности использования аутогенных и аллогенных культур клеток-предшественниц из подкожной жировой ткани крыс.
Всем животным вводили ЮхЮ6 клеток в 2 мл физраствора. Контрольным животным вводили 2 мл физраствора. Гистологическое исследование проводили на 7 сут.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 3, 2008
■ И I II II
Оригинальные исследования
Ш
При введении аллогенной культуры клеток использовали клетки от другого животного той же линии. Введение осуществляли шести животным подкожно в межлопаточную область. Всем животным вводили 10х106 аллогенных клеток в 2 мл физраствора. Контрольным животным вводили
2 мл физраствора. Гистологическое исследование так же проводили на 3 и 7 сут.
Объем исследований второго этапа представлен в таблице 2.
Таблица 2. Объем исследований второго этапа эксперимента
№ животного № культуры Происхождение клеток Сроки (сут.)
1-З 1-З Ауто 7
4, 5 1 Алло З, 7
6, 7 2 Алло З, 7
8, 9 З Алло З, 7
Результаты и обсуждение
Культуры, полученные вышеуказанным способом гете-рогенны и гетероморфны. В них присутствуют клетки сосудистого эндотелия, фибробласты, перициты, гладкомышечные клетки, периваскулярные клетки. Фенотипически эта фракция характеризуется экспрессией CD146, CD105, CD31 и UEA-1, а также секрецией ангиогенных и анти-апоптоти-ческих факторов [4, 5].
Результаты исследования пирогенного эффекта после введения клеток всех трех типов (аутогенных, аллогенных и ксеногенных) позволили сделать вывод о том, что введение культуры клеток в количестве 106 и 10x106, не вызвало изменения температуры тела относительно нормальной физиологической температуры тела животных. Средние результаты термометрии представлены в таблице 3.
При визуальном осмотре кожного покрова в месте введения - межлопаточной области как на 3 и на 7 сут. после введения культуры клеток, ни у одного животного не было отмечено признаков местно раздражающего действия. Состояние кожных покровов соответствовало обычному виду.
У животных после введения 10х106 клеток на 3 сут. отмечалась под кожей небольшая папула без выраженных признаков воспаления. На 7 сут. у всех животных, в том числе получивших трансплантацию 106 клеток, признаков отклонения от нормы - воспалительной реакции - не выявлено.
При гистологическом исследовании материала, полученного от животных после аутотрансплантации выраженных воспалительных и иммунных реакций не обнаружено (рис. 1). Причем, данное положение было справедливо вне зависимости от количества пересаженных клеток и срока наблюдения.
Во всех случаях трансплантации аллогенного и ксено-генного клеточного материала в гиподерме обнаружены большие инфильтраты, преимущественно состоящие из лимфоцитов (рис. 2, 3). В инфильтратах отмечены фрагменты разрушенных клеток, а также единичные крупные веретеновидные клетки которые, предположительно, могли являться выжившими пересаженными клетками. Кроме того, имелись единичные нейтрофилы и эозинофилы, макрофаги. Инфильтрат был изолирован от окружающих тканей тонкостенной незрелой соединительнотканной капсулой. В прилегающей к инфильтрату гиподерме отмечено умеренное кровенаполнение микроциркуляторного русла.
Полученные результаты позволяют прийти к выводу, что введение культуры человеческих клеток в количестве 106 и 10х106 вызывает реакцию воспалительных и иммунных клеток, которая особенно выражена на 7-е сут. наблюдений.
Заключение
В соответствии с полученными нами данными, следует сделать вывод о том, что на протяжении всего исследования клинические признаки отклонения состояния здоровья животных от нормы не наблюдалось. В группе аллогенной и ксеногенной трансплантации были выявлены выраженные местные иммунные реакции в виде формирования выраженных лимфоцитарных инфильтратов. Вероятно, пересаженные клетки подвергаются неспецифическому иммунному ответу со стороны организма реципиента, что ведет к их гибели и элиминации уже на 7 сут. Однако, при этом, по крайней мере, при однократном введении клеток не наблюдается пироген-ного и местно-раздражающего действия.
При применении аутогенных клеточных культур также не возникает пирогенного и местно-раздражающего эффекта, и не наблюдаются местноаллергические иммунные процессы на всех сроках наблюдения.
Рис 1.
Гиподерма в месте трансплантации аутогенных клеток. 7 сут.
Окраска: гематоксилин и эозин. х200
Рис 2.
Гиподерма в месте трансплантации аллогенных клеток. 7 сут. Окраска: гематоксилин и эозин. х100
Рис 3.
Гиподерма в месте введения ксеногенных клеток. 7 сут.: А - при введении 10 клеток;
Б - при введении 10x10е клеток.
Окраска: гематоксилин и эозин. А - х200; Б - х100
тттт
СЖ1
ш
ЛИТЕРАТУРА:
1. Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. 2005; М., Медицина: 832.
2. Федеральный Закон «О лекарственных средствах». Принят Государственной Думой 5 июня 1998 г.
3. Astori G., Vignati F., Bardelli S. et al. «In vitro» and multicolor phenotypic characterization of cell subpopulations identified in fresh human adipose tissue stromal vascular fraction and in the derived mesenchymal stem cells. J. Transl.
Med. 2007; 5: 55.
4. Zuk P.A., Zhu M., Ashjian P. et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell. 2002; 13(12): 4279-95.
5. Bernardo M.E., Zaffaroni N., Novara F. et al. Human bone marrow derived mesenchymal stem cells do not undergo transformation after long-term in vitro culture and do not exhibit telomere maintenance mechanisms. Cancer Res. 2007; 67(19): 9142-9.
Поступила 24.06.2008
А
