CC BY
219
АСТРАХАНСКИЙ ВЕСТНИК ЭКОЛОГИЧЕСКОГО ОБРАЗОВАНИЯ
№ 3 (25) 2013. с. 124-138. Научные сообщения
УДК 579.871.08, 577.112.385.4.08
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ ДЕЙТЕРИЯ НА КЛЕТКИ ПРОКАРИОТ И
ЭУКАРИОТ
Игнат Игнатов, доктор наук Европейской академии естественных наук (Г анновер, ФРГ), профессор, директор Научно-исследовательского Центра медицинской биофизики (НИЦМБ), София, Болгария mbioph@dir.bg.
Олег Викторович Мосин, кандидат химических наук, научн. сотр. Московский государственный университет прикладной биотехнологии mosin-oleg@yandex.ru.
дейтерий, тяжелая вода, изотопные эффекты, адаптация, бактерии, микроводоросли.
Изучена адаптация к дейтерию (D) клеток различных таксономических групп прокариотических и эукариотических микроорганизмов, реализующих метилотрофные, хемогетеротрофные, фотоорганогетеротрофные и фотосинтетические способы ассимиляции углеродных субстратов при росте на средах с тяжёлой водой (D20). Разработан метод ступенчатой адаптации клеток к D20, заключающийся в их рассеве на чашках Петри с твёрдыми (2 %-ный агар) питательными средами при ступенчатом увеличении градиента концентрации D20 (от 0 до 98 % D2O) и последующей селекции устойчивых к D2O клеток. В результате этой техники на максимально дейтерированной среде с 98 % D20 получены адаптированные к D20 клетки, биологический материал которых вместо атомов водорода содержит атомы дейтерия с уровнем дейтерированности молекул 92-97,5 ат. % D.
STUDYING OF ADAPTATION TO DEUTERIUM PROKARYOTIC AND
EUKARUOTIC CELLS
I. Ignatov
O.V. Mosin
deuterium, heavy water, adaptation, isotopic effects, bacteria, microalgae.
Adaptation to deuterium (D) of cells of various taxonomic groups of prokaryotic and eucaryotic microorganisms realizing methylotrophical, chemoheterotrophical, photo organotrophical, and photosynthetic ways of assimilation of carbon substrates (methylotrophic bacteria, halobacteria, green microalgae) are investigated at growth on media with heavy water (D20). The method of step by step adaptation technique of cells to D20 is developed, consisting in plating of ctlls on 2 % agarose nutrient media containing increasing gradient of concentration of D20 (from 0 up to 98 % D2O) and the subsequent selection of stable to D2O cells. Obtained from growth media with a low gradient of D20 concentration, cells were further transferred on growth media with higher gradient of D2O concentration, up to 98 % D20. In the result of that technique it were obtained adapted to maximum concentration of D2O cells, biological material of which instead of hydrogen contained deuterium with levels of enrichment 92-97,5 at.% D. Usage of cells adapted to D20 and deuterated natural compounds (protein, amino acids, nucleosides, pigments, carboxydrates, fatty acids, extracted from them, can find further application in biophysical researches and biomedical technologies.
Введение
Одним из интереснейших биологических феноменов является способность некоторых микроорганизмов расти в питательных средах с тяжёлой водой (D20) [1]. D20 обладает высоким экологическим потенциалом вследствие отсутствия радиоактивности, что способствует ее использованию в качестве изотопного индикатора в химии, биологии и медицине [2]. В природных водах соотношение D/H составляет 1 : 5500 (в предположении, что весь дейтерий находится в форме D2O) [3]. В действительности дейтерий присутствует в форме D2O лишь в концентрированных растворах. При небольших концентрациях в воде он присутствует в форме “полутяжелой” воды (HDO), поскольку в смесях D2O-H2O с большой скоростью происходят реакции диссоциации и изотопного (H-D) обмена, приводящие к образованию HDO.
Изотопные эффекты, опосредованные разницей нуклеарных масс дейтерия и протия пары H/D могут быть достаточно большими [4]. Химические реакции в D2O протекают с медленной скоростью, чем в H2O, D2O слабее ионизирована, чем H2O, константа диссоциации D2O меньше таковой для H2O, растворимость органических и неорганических веществ в D2O, как правило, ниже, чем в H2O, водородные связи с участием дейтерия несколько прочнее обычных, подвижность ионов D3O+ на 28,5 % ниже H3O+, а OD" - на 39,8 % ниже ОН" [5]. Для других ионов различие подвижностей в H2O и D2O составляет около 18 % [6]. Константы диссоциации (Kd) слабых кислот и оснований снижаются в D2O по сравнению с H2O, а растворимость и растворяющая способность D2O для многих неорганических и органических веществ, как правило, ниже, чем у Н 2O, хотя известны и обратные факты.
Систематическое изучение воздействия D20 на клетки животных, растений и микроорганизмов в нашей стране начато сравнительно недавно [7]. Эксперименты показали, что D2O действует негативно на жизненные функции организмов, замедляет клеточный метаболизм и ингибирует митоз в стадии профазы; это происходит даже при использовании обычной природной воды с повышенным содержанием D2O или HDO [8]. Клетки животных способны выдерживать до 30 % D2O, растений - 50 % D2O, микроводорослей - 70 % D2O, а клетки простейших и микроорганизмов - 95 % D2O [9].
С развитием новых биотехнологических подходов появилась возможность использовать в качестве биомоделей для научных целей и прикладных исследований, в т.ч. для аправленного синтеза D-меченных природных соединений, адаптированные к D2O клетки микроорганизмов и микроводорослей. Традиционным методом при этом является выращивание микроорганизмов в средах, содержащих максимальные концентрации D2O и дейтерированных субстратов, например, ^]метанол [10]. В процессе роста клеток в D2O в них синтезируются молекулы биологически важных природных соединений (ДНК, белки, аминокислоты, нуклеозиды, пигменты, углеводы, жирные кислоты), атомы водорода при углеродных скелетах которых полностью замещены на дейтерий. Их выделяют из дейтерированной биомассы, полученной на средах с высокими концентрациями D2O и дейтерированными субстратами, используя комбинацию физико -химических методов выделения - гидролиз, осаждение и экстракцию органическими растворителями и хроматографическую очистку методом колоночной хроматографии с применением различных сорбентов. Такие дейтерированные молекулы претерпевают структурно-адаптационные модификации, необходимые для нормального функционирования клетки в D2O.
Биологическая адаптация к D2O интересна не только с научной точки зрения, но она также позволяет получать уникальный дейтерированный биологический материал для диагностических биомедицинских целей, а также решения задач молекулярной
организации клетки методом ЯМР-спектроскопии [11]. Тенденции к применению дейтерия в качестве изотопной метки обусловлены отсутствием радиационной опасности и возможностью определения локализации дейтерия в молекуле методами высокого разрешения: спектроскопией ЯМР [12], ИК -спектроскопией [13] и масс-спектрометрией [14]. Это позволило за последние годы существенно повысить эффективность проведения многочисленных биомедицинских исследований с D2O и дейтерированными природными соединениями de novo, а также изучать структуру и механизм их действия на молекулярном уровне.
Данная работа является продолжением наших исследований, связанных с принципиальной возможностью практического использования различных клеток бактерий, микроводорослей и растений, для синтеза D-меченных природных соединений в условиях максимально дейтерированных сред с D2O. Целью работы являлось изучение изотопных эффектов D2O в клетках различных таксономических групп микроорганизмов и микроводорослей, осуществляющих метилотрофный, хемогетеротрофный, фотоорганогетеротрофный и фотосинтетический пути ассимиляции углеродных
субстратов.
Экспериментальная часть Объекты исследования и методы
Объектами исследования являлись две хемогетеротрофные грамположительные бактерии Bacillus subtilis и Brevibacterium methylicum, последняя способна к метилотрофии, фотоорганогетеротрофная галобактерия Halobacterium halobium и фотосинтезирующая одноклеточная зеленая микроводоросль Chlorella vulgaris, полученные из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов ГосНИИГенетика.
1. Brevibacterium methylicum ВКПМ В 5652, лейцинзависимый штамм грамположительных факультативных метилотрофных бактерий, ассимилирующий метанол по РМФ-циклу фиксации углерода.
2. Bacillus subtilis В-3157, полиауксотрофный по гистидину, тирозину, аденину и урацилу штамм грамположительных хемогетеротрофных бактерий, релизующий гексозо -6-моно-фосфатный (ГМФ) путь ассимиляции углеводов.
3. Halobacterium halobium ЕТ 1001, фотоорганогетеротрофный каротиноидсодержащий штамм экстремальных галобактерий, синтезирующий трансмембранный белок бактериородопсин.
4. Chlorella vulgaris В 8765, зеленая одноклеточная фотосинтезирующая микроводоросль.
Для приготовления питательных сред применяли D2O (99,8 ат.% D), DC1 (95,5 ат.% D) и [0]метанол (97,5 ат.% D), полученные из Российского научно-исследовательского центра “Изотоп” (Санкт-Петербург, РФ). Неорганические соли и D, L- глюкозу (Reanal, Венгрия) предварительно перекристаллизовывали в D20, D2O дистиллировали в присутствии KMnO4 с последующим контролем изотопной чистоты 1Н ЯМР-спектроскопией на приборе Brucker WM -250 (“Bruker Daltonics”, ФРГ) (рабочая частота 70 МГц, внутренний стандарт Me4Si).
Для выращивания использовали следующие питательные среды (количества компонентов приведены в г/л):
1. Минимальная среда М9 для выращивания факультативных метилотрофных бактерий B. methylicum, на основе ступенчато-увеличивающихся концентраций D2O (от 0; 24,5; 49,0; 73,5 до 98 об.%* D2O) и 2% метанолом/[0]метанолом (г/л): KH2PO4 - 3; Na2HPO4 - 6; NaCl - 0,5; NH4CI - 1.
Здесь и далее использованы проценты по объему, об.%
126
2. Среда ГС1 для выращивания хемогетеротрофной бактерии B. subtilis (на основе 99,8% D20): глюкоза 120; гидролизат дейтеро-биомассы B. methylicum - 25; NH4NO3 - 30; MgSO4 7H2O - 20; CaCO3 - 20.
3. Среда ГС2 для выращивания фотоорганогетеротрофной галобактерии H. halobium (на основе 99,8% D20): NaCl - 250; MgS04 7H20 - 20; KC1 - 2; CaCl2 6H20 - 0,065; цитрат натрия - 0,5; гидролизат дейтеро-биомассы В. methylicum - 20, витамины (биотин - 1 10’4; фолиевая кислота - 1,5 10" ; витамин Bi2 - 210" ).
4. Среда Тамия для выращивания фотосинтезирующей зеленой микроводоросли C. vulgaris (на основе 99,8% D20): KN03 - 5,0; MgS047H20 - 2,5; КН2Р04 - 1,25; FeS04 -0,003; микроэлементы (MnS042H20 - 310"4; СаС126Н20 - 0,065; ZnS047H20 - 410"5; CuS045H20 - 5 10"5, СоС126Н20 - 5 10"6).
Стартовым материалом для выращивания хемогетеротрофных бактерий и галобактерий являлась дейтеро-биомасса факультативных метилотрофных бактерий B. methylicum, полученная в условиях многоступенчатой адаптации на твердых (2 %-й агар) средах M9 с D2O. Полученную дейтеро-биомассу B. methylicum (выход 100 г по влажному весу с 1 л. среды) автоклавировали в 0,5 н. НС1 (в D2O) (0,8 атм, 30 мин), нейтрализовали 0,1 н. КОН (в D2O) (рН = 7,0) и использовали в качестве источника дейтерированных ростовых субстратов для адаптации и выращивания хемоорганогетеротрофных бактерий B. sublilis и галобактерий H. halobium.
Выращивание грамположительных бактерий B. subtilis проводили на ГС1 среде при 34 0С в колбах Эрленмейера вместимостью 250 мл с наполнением средой до 50 мл в условиях интенсивной аэрации в орбитальном шейкере 380-S (100 об/мин) (“Biorad”, Польша), используя в качестве источников дейтерированных субстратов D2O и гидролизат дейтеро-биомассы B. methylicum, полученной на максимально дейтерированной среде. Галобактерии H. halobium выращивали в аналогичных условиях на ГС2-среде при 37 0С при освещении лампами дневного света ЛДС-40-2 (40 Вт) (ООО “Альфа-Электро”, Россия). Выращивание микроводоросли C. vulgaris проводили на синтетической среде Тамия при 32 0С в фотореакторе с барботажем СО2. Рост оценивали по способности к образованию отдельных колоний на поверхности твёрдых агаризованных сред с D2O, а также по величине ОП суспензии клеток, измеренной на спектрофотометре Beckman -DU6 (“Beckman Coulter”, США) при X = 620 нм. После 6-7 суток культивирования клетки отделяли центрифугированием (10000 об/мин, 20 мин) на центрифуге Т -24 (“Heracules”, ФРГ). Биомассу промывали D2O и экстрагировали смесью органических растворителей хлороформ-метанол-ацетон = 2:1:1, об.% для отделения липидов и пигментов. Полученный осадок высушивали до постоянного веса (10-12 мг) и использовали в качестве фракции суммарных белков биомассы, а жидкий экстракт - в качестве липидной фракции. Из культуральных жидкостей (КЖ) выделяли секретируемые дейтерированные аминокислоты и рибонуклеозиды. ^]рибоксин выделяли из КЖ B. subtilis адсорбцией активированным углем (12 ч., 4 °С), экстракцией 0,3 М 1МН4-формиатным буфером (pH = 8,9) и перекристаллизацией в 80 %-ном этаноле ([а]в20= +1,61°, выход 3,1 г/л (80 %). БР выделяли из фракции пурпурных мембран H. halobium по методу Остерхельта, усовершенствованному авторами [15].
Гидролиз дейтерированных белков биомассы проводили при 110 0С в течение 24 ч в запаянных стеклянных ампулах в 50 -ти кратном избытке 6 н DCl (в D2O), используя 10 мг сухой дейтеро-биомассы. Реакционную массу суспендировали в горячей D2O, фильтровали. Гидролизат упаривали в роторном испарителе РВО -64 (Венгрия) при 60 0С. Остатки DCl удаляли в эксикаторе путем выдерживания над твердым NaOH. Для проведения гидролиза внутриклеточных углеводов 50 мг сухой делипидизованной дейтеро-биомассы помещали в круглодонную колбу вмесимостью 250 мл, добавляли 50 мл D2O и 1,6 мл 25 %-ной ^SO4, и кипятили с обратным водяным холодильником в течение 90 мин. По охлаждении реакционную смесь суспендировали в 50 мл D2O и нейтрализовали 2 н. раствором Ba^^2 (в D2O) до рН = 7,0. Выпавший осадок BaSO4
127
отделяли центрифугированием (15000 об/мин, 5 мин), супернатант декантировали и упаривали в роторном испарителе при 60 0С.
Аминокислотный анализ белковых гидролизатов проводили на приборе Biotronic LC 5001 (ФРГ); 230 х 3,2 мм; рабочее давление: 50-60 атм; скорость подачи Na-цитратного буфера: 18,5; нингидрина: 9,25 мл/ч; детекция при X = 570 нм и X = 440 нм (для пролина).
Анализ углеводов осуществляли на жидкостном хроматографе Knauer (ФРГ), снабженным насосом Gilson (ФРГ) и рефрактометром Waters К 401 (ФРГ); неподвижная фаза: Separon NH2, 10 мкм; подвижная фаза: C^CN-K^, (75 : 25 об.%); скорость подачи: 0,6 мл/мин.
Жирные кислоты анализировали на хроматографе Beckman Gold System (США), снабжённым насосом Model 166 и детектором Model 126 (США); неподвижная фаза: Ultrasphere ODS 5 мкм; 4,6 х 250 мм; подвижная фаза: линейный градиент 5 мМ КН2РО4-CH3CN; 100 % в течении 50 мин; скорость подачи: 0,5 мл/мин; детекция при X = 210 нм.
Масс-спекты FAB регистрировали на импульсном масс-спектрометре VG-70 SEQ (“Fisons VG Analitical”, США) с цезиевым источником Cs + на глицериновой матрице с ускоряющим напряжением 5 кВ и ионным током 0,6-0,8 мА. Уровни включения дейтерия в молекулы аминокислот белковых гидролизатов определяли методом масс -спектрометрии ЭУ в виде метиловых эфиров ^(диметиламино)нафтален-1-сульфонил хлоридных (дансильных) производных аминокислот на приборе MB -80A (“Hitachi”, Япония) при ионизирующем напряжении 70 эВ и температуре катодного источника 180200 0С по ранее разработанной нами методике [16]. Расчет уровней дейтерированности молекул проводили по соотношению вкладов пиков молекулярных ионов [ M]+ дейтерированных соединений, выделенных с D^-средах и контроля, полученного в Н2О-среде.
Результаты и обсуждение
При воздействии воды на биологические объекты их реакция изменяется в зависимости от изотопного состава воды и величины изотопных эффектов, определяемых разницей констант скоростей химических реакций k^/kd в Н2О и D2O. Самые большие изотопные эффекты с соотношением kh/kd = 6-8 наблюдаются в D^ для C-H/C-D, N-H/N-D и O-H/O-D связей. Изотопные эффекты оказывают влияние не только на физико -химические свойства, но и на биологические свойства D2O. Эксперименты с D2O показали (рис. 1), что водоросли и микроводоросли способны расти на 70 и 75 % D2O, растения на 50 % D2O, дрожжи на 85 % D2O, метилотрофные бактерии - 75 % D2O,
хемогетеротрофные бактерии - 82 % D2O, а археобактерии - 95 % D2O, а клетки млекопитающих - 30 % D2O.
Рис. 1. Выживаемость клеток изученных микроорганизмов в воде с различными содержаниями дейтерия (по данным экспериментальных исследований авторов)
В ходе эксперимента были получены адаптированные к максимальным концентрациям D2O клетки, относящихся к различным таксономическим группам микроорганизмов, реализующих метилотрофный, хемогетеротрофный,
фотоорганогетеротрофный и фотосинтетический пути ассимиляции углеродных субстратов - факультативные метилотрофные бактерии B. methylicum, хемогетеротрофные бактерии B. subtilis, галобактерии H. halobium и микроводоросли C. vulgaris.
Выбор ассимилирующих метанол факультативных метилотрофных бактерий B. methylicum был связан с разработкой новых биотехнологий получения метилотрофной дейтеро-биомассы на [0]метаноле и D2O и ее дальнейшего использования как источника дейтерированных ростовых субстратов для выращивания других штаммов -продуцентов.
Выбор фотоорганогетеротрофных галобактерий H. halobium был обусловлен перспективами дальнейшего выделения ретинальсодержащего трансмембранного белка бактериородопсина (БР) - хромопротеида из 248 аминокислотных остатков, содержащего в качестве хромоформной группы эквимолекулярную смесь 13 -цис- и полностью 13-транс-ретинольного С20-каротиноида - аналога витамина А, связанного с остатком Lys-216 и определяющего пурпурно-красный цвет галобактерий [17]. БР выполняет в клетках галобактерий роль АТФ-зависимой транслоказы, создающей электрохимический градиент протонов Н+ на поверхности клеточной мембраны, энергия которого используется клеткой для синтеза АТФ в анаэробном фотосинтетическом фосфорилировании.
Использование хемогетеротрофных бактерий B. subtilis определялось необходимостью препаративного выделения продуцируемого этой бактерией дейтерированного рибонуклеозида - рибоксина (уровень дейтерированности 62,5 ат.% D) для медицинской диагностики, а использование фотосинтезирующей микроводоросли C. vulgaris было связано с исследованием биосинтеза в D2O дейтерированных
129
хлорофилловых и каротиноидных пигментов (уровень дейтерированности 95-97 ат.% Б) для их последующего использования для реконструкции искусственных мембран.
Для адаптации клеток к Б2О использовали ступенчато увеличивающийся градиент концентрации Б2О, поскольку предполагалось, что постепенное привыкание организма к дейтерию будет оказывать благоприятный эффект на ростовые и физиологические параметры. Стратегия адаптации к Б20 показана в табл. 1 на примере метилотрофных бактерий В. т^куНеит, дейтеро-биомасса которых использовалась в дальнейших экспериментах в качестве дейтерированных ростовых субстратов для выращивания хемогетеротрофных и фотоорганогетеротрофных бактерий.
Таблица 1.
Изотопный состав ростовых сред и характеристики роста метилотрофных бактерий В. шеШуИсиш в
процессе адаптации к Б20
Номер опыта Компоненты среды, об.% Лаг-период, ч Выход микробной биомассы, % от контроля Время генерации, ч
Н20 Б20 метанол [Б]метанол
1 98,0 0 2 0 20 100 2,2
2 98,0 0 0 2 30 92,3 2,4
3 73,5 24,5 2 0 32 90,6 2,4
4 73,5 24,5 0 2 34 85,9 2,6
5 49,0 49,0 2 0 40 70,1 3,0
6 49,0 49,0 0 2 44 60,5 3,2
7 24,5 73,5 2 0 45 56,4 3,5
8 24,5 73,5 0 2 49 47,2 3,8
9 0 98,0 2 0 58 32,9 4,4
10 0 98,0 0 2 60 30,1 4,9
10’ 0 98,0 0 2 40 87,0 2,8
Примечание: Данные опытов 1-10 приведены при выращивании бактерий в минимальных средах М9, содержащих 2 % метанол/[В]-метанол и указанные концентрации Б2О. Данные опыта 10’ приведены для адаптированных к максимальному содержанию дейтерия в среде бактерий при выращивании в среде с максимальными концентрациями Б2О. В качестве контроля использовали опыт 1, где применяли обычную воду и метанол.
Стратегия адаптации к Б20 заключалась в рассеве исходных клеток микроорганизмов на чашках Петри с твёрдыми агаризованными средами с 2% -м агаром со ступенчатом увеличении концентрации Б20 в них (от 0; 24,5; 49,0; 73,5 до 98% Б20) и последующей селекции устойчивых к Б20 клеток. Выросшие на средах с низким градиентом концентрации Б2О клетки переносили на среды с большим градиентом концентрации, вплоть до 98% Б2О. На конечном этапе на максимально дейтерированной среде с 98%-ной Б2О были выделены отдельные клеточные колонии, представляющие собой потомство одной единственной клетки, устойчивой к действию Б2О. Затем колонии переносили в жидкие питательные среды такого же состава, приготовленные на основе Б20 и культивировали в течение 5 сут при 34 0С. Уровень выживаемости клеток на полностью дейтерированной среде составил не более 40-50%. За ходом адаптации наблюдали по изменениям продолжительности лаг-периода, времени клеточной генерации и выходов микробной биомассы, а также по способности к образованию отдельных колоний на поверхности твёрдых агаризованных сред с Б20 и подсчету клеток.
Все адаптированные к Б20 клетки сохранили способность размножаться в Б20-средах с сохранением биосинтетических способностей к синтезу аминокислот, белков и нуклеозидов. Общей особенностью адаптированных к Б2О клеток микроорганизмов при росте в Б20-средах было увеличение лаг-периода и времени клеточной генерации при уменьшении выходов микробной биомассы. Значения этих параметров коррелировали с
уровнями содержания D20 в ростовых средах, с фиксированием самых низких значений в максимально дейтерированной среде (опыты 9, 10, табл. 1). В отличие от адаптированных к D2O микроорганизмов, рост исходных микроорганизмов в максимально дейтерированных средах с D2O ингибировался дейтерием. Выходы биомассы в максимально дейтерированных средах составили 85 -90% для разных таксономических групп микроорганизмов. Адаптированные микроорганизмы имели несколько сниженные уровни накопления микробной биомассы и увеличенные времена клеточной генерации при росте в D^-средах.
Полученный результат в опытах по адаптации метилотрофных бактерий В. methylicum к D2O позволил использовать гидролизаты метилотрофной дейтеро-биомассы, полученной в процессе многоступенчатой адаптации к D2O, в качестве дейтерированных ростовых субстратов для выращивания хемогетеротрофных бактерий В. subtillis и фотоорганогетеротрофных галобактерий H. halobuum. Усваиваемость биомассы метилотрофов клетками простейших и эукариот составляет 85-99%, а производительность метилотрофов, измеренная по уровню конверсии метилового спирта, достигает 50-60% [18]. При разработке питательных сред на основе дейтеро -биомассы метилотрофных бактерий B. methylicum учитывалось, что метилотрофные бактерии при росте на метаноле способны синтезировать большое количество полноценных белков (до 55% от веса сухого вещества), 15-17% полисахаридов, 10-12% липидов (в основном, фосфолипидов) и 18% зольных веществ [19]. Причем эта способность сохраняется при росте на средах, содержащих D20 и [0]метанол. Чтобы обеспечить высокие выходы этих соединений и минимизировать реакции обратного изотопного (Н-D) обмена в аминокислотных остатках молекул белков, гидролиз дейтеро -биомассы проводили автоклавированием в 0,5 н DCl (в D2O).
Учитывая способы ассимиляции углеродных субстратов, адаптацию хемогетеротрофных B. subtilis и галобактерий H. halobium проводили путем рассева исходных бактерий до отдельных колоний на соответствующих твердых (2% -ный агар) питательных ГС1 и ГС2 средах на основе 99,8% D2O и гидролизата дейтеро-биомассы B. methylicum и последующей селекцией колоний по признаку устойчивости к D2O. В отличие от D2O D-субстраты из гидролизата дейтеро-биомассы не оказывали существенного влияния на параметры роста исследуемых микроорганизмов. Выход [0]рибоксина, зафиксированный при росте B. subtilis на максимально дейтерированной ГС1-среде составил 3,9 г/л при уровне ассимиляции глюкозы из КЖ 40 г/л. Фракционирование [0]рибоксина из КЖ штамма продуцента производили адсорбцией/десорбцией на поверхности активированного угля, экстракцией 0,3 мол/л КН4-формиатным буфером (рН = 8,9) с последующей перекристаллизацией в 80% -ном этаноле и колоночной ионообменной хроматографии на катионообменнике AG50WX 4, уравновешенным 0,3 М КН4-формиатным буфером с 0,045 моль/л NH4Cl. Уровень дейтерированности рибоксина по данным масс-спектрометрии FAB составил пять атомов дейтерия (62,5 ат.% D) с включением трех атомов дейтерия в рибозный и двух атомов дейтерия в гипоксантиновый фрагменты молекулы.
Для адаптации к D2O микроводоросли C. vulgaris использовали жидкие минеральные среды Тамия, содержащие 25, 50, 75 и 98% D2O. В случае с C. vulgaris и H. halobium и использовали освещение лампами дневного света ЛБ -40, поскольку оба микроорганизма развиваются в присутствии света. Выделенные селекцией отдельные колонии клеток, устойчивые к D20, выращивали в жидких средах аналогичного состава с 99,8 ат.% D2O для наработки дейтеро-биомассы.
При выращивании H. halobium в ГС2-среде в клетках синтезировался каротиноидсодержащий фиолетовый пигмент, по спектральному соотношению белкового и хромофорного фрагментов молекулы D280/D568 1,5 : 1 идентичный природному БР. Рост галобактерий в D^-среде ингибировался незначительно по сравнению с контрольной протонированной средой, что существенно упрощает оптимизацию условий наработки
дейтерированной биомассы галобактерий, заключающейся в выращивании галобактерий в дейтерированной среде с 20%-ным гидролизатом дейтеро-биомассы B. methylicum, выделением фракции пурпурных мембран, отделением низко- и высокомолекулярных примесей, клеточной РНК, каротиноидов и липидов с последующим растворением белка в 0,5%-ном додецилсульфате натрия (ДДС-Na) и осаждением метанолом. Суммарный уровень дейтерированности БР, рассчитанный по уровням дейтерированности аминокислот белкового гидролизата, составил 95 ат.% D.
Проведенные нами исследования свидетельствуют, что способность к адаптации к D2O у разных таксономических групп микроорганизмов различная и определяется как таксономической принадлежностью микроорганизмов, так и особенностями метаболизма, функционированием различных путей ассимиляции субстратов, а также эволюционной нишей, которую занимает исследуемый объект. При этом, чем ниже уровень эволюционного развития организма, тем лучше он приспосабливается к присутствию дейтерия в среде. Так, из изученных объектов наиболее примитивными в эволюционном плане (строение клеточной мембраны, биохимия, устойчивость к внешним факторам среды) являются галобактерии, относящиеся к археобактериям, стоящие обособленно как от прокариотических, так и от эукариотических микроорганизмов, обнаруживающих повышенную устойчивость к D2O и практически не нуждающиеся в адаптации к D2O, что нельзя сказать о микроводорослях, которые, будучи эукариотами, труднее всех адаптируются к D2O и проявляют ингибирование роста в 70-75% D2O.
В процессе адаптации к D2O немаловажную роль играет состав питательной среды, поскольку причинами ингибирования роста клеток и их гибели могут стать изменения соотношения синтезируемых метаболитов: аминокислот, белков и углеводов в D2O-средах. Отмечено, что адаптация к D2O проходит легче в комплексных средах, содержащих белково-витаминный концентрат (БВК) дрожжей, при постепенном увеличении содержания дейтерия в среде, так как чувствительность к D2O разных жизненно важных систем различна. Как правило, даже высокодейтерированные среды содержат протоны от 0,2-10% Н. Остаточные протоны в момент адаптации к D2O облегчают перестройку к изменившимся условиям, предположительно встраиваясь именно в те участки, которые наиболее чувствительны к замене атомов водорода на дейтерий. Также были выявлены существенные различия в морфологии дейтерированных и протонированных клеток C. vulgaris. Клетки C. vulgaris, выращенные на D^-средах, имели в 2-3 раза большие размеры и более толстую клеточную стенку; чем контрольные клетки, выращенные на обычной протонированной среде Тамия с обычной водой; распределение в них ДНК было неравномерным. В некоторых случаях на поверхности мембран наблюдались участки, состоящие из плотно упакованных складок цитоплазматической мембраны, напоминающие мезосомы -внутрицитоплазматические бактериальные мембранные структуры везикулярной и трубчатой формы, образующиеся путем инвазии плазматической мембраны внутрь цитоплазмы. Предполагается, что мезосомы участвуют в образовании клеточных перегородок, репликации и сегрегации ДНК, нуклеотидов и др. процессах. Также имеются данные о том, что большинство мезосом отсутствует в нормальных клетках и образуются при действии некоторых внешних химических факторов, низких и высоких температур, колебаниях рН и др. воздействиях. Кроме того, для дейтерированной C. vulgaris было также характерно резкое изменение формы клеток и направления их деления. Наблюдавшееся деление не заканчивалось обычным расхождением дочерних клеток, а приводило к образованию атипичных клеток, описанных в работах других авторов [20]. Наблюдаемые морфологические изменения, связанные с торможением роста дейтерированных клеток, обусловлены перестройкой в процессе адаптации к D2O. Факт, что дейтерированные клетки имеют более крупные размеры (кажущийся размер в 2-4 раза превосходит размер протонированных клеток), является общебиологическим и
наблюдается при выращивании в Б20 целого ряда других адаптированных нами прокариотических и эукариотических клеток (рис. 2).
Рис. 2. Электронные микрофотографии клеток бактерии Micrococcus lysodeikticus: (а) - протонированные клетки; (б) - дейтерированные клетки, полученные с тяжеловодородной среды [20].
Полученные нами данные, в целом, подтверждают устойчивое представление о том, что адаптация к D20 является фенотипическим явлением, поскольку адаптированные к D2O клетки возвращаются после их переноса в обычные водные среды к нормальному росту после некоторого лаг-периода. В то же время эффект обратимости роста на H20/D20 средах не исключает возможности того, что определенный генотип детерминирует проявление одного и того же фенотипического признака в средах различного изотопного состава. При попадании клетки в тяжёловодородную среду, лишённую протонов, из неё не только удаляется протонированная вода за счет реакции обмена H20-D20, но и происходит быстрый изотопный (H-D) обмен в гидроксильных (ОН), сульфгидрильных (-SH) и аминогруппах (-NH2) молекул всех органических соединений, включая белки, нуклеиновые кислоты, углеводы и липиды. Известно, что в этих условиях только ковалентная С-Н связь не подвергается изотопному обмену и вследствие этого только соединения со связями типа С-D могут синтезироваться de novo [21]. В зависимости от положения атома дейтерия в молекуле, различают первичные и вторичные изотопные эффекты, опосредованные межмолекулярными взаимодействиями. В этом аспекте наиболее важными для структуры макромолекулы являются динамические короткоживущие водородные (дейтериевые) связи, формирующиеся между соседними
атомами дейтерия (водорода) и гетероатомами кислорода, углерода, азота, серы и Б20 из окружающей среды, играющие главную роль в поддержании пространственной структуры макромолекул и в межмолекулярных взаимодействиях. Другое важное свойство определяется пространственной структурой 020, имеющей тенденцию сближать гидрофобные группы макромолекул, чтобы минимизировать их эффект на водородную (дейтериевую) связь в Б20. Поэтому структура макромолекул белков и нуклеиновых кислот в присутствии D2О стабилизируется [22].
Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что клетка реализует особые адаптивные механизмы, способствующие функциональной реорганизации работы жизненно -важных систем в Б20. Так, нормальному синтезу и функционированию в Б20 таких жизненно-важных соединений как нуклеиновые кислоты и белки способствует поддержание их структуры посредством формирования водородных (дейтериевых) связей в молекулах. Связи, сформированные атомами дейтерия, различаются по прочности и энергии от аналогичных водородных связей. Несколько большая прочность связи Б-0 по сравнению с Н-О обуславливает различия в кинетике реакций в О2О и Н2О. По теории абсолютных скоростей разрыв С-Н-связей происходит быстрее, чем С-О-связей, подвижность иона Dз0+ меньше, чем подвижность Н30+, константа ионизации Б20 несколько меньше константы ионизации Н2О [23]. Эти факторы приводят к замедлению скоростей ферментативных реакций в Б20 [24]. Однако существуют и такие реакции, скорость которых в D 2О выше, чем в Н 20. В основном это реакции, катализируемые ионами О3О+ или Н2О+ или 0Б- и ОН-.
Отмечено, что вследствие изотопных эффектов дейтерия в Б20 синтезируются молекулы с другими структурно-функциональными свойствами и активностью, чем молекулы, образованные с участием водорода. Эти различия также могут стать причиной различий в синтезах нуклеиновых кислот, которые могут приводить к структурным различиям и функциональным изменениям в клетке и её органеллах. Так, структурно -динамические свойства клеточной мембраны, которые в большинстве зависят от качественного и количественного состава жирных кислот, также могут изменяться в присутствии D2О. В клетках бактерий мембрана является одним из важнейших инструментов регуляции метаболизма, объединяющая в себе аппараты биосинтеза полисахаридов, трансформации энергии, снабжении клетки питательными веществами и участвующая в биосинтезе белков, нуклеиновых кислот и жирных кислот. Очевидно, при адаптации к Б20 мембраны играют важную роль. Однако окончательно не выяснено, что происходит с мембранами, как они реагируют на замену Н+ на О+ и какое это имеет значение для выживания клеток в Б20-среде, лишенной протонов.
Сравнительный анализ состава жирных кислот дейтерированных клеток хемогетеротрофной бактерии В. suЪtШs, полученных при росте в максимально дейтерированной Б2О-среде (ГС1-среда), осуществлённый методом ВЭЖХ показал существенные различия в количественном составе жирных кислот по сравнению с контролем, полученным на обычной воде (рис. 3 а,б). Характерно, что в образце, полученном в Б20-среде, соединения, имеющие времена удерживания 33,38; 33,74; 33,26 и 36,03 мин не детектируются (рис. 3 б). Полученный результат, по видимому, объясняется тем, что клеточная мембрана является одной из первых органелл клетки, испытывающей воздействие 020, и тем самым компенсирует реалогические параметры мембраны (вязкость, текучесть, структурированность) изменением не только количественного, но и качественного состава жирных кислот. Аналогичная ситуация наблюдалась и с разделением других природных соединений (белки, аминокислоты, углеводы), выделенных из дейтерированной биомассы с 020-среды.
Время, мин
б
Рис. 3. Профили жирных кислот протонированных (а) и дейтерированных (б) клеток бактерии B. subtilis, выделенных с максимально дейтерированной 020-срсды (ГС1-среда); хроматограф Beckman Gold System (США), детектор Model 126 (США); неподвижная фаза: Ultrasphere ODS 5 мкм; 4,6 х 250 мм; подвижная фаза: линейный градиент 5 мМ KH2P04-ацетонитрил (показан пунктиром); скорость элюции: 0,5 мл/мин; детекция при X = 210 нм. Пики на хроматограммах с временами удерживания 3,75 мин (вместо 3,74 мин в контроле); 4,10; 4,27; 4,60 (вместо 4,08; 4,12; 4,28 в контроле); 5,07 (вместо 4,98 в контроле); 12,57; 12,97 (вместо 12,79; 13,11; 13,17 в контроле); 14,00 (вместо 14,59 в контроле); 31,87 (вместо 31,83 в контроле); 33,38; 33,74; 33,26; 36,03; 50,78; 50,99 (вместо 51,03; 51,25 в контроле) соответствуют индивидуальным внутриклеточным жирным кислотам
Анализ аминокислот белковых гидролизатов и внутриклеточных углеводов, выделенных из клеток В. subtilis, также выявил заметные различия в биосинтезе этих природных соединений в максимально дейтерированной D2O-среде (ГС1 -среда). Белковый гидролизат В. subtilis представлен пятнадцатью идентифицированными аминокислотами (за исключением пролина, который детектировался при X = 440 нм) при выходах аминокислот, сопоставимых с потребностями используемых бактерий в источниках углерода и аминного азота (табл. 2). Индикатором, определяющим высокую эффективность включения дейтерия в белковый гидролизат, служат высокие уровни дейтерированности молекул аминокислот, которые варьируют от 49 ат.% D для лейцина/изолейцина до 97,5 ат.% D для аланина.
Таблица 2.
Аминокислотный состав белкового гидролизата В. іиЬїіІіі', полученный при росте в максимально дейтерированной среде* и уровни дейтерированности молекул*
Аминокислота Выход, % от сухого веса 1 г биомассы Количество включенных атомов дейтерия в углеродный скелет молекулы** Уровень дейтерированности молекул, % от общего количества атомов водорода***
Протонированный образец (контроль) Образец, полученный в 99,8 %-ной О2О
Г лицин 8,03 9,69 2 90,0
Аланин 12,95 13,98 4 97,5
Валин 3,54 3,74 4 50,0
Лейцин 8,62 7,33 5 49,0
Изолейцин 4,14 3,64 5 49,0
Фенилаланин 3,88 3,94 8 95,0
Тирозин 1,56 1,83 7 92,8
Серин 4,18 4,90 3 86,6
Треонин 4,81 5,51 - -
Метионин 4,94 2,25 - -
Аспарагин 7,88 9,59 2 66,6
Г лутаминовая кислота 11,68 10,38 4 70,0
Лизин 4,34 3,98 5 58,9
Аргинин 4,63 5,28 - -
Г истидин 3,43 3,73 - -
Примечания: * Данные получены на ГС1 среде с 99,8 % D2O и 2 % гидролизатом дейтеро-биомассы В.
шеґкуіісиш.
** При подсчёте уровня дейтерированности протоны (дейтероны) при СООН- и МИ2 группах молекул аминокислот не учитывались из-за лёгкости их диссоциации в И20/020 *** Прочерк означает отсутствие данных.
Фракция внутриклеточных углеводов В. яиЫШз при росте в максимально дейтерированной 020-среде (ГС1-среда) в табл. 3 (нумерация приведена по последовательности их элюции с колонки), представлена моносахаридами (глюкоза, фруктоза, рамноза, арабиноза), дисахаридами (мальтоза, сахароза), а также четырьмя другими неидентифицированными углеводами с временами удерживания 3,08 мин (15,63%), 4,26 мин (7,46%), 7,23 мин (11,72%) и 9,14 мин (7,95%) (не показаны). Выход глюкозы в дейтерированном образце составляет 21,4% от сухого веса, то есть выше, чем фруктозы (6,82%), рамнозы (3,47%), арабинозы (3,69%) и мальтозы (11,62%). Их выходы существенно не отличались от контроля в Н2О, за исключением сахарозы, которая в дейтерированном образце не детектировалась (табл. 3). Уровни дейтерированности углеводов составили 90,7 ат.% О для арабинозы до 80,6 ат.% О для глюкозы.
Таблица 3.
Качественный и количественный состав внутриклеточных углеводов B. subtilis при росте в максимально дейтерированной среде* и уровни дейтерированности молекул
Углевод Удержание в биомассе, в % от сухого веса 1 г биомассы Уровни дейтерированности молекул, ат.%
Протонированный образец (контроль) Образец, полученный в 99,8 %-ной D2G
Г люкоза 20,01 21,40 80,6
Фруктоза 6,12 6,82 85,5
Рамноза 2,91 3,47 90,3
Арабиноза 3,26 3,69 90,7
Мальтоза 15,30 11,62 -
Cахароза 8,62 не детектировалась -
Примечание: *Данные получены на ГО среде с 99,8 % D2O и 2 % гидролизатом дейтеро-биомассы B.
methylicum.
Заключение
Полученные экспериментальные данные свидетельствуют, что эффекты, наблюдаемые при клеточной адаптации к D20, относятся к комплексному многофакторному воздействию, влияющего на многие системы организма. Наблюдаемые изменения клеток при росте на D2O сопровождались изменениями физиологических и морфологических параметров клетки, а также соотношения синтезируемых белков, аминокислот, углеводов и жирных кислот и, по видимому, обусловлены структурно -функциональной перестройкой в процессе адаптации к D2O. Суммируя полученные данные можно сделать вывод, что чувствительность различных клеточных систем к D2O отличны. С точки зрения физиологии наиболее чувствительными к замене Н + на D+ являются аппарат биосинтеза и дыхательная цепь, т. е. именно те клеточные системы, которые используют высокую подвижность протонов и высокую скорость разрыва водородных связей. Последний факт позволяет рассматривать адаптацию к D2O, как адаптацию к неспецифическому фактору, действующему одновременно на функциональное состояние большого числа систем: метаболизм, пути ассимиляции углеродных субстратов,
биосинтетические процессы, структуру и функции макромолекул. Нам представляется целесообразным выбор микроорганизмов в качестве биомоделей в этих исследованиях, поскольку они очень хорошо адаптируются к внешним условиям и способны выдерживать высокие концентрации D2O в ростовых средах.
Литература
1. Мосин О.В. Дейтерий, тяжелая вода, эволюция и жизнь // Водоочистка, водоподготовка, водоснабжение. 2009. № 8. С. 64-70.
2. Kushner D.J., Baker A., Dunstall T.G. Pharmacological uses and perspectives of heavy water and deuterated compounds // Can. J. Physiol. Pharmacol. 1999. Vol. 77(2). pp. 79-88.
3. Lis G., Wassenaar L.I., Hendry M.J. High-Precision Laser Spectroscopy D/H and 18O/16O Measurements of Microliter Natural Water Samples // Anal. Chem. 2008. Vol. 80(1), P. 287-293.
4. Лобышев В.Н, Калиниченко Л.П. Изотопные эффекты D2O в биологических системах. М.: Наука, 1978. 215 с.
5. Vertes A. Physiological effects of heavy water. Elements and isotopes: formation, transformation, distribution. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ., 2004. 112 p.
6. Кишенбаум И. Тяжелая вода / в кн: Физические свойства и методы анализа: Пер. с англ. M.: Атомиздат, 1953. 98 с.
7. Денько Е.И. Действие тяжёлой воды (D2O) на клетки животных, растений и микроорганизмы // Усп. совр. биол. 1973. Т. 70. № 4. С. 41-49.
8. Стом Д.И., Пономарева А.Л., Вятчина О.Ф. Влияние воды с измененным количеством дейтерия на красного калифорнийского гибрида (Eusenia fetida Andrei Bouche) // Бюлл. ВСНЦ СО РАМН. 2006. Т. 6. № 52. С. 167-169.
9. Мосин О.В., Игнатов И. Изотопные эффекты дейтерия в клетках бактерий и микроводорослей // Вода: химия и экология. 2012. № 3. С. 83-94.
10. Мосин О.В., Казаринова Л.А., Преображенская К.А., Складнев Д.А., Чеботаев Д.В., Юркевич А.М., Швец В.И. // Рост бактерии Bacillus subtilis на высокодейтерированной среде, Биотехнология. 1996. №
4. С. 19-27.
11. Crespi H.L. Fully deuterated microorganisms: tools in magnetic resonance and neutron scattering. Synthesis and Applications of Isotopically Labeled Compounds / in: Proceedings of an International Symposium. Baillie T, Jones J.R eds. Amsterdam: Elsevier. 1989. pp. 329-332.
12. LeMaster D.M. Uniform and selective deuteration in two-dimensional NMR studies of proteins // Ann. Rev. Biophys. Chem 1990. Vol. 19. P. 243-266.
13. MacCarthy P. Infrared spectroscopy of deuterated compounds: an undergraduate experiment // J. Chem. Educ. 1985. Vol. 62(7). P. 633-638.
14. Мосин О.В., Складнев Д.А., Егорова Т.А., Швец В.И. Масс-спектрометрическая оценка уровня включения 2Н и 13С в молекулы аминокислот бактериальных объектов // Биоорган. Химия. 1996. Т. 22. № 10-
11. С. 856-869.
15. Mosin O.V., Karnaukhova E.N., Pshenichnikova A.B., Reshetova O.S. Electron impact mass-spectrometry in bioanalysis of stable isotope labeled bacteriorhodopsin, in: 6th Intern. Conf. on Retinal proteins. Leiden, the Netherlands: Springer Verlag. 1994. 115 p.
16. Мосин О.В., Складнев Д.А., Егорова Т.А., Юркевич А.М., Швец В.И. Изучение биосинтеза аминокислот штаммом Brevibacterium methylicum при росте на средах, содержащих тяжелую воду и дейтерометанол // Биотехнология. 1996. № 3. С. 3-12.
17. Мосин О.В, Складнев Д.А., Швец В.И. Включение дейтерированных ароматических аминокислот в молекулу бактериородопсина Halobacterium halobium // Прикл. биохим. микробиол. 1999. Т. 35. № 1. С. 34-42.
18. Mosin O.V., Skladnev D.A., Shvets V.I. Biosynthesis of 2H-labeled phenylalanine by a new methylotrophic mutant Brevibacterium methylicum // Bioscience, biotechnology, and biochemistry. 1998. Vol. 62(2). P. 225-229.
19. Складнев Д.А, Мосин О.В., Егорова Т.А., Еремин С.В., Швец В.И. Метилотрофные бактерии -источники изотопномеченых 2Н- и 13С-аминокислот // Биотехнология. 1996. № 5. С. 25-34.
20. Ерёмин В.А, Чекулаева Л.Н. Выращивание бактерий Micrococcus lysodeikticus на дейтерированной среде // Микробиология. 1978. Т. 14. С. 125-136.
21. Мосин О.В, Складнев Д.А., Швец В.И. Методы получения белков и аминокислот, меченных стабильными изотопами 2Н, 13С и 15N // Биотехнология. 1996. № 3. С. 12-32.
22. Cioni P., Strambini G.B. Effect of Heavy Water on Protein Flexibility // Biophysical J. 2002. Vol. 82(6), P. 3246-3253.
23. Мосин О.В, Складнев Д.А., Швец В.И. Исследование физиологической адаптации бактерий на тяжёловодородной среде // Биотехнология. 1999. № 8. С. 16-23.
24. Cleland W.N., O'Leary M.H, Northrop D.D. Isotope Effects on Enzyme-Catalyzed Reactions. Baltimore, London, Tokyo: University Park Press, 1976. 303 p.
