CC BY
236
Химия растительного сырья. 2010. №3. С. 147-152.
УДК 577.12:582.998.1(571.56-191.2)
БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА ПИЖМЫ ОБЫКНОВЕННОЙ TANACETUM VULGARE L, ПРОИЗРАСТАЮЩЕЙ В ЦЕНТРАЛЬНОЙ ЯКУТИИ
© А.И. Яковлева1, В.В. Семенова2
1 Якутский научный центр комплексных медицинских проблем СО РАМН, ул. Сергеляхское шоссе, 4, Якутск, 677019 (Россия) e-mail: sashyak@mail.ru 2Институт биологических проблем криолитозоны, пр. Ленина, 41, Якутск,
677980 (Россия)
Работа посвящена изучению химического состава водно-этанольного экстракта цветков пижмы обыкновенной Tanacetum vulgare L., произрастающей в Центральной Якутии, методами колоночной, тонкослойной хроматографии и хромато-масс-спектрометрией. Так, в экстракте из метанольной фракции были идентифицированы: четыре стероидных и семь флавоноидных веществ; из этилацетатной фракции - по одному флавоноиду и гликозиду.
Ключевые слова: пижма обыкновенная, флавоноиды, хроматография.
Введение
Огромные резервы биологически активных веществ лекарственных растений не исчерпаны, и особенно это касается флоры Сибири, Дальнего Востока и Якутии, которая изучена относительно мало, по сравнению с флорой других регионов страны. В немногочисленных литературных данных имеются лишь сведения о биологически активных веществах (БАВ) в растениях, произрастающих в Якутии [1-8]. Исследования, затрагивающие структурный анализ флавоноидов в растениях Якутии, практически отсутствуют, имеются только данные об общем количественном содержании флавоноидов [3, 4, 6].
Интенсивное протекание окислительных процессов в организме, вызванное действием различных неблагоприятных факторов окружающей среды и некачественного питания, способствует возникновению синдрома окислительного стресса и развитию свободнорадикальных патологий, таких как атеросклероз, гипертония, ишемия, онкологические заболевания и др. Важная роль в регулировании этих процессов принадлежит антиоксидантам. Установлено, что терапевтическая эффективность многих лекарственных препаратов коррелирует с их способностью тормозить процессы радикально-цепного окисления органических соединений.
В основе высокой биологической активности растительных фенольных соединений лежат их антиокси-дантные свойства. Биологической функцией антиоксидантов является их участие в регуляции свободнорадикального перекисного окисления липидов мембран клеток. Антиоксидантная активность объектов растительного происхождения обусловлена содержанием в них биофлавоноидов, полифенолов и стероидных глико-зидов. В связи с этим полученные результаты позволяют проводить целенаправленный поиск наиболее активных антиоксидантов среди биологически активных веществ пижмы обыкновенной Tanacetum vulgare L., необходимых для лечения заболеваний печени, индуцированных процессами перекисного окисления липидов.
Цель настоящей работы - определение индивидуального химического состава веществ в экстракте цветков пижмы обыкновенной Tanacetum vulgare L., произрастающей в Центральной Якутии.
* Автор, с которым следует вести переписку.
Экспериментальная часть
Объектом исследования нами выбраны цветки пижмы обыкновенной Tanacetum vulgare L. (дикая рябинка) из семейства Астровые - Asteraceae, произрастающей в Центральной Якутии. С описанием пижмы обыкновенной можно ознакомиться в литературных источниках [5, 7]. Растительный материал был собран в сухую погоду в период цветения (первая декада июля). Местность сбора - окрестность Якутска, в 4 км от шоссе, в экологически чистом районе. Потеря массы сырья при высушивании составила 90%.
Методы исследования. Для разделения флавоноидных и стероидных компонентов в экстракте цветков пижмы обыкновенной Tanacetum vulgare L. использованы методы колоночной и одномерной тонкослойной хроматографии (ТСХ). Для идентификации состава флавоноидных и стероидных компонентов был применен хромато-масс-спектрофотометрический метод анализа (ХМСА).
Приготовление водно-этанольного экстракта из растительного сырья для колоночной хроматографии (КХ). 5 кг цветков пижмы обыкновенной Tanacetum vulgare L. измельчали и заливали в водноспиртовом растворе (40%) в соотношении 1 : 10. Настаивание производили в темном месте в течение 7 сут., при комнатной температуре. Затем настой фильтровали (первый фильтрат) и вновь заливали водноспиртовым раствором в том же количестве и составе, что и в первый раз. Во второй раз настаивали 10 дней в тех же условиях (второй фильтрат). После настаивания оба фильтрата объединяли.
Для осаждения белков и содержащихся примесей применяли стандартную методику 5%-ным раствором трихлоруксусной кислоты (ТХУ) из расчета 5 мл ТХУ на 100 мл экстракта, после чего полученный экстракт фильтровали через бумажный фильтр и оставляли в темном месте на сутки. Вновь выпавший при этом осадок фильтровали, используя вакуумный насос.
Для приготовления метанольного экстракта использовали сухой остаток, который готовили путем выпаривания экстракта объемом 10 мл. После полного высыхания растворителей в сухой остаток добавляли 2 мл метанола и смесь оставляли на сутки в темном месте. После этого ценрифугировали при 3000 об/мин, в течение 20 мин и использовали для идентификации индивидуального состава методом ХМСА (метанольная фракция).
Для разделения флавоноидных веществ был применен метод колоночной хроматографии. В колонку в виде суспензии вносили 50 г силикагеля, смешанного с системой растворителей (хлороформ - метанол 9 : 1). Исследуемый экстракт растворяли в том же элюенте (хлороформ - метанол 9 : 1), смешивали с 5 г силикагеля и высушивали при комнатной температуре. Приготовленный сухой порошок вносили в колонку и заливали элюентом (хлороформ - метанол 9 : 1) [9]. Фракции, различающиеся по цвету, собирали в отдельных колбах. По аналогичной схеме элюировали эталацетатом и бутанолом.
Для качественного определения флавоноидных веществ использован метод тонкослойной хромато-графии (ТСХ). Для ТСХ применяли силуфоловые пластинки АРМ СОРБ, ТСХ-КСКГ-УФ, сорбент - силикагель КСКГ, подложка - алюминиевая фольга, связующее - крахмал, зернение 5-20 мкм, толщина слоя -100+10 мкм, размер пластин - 15*15 см. Использовали следующие системы растворителей (соотношение объемов): хлороформ - метанол (а) 9 : 1, б) 4 : 1, в) 2 : 1, г) 1 : 1); хлороформ - метанол - бутанол-1 (5 : 3 : 1); бензол - метанол - уксусная кислота (45 : 8 : 3) [9, 10]. Из выделенных концентрированных фракций отбирали малое количество раствора капилляром (d=0,05 мм) и наносили на пластины, используя систему в хроматографической камере, хлороформ - метанол (9 : 1). Для обнаружения флавоноидных соединений в хроматограммах ис -пользовали 10%-ный спиртовый раствор хлористого алюминия, с последующим УФ-облучением.
Для колоночной хроматографии исследовали каждую колбу с экстрактами, различающимися по цвету, близкие по хроматограмме на тонком слое фракции объединяли. В результате элюирования колонок получили три основных фракции: хлороформно-метанольную (ХМФ), этилацетатную (ЭФ) и бутанольную (БФ), которые далее были использованы для ХМСА.
Для идентификации состава и строения флавоноидных веществ применен метод хромато-масс-спектрометрии. Использовали хромато-масс-спектрометр фирмы Perkin Elmer, включающий газовый хроматограф Avtogigtem XL с Q-macc 910. Капиллярная колонка диаметром 0,25 мм, длиной 90 мс импрегни-рованной фазой РЕ-5. Способ ионизации - электронный удар. Диапазон температур в термостате - 40280 °С, с подъемом температуры 5 °С/мин. Температура испарителя - 300 °С. Точность установки температуры в термостате - 0,1 °С. Газ-носитель - гелий (давление 24 psi). Скорость подачи - 3 мл/мин. Масс-спектры каждого хроматографического пика получены при энергии электронного удара 70 эВ, температуре ионизационной камеры 300 °С, времени развертки спектра 0,5 с. Интерпретация масс-спектров проводилась
путем автоматического компьютерного сравнения по библиотеке спектров, насчитывающей более 60000 масс-спектров органических соединений.
Схема выделения биологически активных веществ из цветков пижмы обыкновенной ТапасгШш уи^агг Ь. а - фракции, полученные после разделения препаративной колоночной хроатографией; б - фракции для одномерной тонкослойной хроматографии
Обсуждениерезулътатов
Хромато-масс-спектрометрический метод исследования водно-этанольного экстракта цветков пижмы обыкновенной ТапасгЫш уи^агг Ь. позволил установить структуру веществ, полученных в результате экстракции и комбинирования хроматографических методов анализа.
Согласно полученным нами данным метанольная фракция липофильной части водно-спиртового экстракта цветков пижмы обыкновенной ТапасгЫш уи^агг Ь. содержала наибольшее относительное содержание веществ (в процентах). Процентное содержание веществ рассчитывали по высоте и площади всех пиков (100%) к конкретно идентифицированному пику. Так в этой фракции обнаружены 149 пиков, среди идентифицированных веществ наибольшей концентрацией обладали: 2-фуран, (8,83%), гидрохинон (7,06%), 5,5-гидроксиметилкарбоксоальдегид (4,53%), 2-этилгептановая кислота (4,41%), 2-метоксифенол (3,71%), 3-гидрокси-4-метоксибензойная кислота (3,18%), фенилоксазол (2,82%), 4-фенилоксазол (2,65%),
3-метоксибензойная кислота (2,23%), р-Б-глюкоза (1,76%), бензойная кислота (1,23%), 3-фенил-3-пропен-овая кислота (1,23%). Наибольший интерес для нас представляли четыре стероидных компонента:
3-метоксистигмостадиен-5,22 (0,36%), ацетатхолестен-8-ол-3 (0,27%), ацетатстигмостадиен-5,22-ол-3
(0,27%), ацетат-4,4-диметилхолестен-7-ол-3 (0,18%). В скобках приведены доли веществ в процентах. Стероидные вещества являются сложными комплексами, участвующими в построении внутриклеточных мембран и имеющими важнейшее значение в регуляции обмена веществ в клетке.
Нами также исследованы хлороформно-метанольная (9 : 1) и этилацетатная фракции водно-этанольного экстракта цветков пижмы обыкновенной Тапасг(иш уи^агг Ь. Опытным путем наиболее подходящей системой растворителей для ТСХ нами выбрана система хлороформ - метанол в соотношении 9 : 1. В литературе имеются данные о том, что для выделения флавоноидов в основном используется эта система и именно в этом соотношении [9]. В других системах растворителей, описанных выше в методах исследования, четкого разделения веществ не наблюдалось.
В хлороформно-метанольной (9 : 1) фракции наблюдали две основные фракции: темно-зеленого и желтого цвета. В темно-зеленой фракции содержались в основном хлорофиллы и вещества липофильного характера. После проявления 10%-ным раствором хлористого алюминия и УФ-облучении в желтой фракции проявилось одно размытое пятно с ярко-желтой флуоресценцией с Я(=0,509. Менее полярные флавоноидные соединения (аглико-ны, монозиды) были сосредоточены в этилацетатной фракции. В ней же при ТСХ наблюдали два желтых пятна с Яа=0,284 с небольшой верхней примесью и с Яе=0,623.
При кристаллизации из ХМФ и ЭФ получили кристаллы желтого цвета. В количественном соотношении это выглядит следующим образом: из ХФ - 2,40 г (0,28%), из ЭФ - в общем 5,61 г (0,5%), из них идентифицированы лишь 2,32 г (0,21%) соответственно. Остальные 3,29 г (0,29%) веществ не растворяются в органических растворителях (в метаноле, ацетилоксане, бензоле), а были растворимы лишь в воде, поэтому масс-спектры данных веществ не удалось снять. Бутанольная фракция не содержала веществ флавоноидной природы, о чем свидетельствовало отсутствие свечения после УФ-облучения при ТСХ, поэтому ее не исследовали методом ХМСА.
Так, в хлороформно-метанольной фракции цветков пижмы обыкновенной Тапасг(иш уи^агг Ь. сосредоточены 146 пиков, из них идентифицированы следующие вещества: тимол (6,28%), 3-циклоундекановая кислота (4,15%), 2-метил-4-пропенилфенол (2,13%); 3-ацетилбензойная кислота (1,84%), 3-метокси-4-гидрокси-фенилпропен-2 (1,66%), 5-холеиновая кислота (1,47%). Также были идентифицированы девять флавоноид-ных веществ, содержащих в бензопирановом и бензольном кольцах следующие группировки: -ОН, -ОСН3, -СООСН3 2-(4'-гидрокси)-фенил-3,7-диметокси-5-гидроксибензопиран-4-он (3,88%); 2-(4'-гидрокси)-фенил-5-гидрокси-6,7-диметокси-бензопиран-4-он (3,32%); 2-(фи'-гидрокси)-фенил-6,7-диметокси-5-гидрокси-
бензопиран-4-он (3,32%); 2-(4'-метокси)-фенил-3-метокси, 5,7-дигидроксибензопиран-4-он (3,25%);
2-(3'-метокси-4'-ацетилокси)-фенил, 5-ацетилокси-7-метоксибензопиран-4-он (0,55%); 2-(3',4'-диметокси)-фенил-5,7-дигидрокси-бензопиран-4-он (0,36%); 2-гидрокси-3-фенил-(4'-метокси)-7-метокси-5-гидрокси-
бензопиран-4-он (0,36%); (4'-метокси)-фенил-3,5-дигидрокси-7-метоксибензопиран-4-он (0,35%);
2-(3'-метокси-4'-гидрокси)-фенил-5-гидрокси-7-метоксибензопиран-4-он (0,28%).
В этилацетатной фракции обнаружены 140 пиков, из них идентифицированы: гидрохинон (6,75%), 2-про-пеоновая кислота (4,15%), бензойная кислота (3,07%), 3-метокси-4-гидроксибензойная кислота (2,85%), азе-лаиновая кислота (2,55%), гексадекановая кислота (2,09%), 2-метилбутеновая кислота (1,84%),
2-гидрокси-3-фенол (1,66%), метоксифенол (1,53%), ацетальдегид (1,34%), 4-метилбензенметанол (1,13%),
4-терпиенол (1,09%), 2-бутинилциклогексанон (0,56%) и камфора (0,43%). Кроме этих компонентов, данная фракция содержала следующие флавоноиды: 7,7',8,8',11,12-гексагидро-рз1,р51-каротен (1,23%), 2-(3',4'-ди-гидрокси)-фенил-6,8-ди-с-Б-глюкопиранозил (0,72%).
Результаты нашего исследования показывают, что химический состав цветков пижмы обыкновенной ТапасгШш уи^агг Ь. весьма богат стероидными и флавоноидными соединениями. Фармакологический эффект при использовании в народной медицине цветков (при холецистите, холангите, гепатите, колитах, энтеритах, в комплексном лечении лямблиоз), вероятно, достигается наличием веществ стероидной структуры. Действие настойки цветков пижмы обыкновенной Тапасг(иш уи^агг Ь., обладающей сосудорасширяющим свойством при стенокардии, возможно, связано с присутствием в его богатом и разнообразном составе гли-козидов растительного строения. Поэтому применение цветков пижмы обыкновенной ТапасгШш уи^агг Ь. в народной медицине в виде настоек, экстрактов или других средств профилактики и лечения многих заболеваний весьма многообразно, что связано с богатым химическим составом данного растения.
Как свидетельствуют результаты немногочисленных исследований (включая результаты хромато-масс-спектрометрического анализа), в тканях организмов растений, произрастающих в экстремальных климатических условиях (особенно на северо-востоке России), синтезируется в 1,5—2,5 раза больше биологически активных веществ (БАВ), представленных в 2-5 раз большим структурным разнообразием [11].
В имеющихся немногочисленных литературных данных показано, что водные извлечения Т. уи^агг содержат большое количество флавоноидов (4,53; 3,67; 4,98% соответственно), которые обладают высокой и средней анти-оксидантной активностью [12]. Так, в цветках и надземной части Т. уи^агг доминируют признанные АО: апиге-нин, лютеолин и их гликозиды, фенолокислоты, особенно кофейная и и-кумаровая кислоты [13].
При заболеваниях органов пищеварения защитные действия фенольных антиоксидантов, извлеченных из растений, реализуются до абсорбции, т.е. внутри желудка или кишечника, посредством перехвата свободных радикалов, тем самым предотвращая их образование [14]. В работе [15] показаны иммунотерапевтиче-ские и антивоспалительные активности извлеченных из фракций экстрактов полисахаридов ТапасгШш уи^агг Ь. При этом данный полисахарид ингибирует фактор некроза опухолей а (ТОТ-а) по 1774.А1 макрофагов мыши и дезактивирует ядерный фактор кВ (№-кВ) в ТНР-1 моноцитов человека. Кроме того, полисахариды пижмы стимулируют значительное повышение нейтрофилов миелопероксидазы.
Наибольший интерес для дальнейшего изучения представляют полисахариды пижмы Т. уи^агг, которые еще называют танацетанами [16]. Они наименее изучены, а данное растение отличается наибольшим их содержанием по сравнению с другими растениями. Ранее было установлено, что количество глюкуроновых кислот в танацетанах в фазе массового цветения пижмы Т. уи^агг составляет 43,3% от веса сухого полисахаридного препарата, что указывает на принадлежность к классу пектинов [17, 18]. Все полисахариды пижмы (танацетаны) обладают физиологической активностью и способны связывать в сыворотке крови атеро -генные липопротеиды низкой плотности, что может указывать на их антиатеросклеротическую активность. Танацетаны были исследованы на способность связывать в сыворотке крови атерогенные фракции холестерина, так называемые липопротеиды низкой плотности (ЛИНИ), которые, как известно [19-20], являются инициаторами атеросклеротического процесса. В результате установлено, что танацетаны способны связывать различные количества ЛПНП в сыворотке крови человека, при этом наибольшей активностью обладает танацетан ТУ2, связывающий 74% ЛПНП.
Заключение
Водно-этанольный экстракт цветков пижмы обыкновенной ТапасгШш уи^агг Ь. весьма богат своим химическим разнообразием, что подтверждается нашими результатами. С помощью хромато-масс-спектрометрии нами исследованы и идентифицированы следующие фракции: метанольная, хлороформно-метанольная (9 : 1), этилацетатная и бутанольная.
С помощью колоночной хроматографии нам удалось разделить водно-этанольный фильтрат цветков пиж-мы обыкновенной ТапасгШш уи^агг Ь. на три фракции. При применении одномерной тонкослойной хроматографии нами использованы шесть разных систем растворителей, из которых наиболее подходящей для исследуемых нами флавоноидных веществ была выбрана система растворителей «хлороформ - метанол» в соотношении 9 : 1. При обра-
ботке хроматограмм 10%-ным хлористым алюминием и УФ-облучении флавоноиды были локализованы в желтой фракции и проявились как пятно с ярко-желтой флуоресценцией. Менее полярные флавоноидные соединения были сосредоточены в этилацетатной фракции, в которой проявились два желтых пятна. С помощью хромато-масс-спектрометрии нами исследованы следующие фракции: метанольная, хлороформно-метанольная (9 : 1), этилацетатная и бутанольная. При этом удалось снять 435 пиков, из них идентифицирован химический состав 47 веществ. Наиболее имеющие для нас интерес: четыре стероидных соединений, 10 веществ флавоноидной природы и один гликозид. При идентификации в каждой фракции содержались представляющие для нас наибольший интерес вещества, что свидетельствует о правильности подбора биотехнологических методов разделения и идентификации биологически активных веществ.
Список литературы
1. Кершенгольц Е.Б., Шейн А.А., Кершенгольц Б.М. Комплекс биологически активных веществ, выделенных из лишайников методом С02 флюидной сверхкритичной экстракции, и оценка его влияния на состояние крыс при алкоголизации // Наука и образование. 2005. №2. C. 74-80.
2. Кершенгольц Б.М., Аньшакова В.В., Филиппова Г.В., Кершенгольц Е.Б. Влияния температурно-влажностных метеорологических условий на качественный и количественный состав эфирных масел полыней Якутии // Химия растительного сырья. 2009. №3. С. 89-94.
3. Кузьмина С.С., Попова А.С. Зависимость накопления флавоноидов и аскорбиновой кислоты в дикорастущих растениях Якутии от условий произрастания // Наука и образование. 2001. №1. С. 80-84.
4. Макаров А.А., Дубовик Л.А. Материалы по флавоноидности растений Центральной Якутии: Материалы к изучению лекарственной флоры Якутии. Якутск, 1977. С. 53-62.
5. Макаров А.А. Лекарственные растения Якутии и перспективы их освоения. Новосибирск, 2002. 264 с.
6. Попова А.С., Миронова Г.Е., Аргунов В.А. Антиоксидантные системы защиты организмов и биотехнологические пути коррекции их нарушений в условиях севера. Якутск, 2008. 128 с.
7. Макаров A.A. Биологически активные вещества лекарственных растений Якутии. Якутск, 1989. 156 с.
8. Атлас лекарственных растений Якутии / отв. ред д-р с.-х. наук Б.И. Иванов. Т. 1. Якутск, 2003. 194 с.
9. Ветчинкин A.P. Методы выделения флавоноидов и антоцианидинов // Ученые запики Саратовского экономического института. 1988. Т. 3(7). 321 с.
10. Шаршунова М.С., Шварц В.Г., Михалец Г.Н. Тонкослойная хроматография в биохимии и клинической биохимии: в 2 ч. Ч. 1 / пер. со слов. А.П. Сергеева и А.Н. Ушакова; под ред. В.Г. Березкина. М., 1980. 295 с.
11. Стогний В.В., Журавская А.Н., Кершенгольц Б.М. Эколого-климатические особенности функционирования защитных антиоксидашных системв тканях дикорастущихрастений // Радиоэкология. 1999. Т. 39. №1. С. 79-83.
12. Williams C.A., Harborne J.B., Eagles J. Variations in lipophilic and polar flavonoids in the genus Tanacetum // Phytochemistry. 1999. V. 52. Pp. 1301-1306.
13. Wojdylo A., Oszmiacski J., Czemerys R. Antioxidant activity and phenolic compounds in 32 selected herbs // Food Chemistry. 2007. V. 105. N3. Pp. 940-949.
14. Caillet S., Yu H., Lessard S., Lamourex G., Ajdukovic D., Lacroix M. Fenton reaction applied for screening natural antioxidants // Food Chemistry. 2007. V. 100. Pp. 542-552.
15. Gang Xie, Igor A. Schepetkin, Mark T. QuinnG. Xie et al. Immunomodulatory activity of acidic polysaccharides isolated from Tanacetum vulgare L. // International Immunopharmacology. 2007. V. 7. Pp. 1639-1650.
16. Полле А.Я., Оводова P.Г., Попов С.В. Выделение и общая характеристика полисахаридов из пижмы обыкновенной, мать-и-мачехи и лопуха войлочного // Химия растительного сырья. 1999. №1. C. 33-38.
17. Шаламова Г.Г., Сысоева К.Н. Минеральный и белковый состав полисахаридного комплекса из соцветий Tanacetum vulgare // Химия природныхсоединений. 1985. №2. С. 267-268.
18. Сысоева К.Н., Горин А.Г., Яковлев А.П. Динамика содержания водорастворимых полисахаридов в соцветиях пижмы обыкновенной // Растительные ресурсы. 1979. Т. 15. Вып. 1. С. 89.
19. Рыженков В.Е., Соловьева М.А., Ремезова О.В., Окуневич И.В. Гиполипидемическое действие сульфатирован-ных полисахаридов // Вопросы медицинской химии. 1996. Т. 42. №2. С. 115-119.
20. Титов В.Н. Патогенез атеросклероза для XXI века (Обзор литературы) // Клиническая лабораторная диагностика. 1998. №1. С. 3-11.
21. Sawamyra T., Kume N., Aoyama T. et al. Anendothelial receptor for oxidized low-density lipoprotein // Nature. 1997. V. 386. Pp. 73-77.
Поступило в редакцию 12 октября 2009 г.
После переработки 10 июня 2010 г.
