CC BY
113
Вестник технологического университета. 2015. Т.18, №6 УДК 663.18; 579.63,66
Е. В. Перушкина, А. Р. Хабибуллина, А. С. Сироткин
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБЕЗВРЕЖИВАНИЕ ПРОМЫШЛЕННЫХ ОТХОДОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ БАКТЕРИЙ
Ключевые слова: сточные воды, биологическая очистка, бактерии, иммобилизация, адсорбция, ПВА гель.
В статье рассмотрены некоторые аспекты применения иммобилизованных на керамзите и инкапсулированных в геле бактерий в технологии очистки промышленных сточных вод. Представлены результаты исследования адсорбционной иммобилизации сероокисляющих бактерий на поверхности керамзита. Установлено, что эффективность очистки сточной воды химического производства составила 98-99% (при начальных значениях ХПК 1,03-2,99 г/л и концентрации сульфидов 0,20-0,41 г/л). Перспективным считается использование модифицированного геля ПВА в качестве носителя для иммобилизации клеток денитрифицирующих бактерий. При биологической очистке сточных вод с повышенной соленостью эффективность удаления нитратов составила 99%.
Keywords: wastewater, biological treatment, bacteria, immobilization, adsorption, PVA-gel.
The article reviewed some aspects of immobilized on expanded clay and encapsulated in the gel bacteria's application in the industrial wastewater treatment technology. The adsorption immobilization of sulfur-oxidizing bacteria on the expanded clay surface was investigated. It was established that the nitrate chemical production wastewater bioneutralization efficiency was 98-99% (initial COD (Chemical Oxygen Demand) 1,03-2,99 g/l and sulphide concentration 0,20-0,41 g/l). The use of the modified PVA gel as a carrier for immobilized cells of denitrifying bacteria is considered to be advanced. The nitrate removal efficiency was 99% in biological treatment of wastewater with increased salinity.
Современные темпы развития производства часто сопряжены с увеличением количества отходов или концентрированием токсичных веществ в их составе. Без необходимой обработки промышленных выбросов может возникнуть опасность значительного загрязнения водоемов. В настоящее время эффективным и экологически безопасным способом очистки сточных вод является биообезвреживание, под которым понимается процесс удаления загрязняющих токсичных веществ с помощью живых организмов. Известно, что биологические способы обработки отходов считаются более перспективными по сравнению с реагентными и физико-химическими методами, так как при использовании последних часто образуется значительное количество вторичных отходов, требующих утилизации [1]. Среди существующих способов биологической очистки сточных вод особое внимание уделяется использованию иммобилизованных микроорганизмов в силу эффективности процесса при высоких концентрациях загрязняющих веществ, высокой токсичности и высокой солености, а также при наличии специфичных поллютантов и несбалансированности содержания биогенных элементов.
Анализ данных по экологии микроорганизмов в сооружениях водоотведения позволяет сделать вывод о улучшении технологических характеристик микрофлоры активного ила при использовании её в иммобилизованном виде. Для иммобилизованных клеток создаются искусственные ограничения подвижности во внешней среде, а материальный посредник, обеспечивающий эти ограничения подвижности, считается носителем. В ряде случаев в качестве носителя используются нерастворимые материалы, к которым конкретный тип клеток прикрепляется в реальных условиях (например,
древесина, почва, шерсть, минералы). При таком способе закрепления жизнедеятельность клетки в иммобилизованном состоянии является для нее естественной. Она отличается от природной только искусственно поддерживаемыми в биотехнологическом процессе внешними параметрами (температура, давление, влажность и т.д.) и набором подаваемых клетке веществ [2].
Известно, что закрепление бактериальных клеток может осуществляться как на поверхности носителя (адсорбционная иммобилизация), так и при непосредственном помещении клеток в толщу носителя (иммобилизация в геле).
В случае адсорбционной иммобилизации используется естественная способность многих микроорганизмов закрепляться на разнообразных твердых и гелеобразных носителях и продолжать свою жизнедеятельность в таком обездвиженном состоянии [2].
Для биологической очистки сточных вод в качестве инертных носителей широко используются такие материалы как керамзит, щебень, стекловолокно, нити синтетических волокон, полимеры, мембраны, полиэтиленовые гранулы. Известны примеры экспериментальных
исследований по иммобилизации тионовых бактерий видов SulfobaaUus thermosulfidooxidans, LeptospirШum ferrooxidans, окисляющих серу, железо, сульфиды, на цеолитах. Цеолиты не только накапливают бактерии, но и сохраняют их численность и активность в течение длительного времени [3]. Перспективны разработки по закреплению бактерий на поверхности гетерогенного катализатора КС-20, содержащего 20% мас. фталоцианина кобальта в полиэтиленовой матрице. Сероокисляющие бактерии проявляют высокое сродство к гранулам катализатора, так в ходе исследований отмечено накопление активной
Вестник технологического университета. 2015. Т.18, №6
биомассы на поверхности катализатора (концентрации белка достигала 350 мг/дм3) и достигается высокая степень очистки до 90% сернисто-щелочных сточных вод нефтеперерабатывающего предприятия [4,5].
Для увеличения окислительной мощности биологических очистных сооружений обычно рекомендуется использование адгезионной и/или адсорбционной иммобилизации биомассы на поверхности инертных или активных твердых материалов. При этом происходит не только увеличение концентрации биомассы в единице объема реактора, но и повышается устойчивость микроорганизмов к негативным факторам окружающей среды [2].
В настоящей работе были получены экспериментальные данные о развитии биопленки на инертной поверхности. В качестве носителя выбрали керамзит, представляющий собой зернистый материал, имеющий необходимую гранулометрическую структуру, механическую и химическую прочность [4]. Этот лёгкий пористый строительный материал, обладающий высокой удельной поверхностью контакта, зарекомендовал себя как эффективный носитель для иммобилизации клеток.
Культивирование бактерий проводили в периодических условиях с дополнительным внесением порций стерильной питательной среды (температура 30^; поб=80об/мин). Дозировку субстрата осуществляли в двух режимах: через 48 часов (режим 1) и 96 часов (режим 2).
Известно, что развитие биопленки начинается с прикрепления клеток, затем количество биомассы увеличивается за счет роста бактерий у поверхности носителя и прикрепления новых клеток [6]. Характер изменения значений D590 культуральной жидкости свидетельствовал о приросте биомассы суспендированных клеток и о прикреплении их на поверхности носителя, что сопровождается незначительным снижением значений оптической плотности среды (рис. 1). На конечном этапе эксперимента изменение концентрации клеток достигло плато, которое определяется динамическим балансом между ростом и откреплением бактерий, то есть зависит от поступления субстрата и клеток и от действия сил смыва.
Период активной иммобилизации
сероокисляющих бактерий на поверхности носителя, свидетельствующее о закреплении клеток, отмечается на 10-12 сутки эксперимента, когда регистрируется снижение оптической плотности культуральной жидкости. Дозирование субстрата через 96 ч обеспечило более успешное развитие медленно растущих сероокисляющих бактерий и тем самым интенсифицировало их закрепление на поверхности носителя. При указанном режиме достигалось «голодание» клеток, что привело к возрастанию их активности. Как известно, в большинстве случаев «голодание» клеток приводит к значительному увеличению их адсорбции [2].
Рис. 1 - Изменение Б590 (оп.ед.) культуральной жидкости в процессе иммобилизации сероокисляющих бактерий на керамзите (ромбы - 1 режим дозирования субстрата, квадраты - 2 режим; пунктирная линия - суспензия клеток)
Анализ биоокислительной способности иммобилизованной бактериальной биомассы производили при подаче производственной сточной воды с начальным значением ХПК 1030-2987 мг/дм3 и начальным значением концентрации сульфидов 204-410 мг/дм3 (таблица 1). Удельную степень очистки (УСО) рассчитывали с учетом количества абсолютно сухой биомассы (АСБ) бактерий на поверхности носителя или в объеме сточной воды.
Таблица 1 - Показатели метаболической активности сероокисляющих микроорганизмов (длительность периодического эксперимента 14 суток)
Удельная степень очистки
По значениям ХПК, мг/мг АСБ По содержанию сульфидов, мг/мг АСБ
Иммобилизованная биомасса (1 режим дозирования субстрата) 0,8 0,32
Иммобилизованная биомасса (2 режим дозирования субстрата) 0,2 0,19
Бактериальная суспензия 0,7 0,13
Использование иммобилизованной биомассы позволило значительно увеличить степень очистки промышленных сточных вод от токсичных соединений - сульфидов: бактерии, прикрепленные на поверхности керамзита, способны утилизировать сульфиды в составе сточных вод в 2,5 раза эффективнее суспендированных клеток. Известно, что иммобилизация значительно повышает устойчивость сероокисляющих бактерий к стрессовым воздействиям за счет более высокой плотности популяции, а также интенсифицирует реакции хемосинтеза, что улучшает качество очистки сточных вод [7].
Применение адсорбционной иммобилизации микроорганизмов в практике очистки промышленных сточных вод часто реализуется при
их биофильтрации с использованием керамзита в качестве носителя для клеток. Однако современные технологические приёмы биологической обработки высококонцентрированных отходов во многом основаны на включении микробных клеток в толщу носителя. В этом случае в качестве носителей для микроорганизмов используются гели. Состав геля-носителя и способ инкапсуляции выбираются так, чтобы обеспечивалась наибольшая
продолжительность жизни клеток [8,9].
В настоящее время перспективным гелем для иммобилизации микроорганизмов считается гель-Lentikats, который представляет собой модифицированный ПВА(РУЛ)-гель. Он нашел широкое применение в производстве глюкоамилазы, изолейцина [10]. Результаты экспериментов по очистке модельных сточных вод от соединений азота и фосфора в условиях повышенной солености среды доказывают целесообразность применения помещенных в гель денитрифицирующих бактерий Paracoccus denitrificans и фотосинтезирующих бактерий [11].
Группа ученых под руководством J. Tragi проводит многочисленные исследования, направленные на изучение свойств данного геля и условий его использования в технологиях очистки сточных вод. В частности описана биотехнология Lentikats (Lentikats Biotechnology), которая включает в себя методики работы с биологическим материалом, инкапсулированным в гель Lentikats. Для выявления зависимости метаболической активности микроорганизмов от концентрации геля объектом исследования выбраны денитрифици-рущие бактерии Paracoccus denitrificans. Субстратом для бактерий служила искусственно созданная сточная вода с концентрациями хлоридов 12,14 г/дм3, сульфатов 1,35 г/дм3, нитратов 2,26 г/дм3. Концентрации растворов геля-Lentikats в воде составляли 100%, 80%, 60%, 40%. При большой концентрации геля наблюдается явление ингибирования денитрифицирующей активности, однако процесс утилизации нитратов идет до полного удаления их из среды. Авторы пришли к выводу, что применение геля Lentikats с концентрациями 100% и 80% наиболее приемлемы для применения в технологии биологической очистки промышленных сточных вод [12].
Наряду с расширением области применения иммобилизованных микроорганизмов ведется активная работа по разработке систематики гелей, в зависимости от целевого продукта или микроорганизма, который будет в него помещен. В работе [13], посвященной физиологии микробных клеток внутри неорганических гелей, представлены обширные данные по выживаемости различных микроорганизмов. Например, при инкапсуляции E.coli в полимерные носители бактерия сохраняет 90% своей белковой активности, при помещении в силикагели неорганического происхождения жизнеспособность сохраняется в течение 4 недель, в силикагелях на основе органических веществ -около 24 часов. Активность Saссharomyces cerevisiae внутри полимерных носителей сохраняется более 15
месяцев; а в силикагелях на основе органических соединений - около 10 дней [13].
Помещение клеток в толщу носителя препятствует делению клеток, ограничивает поступление питательных веществ и взаимодействие с другими клетками, которое может привести к изменению генетической информации [14,15]. Поэтому использование «включенных» клеток целесообразно для решения экологических проблем объектов окружающей среды. Известны примеры использования иммобилизованных денитрифицирующих фотосинтезирующих бактерий с целью очистки воды от соединений азота и фосфора в закрытых водоемах. В качестве носителя для бактерий Rhodobacter sphaeroides, Paracoccus pantotrophus, Pseudomonas fluorescens был выбран ПВА-гель (PVA gel) [16].
Высокая эффективность очистки сточных вод от соединений азота (более 98%) позволяет расширить спектр методик очистки воды. В настоящее время считается возможным применение иммобилизованных клеток для очистки стоков при их высокой солености и в случае обедненной воды. Известны экспериментальные исследования J. Trögl и A. Bouskova по изучению денитрифицирующей активности Paracoccus denitrificans, помещенных в гель-Lеntikats. Культивирование бактерий проводили в биореакторе без регуляции температуры и рН до достижения максимальной активности клеток, далее образцы с клетками промывали 3 раза и после добавления этанола клетки проявили свою денитрифицирующую активность. Первая серия из 14 экспериментов была направлена на изучение влияния концентрации нитратов (0,02-2,26 г/дм3) на денитрифицирующую активность микроорганизмов при концентрации хлоридов 12,14 г/дм3, сульфатов - 1,35 г/дм3. Дальнейшая серия опытов, состоящая из 31 эксперимента, показала влияние общей концентрации солей на денитрифицирующую активность иммобилизован-ных клеток. Интервалы варьирования солей: хлориды - 2,43-12,14 г/дм3; сульфаты - 0,27-1,35 г/дм3. Изменение концентрации солей производилось до тех пор, пока концентрация нитратов не достигла постоянного значения (5-1,13 г/дм3). Установлено, что после инкапсуляции клетки микроорганизмов культивировали до достижения максимальной активности, и далее «включенные» клетки поместили в биореактор. Авторами была выявлена зависимость денитрифицирующей активности от температуры, «возраста» носителя и начальной концентрации нитратов, изменение концентрации солей ([Cl +SO42"] = 2,7-13,49 г/дм3) не повлияло на эффективность денитрификации. Результаты эксперимента показали, что эффективность удаления нитратов составляет 99%, при начальном содержании нитратов более 1000 мг на 1 кг носителя Lentikats [11].
Таким образом, разработаны методики использования иммобилизованной биомассы бактерий для биообезвреживания промышленных отходов в различных условиях. Адсорбционная иммобилизация клеток на поверхности инертных
носителей повышает биоокислительную активность сероокисляющих бактерий (эффективность удаления сульфидов 98%) и реализуется при биофильтрации сточных вод. Иммобилизация бактерий в толще носителя, например в модифицированном ПВА-геле Ьепйка^, позволяет использовать клетки при высоких концентрациях загрязняющих веществ, высокой токсичности и высокой солености промышленных сточных вод. Проведенные исследования по биологической очистке сточных вод с высокой соленостью при использовании чистых культур
денитрифицирующих бактерий показали высокую эффективность метода (более 99%). Одним из важнейших преимуществ использования закрепленных в геле клеток является ограничение их взаимодействия с другими клетками, и следовательно сохранению генетической информации специализированных культур при внедрении их в существующие системы очистки сточных вод.
Литература
1. В.К. Половняк, С.В. Фридланд. Вестник Казанского Технологического университета, 4, 17-25 (2009).
2. А.П. Синицын, Е.И. Райнина, В.И.Лозинский, С.Д. Спасов. Иммобилизованные клетки микроорганизмов. Изд-во МГУ, Москва, 1994. 288 с.
3. А.Б. Живаева, Т.В. Башлыкова, А.Н. Хатькова. Оценка перспектив использования цеолитов в процессах
бактериального выщелачивания. ООО "НВП Центр-Эстагео", Москва, 2001. 93 - 94.
4. Е.В. Перушкина, З.О. Садыкова, А.С. Сироткин. Вода: химия и экология, 10, 39-44 (2013).
5. З.О. Садыкова, А.С. Сироткин, Е.В. Перушкина. Вестник Казанского технологического университета, 15, 183-186 (2014).
6. Современная микробиология. Прокариоты / под ред. Й. Ленгелера, Г. Древса, Г. Шлегеля. Т. 1. Мир, Москва, 2005. 656 с.
7. В.А. Юрченко. Влияние процессов иммобилизации микробиоценоза на хемосинтез в системах водоотведения. У ГосНИИ "УкрВОДГЕО", Харьков, 2002. 191 - 197.
8. A. Durieux, X. Nicolay, J.-P. Simon. Biotechnology Letters, 22, 1679-1684 (2000).
9. J. Trogl, G. Kuncova, P. Kuran. Folia Microbiol, 55 (6), 569-575 (2010).
10. P. Parascandola, P. Branduardi, E. de Alteriis. Enzyme and Microbial Technology, 38, 184-189 (2006).
11. J. Trogl, A. Bouskova, J. Mrakota, V. Pilarova, J. Krudencova, J. Mechurova, S. Krizenecka, R. Stloukal. Desalination, 275, 82-86 (2011)
12. J. Trogl, V. Pilarova, A. Bouskova, J. Mrakota and R. Stloukal. African Journal of Biotechnology, 10(79), 1830418310 (2011).
13. G. Kunkova, J. Trogl. Handbook of Inorganic Chemistry Research. Nova Sciense Publishers, 2, 53-101 (2010).
14. G.A. Junter, T. Jouenne. Biotechnol. Adv., 22, 633-658 (2004).
15. G.A. Junter, L. Coquet, S. Vilain, and T. Jouenne. Enzyme Microb. Tech., 31, 201-212 (2002).
16. H. Nagadomi, T. Hiromitsu, K. Takeno, M..Watanabe, K. Sasaki. Journal of biosciense and bioengineering, 87, 2, 189-193 (1999).
© Е. В. Перушкина - канд. техн. наук, доц. каф. промышленной биотехнологии КНИТУ, elena.peroushkina@gmail.com; А. Р. Хабибуллина - студ. той же кафедры aida_khabibullin@mail.ru; А. С. Сироткин - д-р техн. наук, проф., зав. каф. промышленной биотехнологии КНИТУ, asirotkin66@gmail.com.
© E. V. Perushkina, candidate of technical science of industrial biotechnology department Kazan National Research Technological University, elena.peroushkina@gmail.com; A. R. Khabibullina, student of industrial biotechnology department Kazan National Research Technological University, aida_khabibullin@mail.ru; A. S. Sirotkin, doctor of technical science, professor of industrial biotechnology department Kazan National Research Technological University, asirotkin66@gmail.com.
