CC BY
259
УДК 579.222.2:631.86
БИОКОНВЕРСИЯ ДРЕВЕСНЫХ ОТХОДОВ МЕТОДОМ КОМПОСТИРОВАНИЯ С ПОЛУЧЕНИЕМ ОРГАНИЧЕСКОГО УДОБРЕНИЯ
© 2009 Н.С. Мокрушина, Т.С. Тарасова, И.В. Дармов
Вятский государственный университет, г. Киров e-mail: biologia@aug.kirov.ru Поступила
В настоящее время остро стоит проблема утилизации отходов лесозаготовительной и деревообрабатывающей отраслей. В России ежегодный объем отходов данных производств достигает 100 млн. м3. Известен способ переработки древесных отходов - биоконверсия методом компостирования. При компостировании древесных отходов происходит не только очищение экосистем, но и производится полезный продукт - органическое удобрение. Для ускорения процесса компостирования применяют микробные закваски, включающие микроорганизмы-деструкторы целлюлозы и лигнина, основных биополимеров древесины. В работе из природных источников (гнилой древесины, лесной почвы, компоста и др.) было выделено 112 культур микроорганизмов - вероятных биодеструкторов древесины, из них 70 культур микромицетов и 42 культуры бактерий. Были отработаны методики для проведения скрининга целлюлозо- и лигнолитических штаммов микроорганизмов. С помощью разработанных методик среди 112 исследуемых культур выбрали два штамма микромицета. Данные микромицеты были идентифицированы как Fusarium sp. и Aspergillus sp. Определена убыль лигнина опилок при твердофазном культивировании на них исследуемых штаммов на 8 сутки: для микромицета Fusarium sp. - 10,2%, для микромицета Aspergillus sp. - 9,4%. Данные штаммы признаны перспективными для включения в состав биопрепарата, предназначенного для ускоренного компостирования древесных отходов.
Ключевые слова: биоконверсия, древесные отходы, органическое удобрение.
ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
В процессе лесозаготовки и деревопере-работки неизбежно образуются древесные отходы различного вида и качества. Их ежегодный объем по России достигает нескольких сотен миллионов тонн. Древесные отходы частично перерабатывают с производством древесноволокнистых, древесностружечных плит, пеллет. Также значительную долю древесных остатков используют для отопления производственных и жилых помещений. По данным Управления охраны окружающей среды и природопользования Кировской области, в 2005 г. из 490,7 тыс. т древесных отходов было использовано в качестве вторичных ресурсов 80% [1]. Это очень высокий показатель, но остальная доля отходов лесозаготовки и лесопереработки (около 100 тыс. т) так и остается непереработанной и загрязняет места вырубки и территорию лесообрабатывающих предприятий. Стоит также
Наталья Сергеевна Мокрушина, аспирант кафедры микробиологии; Татьяна Сергеевна Тарасова, аспирант той же кафедры; Илья Владимирович Дармов, заведующей той же кафедрой.
учесть, что это официальные цифры, реальный же объем гниющих древесных отходов гораздо выше.
На наш взгляд, наиболее рациональный способ переработки неутилизированных древесных остатков - их компостирование. Компостирование древесных отходов является не только достаточно дешевым способом их переработки, но и перспективным с экологической точки зрения.
Для ускорения процесса компостирования предложено внесение в компостную смесь заквасок, включающих микроорганизмы -деструкторы лигнина и целлюлозы, т.е. основных биополимеров древесины. Применение микробных заквасок при компостировании различных видов отходов позволяет в несколько раз ускорить процесс и получить органическое удобрение [2].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Объекты и методики исследования. Объектами исследования являлись штаммы микроорганизмов, выделенные из природных источников: лесной почвы, гнилой древесины, компоста, фрагментов плодовых тел трутовиков и других природных субстратов, вероятных источников биодеструкторов древе-
сины. Всего в работе было исследовано 112 штаммов микроорганизмов, среди которых 70 - микромицеты и 42 - бактериальные культуры. Изолированные микроорганизмы до идентификации обозначались условными номерами. Культуры микромицетов хранились на скошенном в пробирках агаре Чапека, бактериальные культуры - мясопептонном агаре.
В работе также исследованы 8 культур микроорганизмов, выделенные из препарата «Байкал ЭМ1» на различных питательных средах.
Методы исследования. Определение способности микроорганизма к деградации целлюлозы проводили путем выращивания исследуемых штаммов на агаризованной минеральной среде с добавлением 0,1% карбокси-метилцеллюлозы (КМЦ). После 3-5 сут. инкубирования при температуре 30°С чашку заливали 0,1% раствором конго красного на 15 мин, затем краситель удаляли и заливали 1М раствором ЫаС1 на 10 мин. Чашки просматривали и отмечали наличие зон просветления, их диаметр, отношение диаметра зоны просветления к диаметру колонии [3, 4].
Способность микроорганизмов к деградации лигнина определяли следующим способом. Исследуемые штаммы выращивали на агаризованной минеральной среде с добавлением 0,5% танина. После 3-5 сут. инкубирования при температуре 30°С чашку просматривали, отмечали наличие бурого окрашивания в зоне роста колонии, наличие и диаметр зон просветления [5, 6].
Определение содержание лигнина в опилках проводили в соответствии с методом Кла-сона в модификации Комарова с предварительным гидролизом образовавшейся белковой массы пепсином [7, 8].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Микроорганизмы, которые могут войти в состав компонентов закваски для утилизации древесных отходов, должны обладать лигно-и целлюлозолитической способностями. В связи с этим все выделенные штаммы были подвергнуты исследованию на их наличие. Опыты проводили 2 раза в двух параллелях. Результаты приведены в табл. 1.
При выращивании на среде с танином ни одна из исследуемых культур не дала бурого окрашивания, отмечено только наличие зон просветления.
Для большинства исследованных культур бактерий была характерна низкая сумма баллов, наибольшее ее значение составляло 8 баллов. Наивысшими суммами баллов (1517) обладали культуры микромицетов, выделенных из лесной почвы и гнилой древесины. Два штамма микромицета, имеющих максимальную сумму баллов (17), оставлены для последующих исследований. Шестнадцать культур микромицетов, имеющих сумму 16 баллов, оставлены как резервные.
Была проведена идентификация микромицетов, обладающих наибольшей активностью (сумма баллов - 17). По результатам изучения культурально-морфологических признаков и микроскопического строения они были отнесены к родам Fusarium и Aspergillus [911]. Штаммовая идентификация изолятов не проводилась.
Поскольку отдельные представители рода Fusarium могут быть патогенными для человека и теплокровных животных, что обусловлено продукцией микотоксинов, был проведен анализ культуральной жидкости данного микроорганизма на наличие токсинов. Иммуноферментный анализ на Т2-токсин дал отрицательные результаты, внут-рибрюшинное введение культуральной жидкости 10 мышам в дозе 0,1 мл не привело к их гибели в течение 2 недель, что свидетельствует об отсутствии продукции микотокси-нов.
По данным, полученным в результате оценки фитотоксичности исследуемых штаммов микромицетов на проростки пшеницы, ни один из них не проявляет выраженного фи-тотоксического действия.
Для сравнения была исследована микрофлора биопрепарата «Байкал ЭМ1», предназначенного для компостирования хозяйственно-бытовых отходов и растительных остатков. Оценку лигно- и целлюлозолитических способностей проводили как для отдельных культур, выделенных из биопрепарата, так и для цельного препарата, неразведенного и разведенного согласно рекомендациям по применению. Определение лигно- и целлюзо-литической активностей этих культур дало отрицательный результат. Ни одна из монокультур, выделенных из биопрепарата «Байкал», а также комплексный препарат не дали роста и окрашивания на агаризованных средах с карбоксиметилцеллюлозой и танином.
Для оценки способности культур микро-мицетов к твердофазному росту на опилках
последние измельчали до размеров не более 0,5 мм. Навеску измельченных опилок массой 300 мг помещали в стеклянный бикс объемом 20 мл и стерилизовали. Посевную культуру выращивали в 10 мл жидкой среды Чапека с сахарозой в конических колбах объемом 100 мл в течение суток при температуре 30°С и шуттелировании. Посев исследуемых культур проводили из расчета 1,5 мл посевной культуры на 100 мг опилок. Первые су-
Таблица 1
Результаты скрининга штаммов микроорганизмов на наличие целлюлозо-и лигнолитической способностей (в баллах)
тки посевы шуттелировали при температуре 30°С, затем инкубировали в статических условиях при температуре 30°С. Оценку убыли лигнина проводили на 8 сут. культивирования.
Контролем служили опилки, инокулиро-ванные стерильной дистиллированной водой и выдержанные в тех же условиях, что и опытные.
Характер роста исследуемого штамма на среде
Число штам- с КМЦ с танином Результаты
мов, облада- Отношение диа- Отношение диамет- скрининга
ющих данны- Интенсив- метра зоны про- Интенсив- ра зоны просветле- (сумма в бал-
ми свойствами ность роста светления к диаметру колонии ность роста ния к диаметру колонии лах)
2 0 0 1 0 1
15 1 0 0 0 1
5 1 0 1 0 2
5 1 4 1 0 6
15 2 0 1 0 3
2 2 0 2 0 4
1 2 0 2 5 9
1 2 5 0 0 7
1 2 5 1 0 8
4 2 5 2 4 13
2 3 0 1 0 4
1 3 0 2 0 5
2 3 0 2 5 10
2 3 0 3 4 10
6 3 0 3 5 11
2 3 0 3 6 12
4 3 4 1 0 8
2 3 4 2 4 13
6 3 4 3 4 14
3 3 5 2 0 10
2 3 5 2 4 14
1 3 5 2 6 16
9 3 5 3 4 15
12 3 5 3 5 16
1 3 5 3 6 17
3 3 6 3 4 16
1 3 6 3 5 17
Примечания. В колонках «интенсивность роста»: 0 баллов - отсутствие признаков роста, 1 балл - слабый рост, 2 балла - умеренный рост, 3 балла - значительный рост. В колонках «отношение диаметра зоны просветления к диаметру колонии»: 0 баллов - отсутствие зоны просветления, 4 балла - диаметр зоны просветления меньше диаметра колонии (уже зоны растущего края мицелия), 5 баллов - диаметр зоны просветления равен диаметру колонии (граница зоны просветления совпадает с растущим краем мицелия), 6 баллов - диаметр зоны просветления больше диаметра колонии (шире зоны растущего края мицелия).
Для удаления белковой массы перед опре- ка проводилась в течение 18 ч. раствором
делением содержания лигнина была проведена предварительная обработка твердофазной мицелиальной культуры пепсином. Обработ-
пепсина в 1% соляной кислоте.
Результаты определения убыли лигнина представлены в табл. 2.
Таблица 2
Убыль лигнина опилок после твердофазного культивирования на них микромицетов-биодеструкторов древесины
Содержание лигнина в опыте, мг Убыль лигнина, (x±i 95), %
Исследуемый штамм 1 2 3
Проба 1 76,5 77,7 77,1
Fusarium sp. Проба 2 76,5 76,8 76,5 10,2±0,7
Проба 3 77,7 76,9 77,7
Проба 1 78,0 77,1 77,7
Aspergillus sp. Проба 2 77,4 78,3 78,3 9,4±0,9
Проба 3 77,4 78,6 77,1
Проба 1 85,9 85,9 85,9
Контроль Проба 2 85,8 85,7 86,1 0,0±0,4
Проба 3 86,1 85,6 85,8
Анализ показал, что после твердофазного культивирования исследуемых микромицетов на опилках при температуре 30°С убыль лигнина в них на 8 сут. достигает 9-10%.
По сравнению с убылью лигнина при культивировании на опилках штаммов бази-диомицетов (до 50% за 10 суток) [12] показатель, полученный в наших опытах, относительно невысок. Однако применение бази-диомицетов в промышленном масштабе невыгодно в связи со сложностью их культивирования и поддержания в активном состоянии и требовательностью к составу питательных сред. Микромицеты, в частности исследуемые нами, в этом плане выгодно отличаются от базидиомицетов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Для утилизации древесных отходов на территории лесных хозяйств и деревообрабатывающих предприятий нами предлагается их переработка методом компостирования с внесением в компостную смесь заквасок, содержащих микроорганизмы-биодеструкторы древесины.
В экспериментальной части работы из природных субстратов - вероятных источников биодеструкторов древесины - было выделено 70 культур микромицетов и 42 культуры бактерий. Отработана методика скрининга целлюлозо- и лигнолитических штаммов микроорганизмов. Выбраны две культуры микромицетов, относящихся к родам Fusarium и Aspergillus.
Определена убыль лигнина опилок при твердофазном культивировании исследуемых штаммов. Для микромицета Fusarium sp. она
составила на 8 сут. 10,2%, для Aspergillus sp. - 9,4%.
Таким образом, в работе показана принципиальная возможность применения природных штаммов микромицетов для биоконверсии древесных отходов методом компостирования.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. О состоянии окружающей природной среды Кировской области в 2005 году. Киров: ООО «Триада плюс», 2006.
2. Свиридова О.В., Воробьев Н.И., Петров В.Б. Микробиологическая деструкция древесных отходов и вовлечение лигнинсодержащих компонентов в агроэкосистему // Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии: Материалы науч. конф.: М.: МАКС Пресс, 2004.
3. Teather R.M., Wood P.J. Use of congo-red polysaccharide interaction in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen // Appl. Environ. Microbiol. 1982. V. 43.
4. Соловьева И.В., Окунев О.Н., Вельков В.В. и др. Получение и свойства мутантов Penicillium verruculosum - суперпродуцентов целлюлаз и ксиланаз // Микробиология, 2005. Т. 74, №2.
5. Методы экспериментальной микологии. Справочник / Под ред. В.И. Билай. Киев: Наук. думка, 1982.
6. Рипачек В. Биология дереворазрушающих грибов / Пер. с чеш. М.: Лесн. пром-ть, 1967.
7. Оболенская А. В. Лабораторные работы по химии древесины и целлюлозы: Учеб. пособие. М.: Экология, 1991.
8. Блажей А., Шутый Л. Фенольные соединения растительного происхождения. М.: Мир, 1977.
9. Саттон Д. Определитель патогенных и условно патогенных грибов. Пер. с англ. / Д. Саттон, А. Фотергилл, М. Ринальди. М.: Мир, 2001.
10. Литвинов М.А. Определитель микроскопиче- 12. Рабинович М.А., Болобова А.В., Кондращен-ских почвенных грибов. М.: Наука, 1969. ко В.И. Теоретические основы биотехнологии
11. Билай В.И. Аспергиллы. Киев: Наук. думка, древесных композитов. Кн. 1: Древесина и раз-1988. рушающие ее грибы. М.: Наука, 2001.
BIOCONVERSION OF WOOD WASTES BY A METHOD OF COMPOSTING WITH RECEIVING ORGANIC FERTILIZER
© 2009 N.S. Mokrushina, T.S. Tarasova, I.V. Darmov
Vjatka State University, Kirov
Nowadays the problem of recycling waste products in forestlogging and woodworking industries is actual. In Russia annual volume of waste products in these industries reaches 100 millions cubic metres. The way of the conversion wood wastes is known as bioconversion by a method of composting. Not only depuration of ecosystems take place at composting wood wastes, but also a useful product - an organic fertilizer - is produced. The microbial leavens including microorganisms-destructors of the cellulose and lignin which are the main biopolymers of wood are use for speeding-up the process of composting. In that work from natural sources (rotten wood, timber ground, compost and others) there were chosen 112 cultures of microorganism which were probable biodestruc-tors of wood, 70 cultures of them were micromycetes and 42 cultures were bacteria. The methods for carrying out screening cellulose- and lignolytic strains of microorganisms were chosen and tried. With the help of worked out methods two strains of micromycetes were chosen amongst 112 under investigation cultures. These micromycetes were identified as Fusarium sp. and Aspergillus sp. The loss of lignin quantity in sawdust at solid-phase cultivation on them under investigation strains was defined on 8th day: for micromycete Fusarium sp. - 10,2 percent, for micromycete Aspergillus sp. -9,4 percent. These strains were found perspective for inclusion in composition of the biopreparation for speeding-up composting of wood wastes.
Key words: bioconversion, wood dusts, organic fertilizer.
