CC BY
39
безопасность новых протекторов острой экзогенной гипоксии
УДК 616-001.8:615.355
© Д. В. Сосин1, А. В. Евсеев1, П. Д. Шабанов2
1 Смоленская государственная медицинская академия Минздрава РФ;
2 Военно-Медицинская академия им. С. М. Кирова, Санкт-Петербург
Ключевые слова:
металлокомплексные антигипоксанты; острая токсичность; эффективность; терапевтический индекс; мыши.
Резюме:_
В статье представлены результаты изучения показателей острой токсичности и безопасности селенсо-держащих металлокомплексных соединений жЦ1983, п02170, обладающих высокой эффективностью при коррекции остро нарастающих гипоксических состояний после введения веществ мышам внутрибрюшинно или внутрь. Установлено, что по показателю LD50 оба изученных вещества являются высокотоксичными соединениями. В соответствии с величинами средних эффективных доз и расчетами терапевтических индексов вещество жЦ1983 может быть рекомендовано для проведения доклинических исследований.
Известно, что здоровый организм нередко подвергается воздействию экзогенных форм острой гипоксии [9, 14]. Экзогенная гипоксия может возникать в ходе эксплуатации летательных аппаратов, подводных лодок, при отказе систем, обеспечивающих подачу или регенерацию воздуха обитаемых замкнутых пространств [9]. В связи с этим очевидна актуальность проблемы разработки мероприятий по профилактике и лечению последствий формирования в тканях состояния нарастающего кислородного дефицита.
В качестве протекторов острых гипоксических состояний допускается возможность применения фармакологических веществ, способных оказывать модулирующее действие на динамику течения метаболических процессов в тканях, имеющих высокий уровень энергопотребления [2, 3, 9]. Достижения современной фармакологии в данной области медицины нередко подвергаются обоснованной критике в связи с высокой токсичностью многих предлагаемых для изучения антигипоксических средств.
В последнее время реально достижимые перспективы решения проблемы защиты организма от вызываемых острой гипоксией осложнений связывают с веществами металлокомплексной структуры. Молекула такого рода соединения обычно включает в себя какой-либо переходный металл, а также лиганд (один или несколько) биологического происхождения (витамины, биологически активные вещества и близкие к ним по структуре соединения) [13].
Наши ранние исследования показали, что наиболее активными протекторами острых гипоксических состояний из числа изученных металлокомплексов являются 2 вещества под лабораторными шифрами яф1983, яф2170, содержащие помимо металла ^п2+) в структуре биологического лиганда атом селена (табл. 1).
Следует отметить, что оба названных соединения на фоне развития у животных острой экзогенной гипоксии проявили себя как истинные антигипоксанты, причем их эффект отмечали не только после внутрибрюшинного (в/б) введения, что характерно для многих известных антигипоксических средств, но также после введения внутрь [7]. В частности, вещества яф1983 и яф2170, введенные через зонд внутрижелудочно, повышали устойчивость лабораторных животных к острой гипоксии в 2 и более раз [8]. Тем не менее, настораживающим фактом явилось обнаружение случаев гибели мышей на фоне применения указанных веществ, особенно после их в/б введения.
Целью работы явилось получение данных о средних летальных и средних эффективных дозах селен-содержащих металлокомплексных веществ я^1983, яф2170 для расчета их терапевтических индексов и установления уровня безопасности.
методика
Опыты выполнены на 78 мышах-самцах линии CBF1 массой 20-30 г. Животных делили на 9 групп по 8-10 мышей в каждой. Первые 4 группы были использованы для определения LD50 и ED50 после введения вещества яф1983 в/б и внутрь. Другие 4 группы использовали для изучения аналогичных эффектов вещества яф2170. 9-я группа — являлась группой контроля для изучения выносливости мышей, находившихся в условиях остро нарастающей гипоксии. Перед применением веществ их разводили в 0,3 мл 0,9 % р-ра натрия хлорида. Введение внутрь осуществляли через эластичный пластиковый зонд с поперечным сечением 1,5 мм и длиной 15 мм.
Средние летальные (LD50) и средние эффективные (ED50) дозы селенсодержащих металло-комплексных соединений определяли с помощью экспресс-метода В. Б. Прозоровского и соавт. [4]. В ходе исследования после ориентировочной оцен-
Таблица 1. Общая структура селенсодержащихметаллокомплексных соединений nQ1983, nQ2170
Шифр вещества Металл Лиганд, модифицированный селеном Дополнительный лиганд
лД1983 Zn2+ 3-Гидрокси-2-этил-5-метилпиридин нет
лД2170 Zn2+ Ацетальдегид Ацетальдегид
ки эффективной дозы вещества каждую группу животных подвергали воздействию 4 или более последовательных доз из числа приведенных в 1 -й строке таблицы 2. Указанные дозы соответствовали логарифмам 1,0; 1,1; 1,2; ... 1,9. Выбор шкалы был обусловлен тем, что величины приведенного в ней порядка наиболее часто применяются в практике испытаний лекарственных веществ.
Необходимо подчеркнуть, что реальные дозы могут отличаться от предложенных дозировок в 10 100, 1000 раз и более. Так, например, дозы 10,0 12,6; 15,8 ... и т. д. могут быть прочитаны как 1,00 1,26; 1,58 ... или же — 100; 126; 158 .... При этом порядок установленных LD50 и ED50 кратно меняется.
Искомые величины и размах их отклонений (пределы ошибки) находили на пересечении горизонтальной строки таблицы, включающей полученный результат, и вертикальной колонки, соответствующей 1-й испытанной дозе.
Уровень летальности во всех группах подопытных животных оценивали спустя 24 ч после введения селенсодержащих металлокомплексных соединений.
Для определения ED50 в качестве тестирующей модели гипоксии был использован широко применяемый в скрининговых исследованиях способ моделирования — острая гипоксия с гиперкапнией (ОГ+Гк) [1]. Инкубационный период (время от мо-
мента введения вещества в организм до момента помещения животного в условия ОГ+Гк) составил 60 мин вне зависимости от способа введения. Ан-тигипоксический эффект вещества констатировали при условии увеличения продолжительности жизни животных, подвергавшихся воздействию ОГ+Гк, не менее чем на 50 % в сравнении с группой контроля.
В последующем полученные результаты использовали для расчета так называемого «терапевтического индекса». Терапевтический индекс (LD50/ED50) дает представление о фармакологической широте лечебного действия вещества. Данный показатель был предложен П. Эрлихом в качестве критерия оценки безопасности химического соединения еще в 1913 г. В отличие от показателя LD„., отношение
50
LD50/ED50 позволяет сделать заключение о допустимости применения химического соединения в медицинских целях даже при условии его высокой токсичности [5, 11, 12].
результаты исследования
Началом исследования явилось установление средней летальной и средней эффективной доз вещества я^1983 при различных способах его введения.
■ Таблица 2. Параметры ED5g и ED5g и размах отклонений (средних ошибок) при использовании в опыте 4 или 5 пар мышей
■
Последовательность результатов ДОЗА, мг/кг
10,0 12,6 15,8 20,0 25,0 31,6 39,8 50,1 63,1 79,4
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
(0)0121* 14,6 11-20 18,4 13-25 23,1 17-32 29,0 21-40 36,8 26-50 46,0 33-63 58,0 42-80 73,0 53-100 92,0 67-127 116,0 84-160
(0)0122 * 12,9 11-15 16,3 14-19 20,5 18-24 25,8 22-30 32,5 28-38 41,0 35-47 51,5 45-59 65,0 56-75 81,5 71-94 103,0 88-118
0022 14,1 12-17 17,8 16-20 22,4 19-25 28,2 24-32 35,5 31-40 44,7 39-51 56,4 49-64 70,8 62-80 89,0 78-102 112,0 98-127
0111** 17,1 12-25 21,6 15-32 27,2 18-40 34,2 23-51 43,0 29-64 54,2 37-80 68,2 46-101 86,0 58-127 108,0 73-160 136,0 92-202
0112 14,1 11-17 17,8 16-20 22,4 18-27 28,2 23-34 35,5 29-42 44,7 37-53 56,4 47-67 70,8 59-84 89,0 75-106 112,0 84-126
0212 12,9 10-16 16,3 13-20 20,5 17-25 25,8 21-32 32,5 26-40 41,0 33-50 51,5 42-63 65,0 53-80 81,5 66-100 103,0 84-126
1012 13,7 10-19 17,2 13-24 21,8 16-30 27,4 20-38 34,6 25-48 43,5 32-60 54,7 40-75 69,0 50-95 87,0 63-120 109,0 80-150
1022 12,0 10-15 15,0 12-19 19,0 15-24 23,9 19-30 30,0 24-38 37,9 30-47 47,7 38-60 60,0 48-74 75,5 60-95 95,0 76-119
1112** 11,8 8-17 14,8 10-21 18,7 13-27 23,5 16-34 29,6 21-43 37,2 26-54 47,0 33-68 59,0 41-85 74,3 52-107 93,5 65-135
* — оценка LD50 и Ей50 проводится по 2-му нулю; 1-й ноль не учитывается, его определение необходимо для отличия от результата 1012; ** — достоверность средних LD50 и ED50 по большей из ошибок р = 0,07. Достоверность прочих значений LD50 и ED„ < 0,05 50 '
Для определения LD50 вещества nQ1983, введенного в/б, субстанцию инъецировали 4 парам мышей в дозах 79,4; 100,0; 126,0 и 158,0 мг/кг. По истечении 24 ч результат составил последовательность 0122, которая отражала летальность животных в соответствующих парах. Согласно данным специализированных таблиц, LD50 вещества nQ1983, введённого парентерально, была 103,0 мг/кг, что, согласно критериям токсичности химических веществ [5, 11, 12], требует отнесения данного соединения к категории высокотоксичных (15-150 мг/кг).
Определение LD50 вещества nQ1983 после введения его внутрь проводилось в дозах 100,0; 126,0; 158,0 и 200,0 мг/кг (4 пары). Спустя 24 ч летальность животных составила последовательность 0022, что, согласно табличным данным, соответствовало дозе 178,0 мг/кг.
Таким образом, анализ результатов исследования по показателю LD50 потребовал отнесения вещества nQ1983 к категории высокотоксичных химических соединений.
С целью установления ED50 nQ1983, вводимого в/б, вещество инъецировали 5 парам мышей (потребовалась дополнительная пара) в дозах 15,8; 20,0; 25,0; 31,6 и 39,8 мг/кг. По завершении периода инкубации (60 мин) животных помещали в условия ОГ+Гк. Ожидаемый антигипоксический эффект (увеличение продолжительности жизни мышей на 50 % и более) был зафиксирован в следующей последовательности результатов — 0/0121. В соответствии с данными специализированных таблиц было установлено, что ED50 вещества nQ1983 составляет 29,0 мг/кг, а терапевтический индекс (LD50/ED50) — 3,6.
Для определения ED50 nQ1983, примененного per os, вещество вводили 4 парам мышей в дозах 20,0; 25,0; 31,6 и 39,8 мг/кг. По завершении периода инкубации животных помещали в условия гипоксии. Последовательность результатов этой серии опытов составила 0112. Итогом явилось установление средней эффективной дозы вещества nQ1983, введенного внутрь, — 28,2 мг/кг. Терапевтический индекс в этом случае составил 6,3.
Очередным этапом исследования явилось определение показателей средних летальных и средних эффективных доз вещества nQ2170 введенного в/б или внутрь.
Установление LD50 вещества nQ2170, примененного в/б, потребовало его введения 4 парам мышей в дозах 39,8; 50,1, 63,1 и 79,4 мг/кг. Через 24 ч летальность животных в этой группе составила последовательность результатов 0022. В соответствии с данными, полученными из специализированных таблиц В. Б. Прозоровского и соавт., было установлено, что LD50 для вещества nQ2170 составляет 56,4 мг/кг.
LD50 вещества nQ2170, введенного мышам внутрь, была изучена также на 4 парах мышей в дозах: 50,1; 63,1; 79,4 и 100,0 мг/кг. Спустя 24 ч летальность животных имела последовательность 0112.
Исходя из табличных данных, LD50 при указанном способе введения вещества составила 70,8 мг/кг.
Исходя из полученных результатов, вещество nQ2170, так же как и вещество nQ1983, следует отнести к группе высокотоксичных химических соединений. Необходимо отметить, что по уровню токсичности вещество nQ2170 после в/б введения превосходило вещество nQ1983 в 1,8 раза, а после введения внутрь — в 2,5 раза.
Для выявления показателя ED50 вещества nQ2170 потребовалось 5 пар мышей для доз 15,8; 20,0; 25,0; 31,6 и 39,8 мг/кг По завершении периода инкубации и последующих опытов в условиях ОГ+Гк результат составил — 0/0122. Из специализированных таблиц было установлено, что ED50 вещества nQ2170 соответствует 25,8 мг/кг при терапевтическом индексе 2,2.
Определение ED50 вещества nQ2170, введенного внутрь, было выполнено на 4 парах животных в дозировках, аналогичных ранее использованным для в/б введения, а именно — в дозах 15,8; 20,0; 25,0; 31,6 и 39,8 мг/кг. По завершении периода инкубации и воздействия ОГ+Гк последовательность результатов составила 0022. В этом случае ED50 была порядка 22,4 мг/кг, а отношение LD50/ED50 равнялось 3,1.
Таким образом, выполненные для обоих способов введения веществ расчеты терапевтического индекса вновь подтвердили более высокий уровень токсичности вещества nQ2170 в сравнении с веществом nQ1983.
обсуждение результатов
По итогам выполненного исследования вещество nQ2170, в отличие от вещества nQ1983, было признано потенциально опасным химическим соединением, что, несмотря на обнадеживающие результаты ранее проведенных исследований, исключает возможность его дальнейшего продвижения в качестве перспективного протектора острых гипоксических состояний.
Как известно, потенциально опасными принято считать химические соединения, способные вследствие своих физических, химических, биологических или токсикологических свойств, оказывать вредное влияние на здоровье людей. Классификация потенциально опасных химических соединений включает в себя: 1) воспламеняющиеся вещества — обычно газы; 2) окисляющиеся вещества — поддерживающие горение или же способствующие воспламенению; 3) горючие вещества — жидкости, газы, пыли, способные самовозгораться; 4) взрывчатые вещества; 5) токсичные вещества — способные в средних смертельных дозах приводить живые организмы к гибели; а также 6) вещества, представляющие опасность для окружающей среды [6]. Таким образом, в соответствии с целью настоящей работы, интерес представляла 5-я позиция классификации.
Выбор метода В. Б. Прозоровского и соавт. для оценки уровня токсичности веществ был обусловлен наличием у него ряда преимуществ в сравнении с классической методикой. В частности, предоставлялась возможность получения удовлетворительных по критерию точности результатов при использовании сравнительно малого количества лабораторных животных. Другим достоинством метода являлась простота процедуры определения показателей "Ас и ^50.
Как было установлено, вещества я^1983 и яф2170 по показателю LD50 относятся к категории высокотоксичных химических соединений, представляющих опасность для здоровья человека. Тем не менее, это не может являться категорическим противопоказанием для их возможного применения в медицинских целях. В первую очередь, это касается вещества яф1983. Данное заключение основано на сопоставлении показателя LD„ с пока-
50
зателем ED50 и последующим расчетом терапевтических индексов. Терапевтический индекс вещества яф1983 составил 3,6 после парентерального введения и 6,3 после энтерального применения вещества. Известно, что невозможность применения высокотоксичного вещества с лечебной целью внутрь или парентерально по общепринятым стандартам ограничивается терапевтическим индексом 3 и менее [5]. Последнее позволяет отнести вещество яф1983 к группе перспективных для исследования антигипоксантов и продолжить изучение его фармакологических свойств.
Следует отметить, что в химическом отношении вещество яф1983 [7] — гексакис (3-гидрокс и-2-этил-6-метилпиридинато) [трис (дибензил-диселенидо)] дицинк (II) пентадекасемигидрат представляет собой комплексное соединение замещённого 3-гидроксипиридина и диорганодихаль-когенида, содержащего в качестве переходного металла Zn2+. В настоящий момент, авторская заявка на изобретение, поданная в Федеральную службу по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам, зарегистрирована и получила положительное решение. Формула вещества яф1983: (11)]2А6В3.15,5Н20 (рис. 1).
■ Рисунок 1. Элементы «А» и «В» в составе молекулы селенсодержащего металлокомплексного (Zn2+) соединения Q1983: [Zn(H)]2AeB3.15,5H2O
В свою очередь вещество nQ2170, при экспериментально доказанном и подтвержденном показателями LD50 высоком уровне его токсичности, имело относительно низкие терапевтические индексы — 2,2 (в/б) и 3,1 (внутрь). Тем не менее, интересно отметить, что и для вещества nQ2170 уровень безопасности был выше после его введения внутрь, в сравнении с внутрибрюшинным способом введения.
выводы
Вещество nQ2170 является потенциально опасным химическим соединением, что исключает возможность его дальнейшего продвижения в качестве потенциального протектора острых гипоксических состояний.
Вещество nQ1983 после внутрибрюшинного введения и введения внутрь, несмотря на высокие показатели острой токсичности (LD50), согласно рассчитанным терапевтическим индексам — 3,6 (внутрибрюшинно) и 6,3 (per os), может быть рекомендовано для последующих доклинических исследований.
литература
1. Методические рекомендации по экспериментальному изучению препаратов, предлагаемых для клинического изучения в качестве антигипоксических средств / Под ред. Л. Д. Лукьяновой. — М., 1990. — 19 с.
2. Неотложная медицинская помощь: Пер. с англ. / Под ред. Дж. Э. Тинтиналли, Р. Л. Кроума, Э. Руиза. — М.: Медицина, 2001. — 1033 с.
3. Новиков В. Е., Понамарева Н. С., Коханов К. В. Влияние антигипоксантов на потребление кислорода животными при черепно-мозговой травме // Эксперим. клинич. фармакология. — 2008. — № 1. — С. 46-48.
4. Прозоровский В. Б., Прозоровский М. П., Демченко В. М. Экспресс метод определения средней дозы и её ошибки // Фармакол. токсикология — 1978. — № 4. — С. 497-502.
5. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общ. ред. Р. У. Хабриева. 2-е изд. — М.: ОАО «Медицина», 2005. — 832 с.
6. Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества: классификация и общие требования безопасности. — ГОСТ 12.1.007-76.
7. Сосин Д. В., Парфёнов Э. А., Евсеев А. В. и др. Антигипоксическое средство // Заявка на патент № 2011148565 (072836) от 29.11.11. — Положительное решение от 27.06.12.
8. Сосин Д. В., Евсеев А. В., Парфенов Э. А., Правдив-цев В. А. Шабанов П. Д. Антигипоксическое действие металлокомплексных селенсодержащих веществ при различных способах введения // Всест. Смоленской гос. мед. академии. — 2012. — № 2. — С. 34-40.
9. Шабанов П. Д., Зарубина И. В., Новиков В. Е., Цыган В. Н. Метаболические корректоры гипоксии. Под ред. А. Б. Бе-левитина. — СПб.: Информ-Навигатор, 2010. — 912 с.
10. Fleming D. O., Hunt D. L. Biological Safety: principles and practices. — Washington, DC: ASM Press. — 2000. — 267 p.
11. Gable R. S. Acute toxicity of drugs versus regulatory status / J. M. Fish (Ed.) // Drugs and Society: U. S. Public Policy. — Rowman & Littlefield Publishers, 2006. — P. 149-162.
А
B
12. Katzung B. G., Trevor A. J., Masters S. B. Katzung & Trevor's Pharmacology Examination & Board Review. 9th edition. — McGraw-Hill Lange, 2010. — 640 p.
13. ParfenovE. A., ZaikovG. E. Biotic Type Antioxidants: The Perspective Search Area of Novel Chemical Drugs // PSV. — Utrecht-Boston-Tokyo, 2000. — P. 559.
14. Rabalais N., Turner R. E., Justic D. et al. Characterization of Hypoxia: Topic 1. Report for the Integrated Assessment on Hypoxia in the Gulf of Mexico. Ch. 3 // NOAA Coastal Ocean Program, Decision Analysis Series. — 1999. — N15. — 185 p.
safety of new substances with protective activity in acute exogenous hypoxia
Sosin D. V., YevseyevA. V., Shabanov P. D.
♦ Summary: In the article are represented results of both acute toxicities and safety determination of selenium-containing metal-complex substances nQ1983, nQ2170 that have high pharmacological activities in acute exogenous hypoxia after their introperitoneal or enteral introductions in mice. According with established parameters LD50 the couple of studied substances must be referred to the category of high toxic chemical agents. However, substance nQ1983 can be recommended for its preclinical investigation because it has enough permissible parameters of ED50 and therapeutic indexes.
♦ Key words: metal complex substances; acute toxicity; activity; therapeutic index; mice.
♦ Информация об авторах
Сосин Денис Владимирович — к. м. н., доцент кафедры нормальной физиологии. ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» Минздравсоц-развития РФ. 214019, Смоленск, ул. Крупской, д. 28. E-mail: hypoxia@yandex.ru.
Евсеев Андрей Викторович — д. м. н., профессор, профессор кафедры нормальной физиологии. ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» Минздрав-соцразвития РФ. 214019, Смоленск, ул. Крупской, д. 28. E-mail: hypoxia@yandex.ru
Шабанов Петр Дмитриевич — д. м. н., профессор, заведующий кафедрой фармакологии Военно-медицинской академии им. С. М. Кирова. 194044, Санкт-Петербург, ул. Акад. Лебедева, д. 6. E-mail: pdshabanov@mail.ru.
Sosin Denis Vladimirovich — PhD (Physiology, Pharmacology), Assistant Professor, Dept. Of Normal Physiology, Smolensk State Medical Academy. 214019, Smolensk, Krupskaya St., 28. E-mail: hypoxia@yandex.ru.
Yevseyev Andrey Viktorovich — D.Sci. (Pharmacology, Physiology), Professor, Dept. of Normal Physiology, Smolensk State Medical Academy. 214019, Smolensk, Krupskaya St., 28. E-mail: hypoxia@yandex.ru
Shabanov Petr Dmitriyevich — D.Sci. (Pharmacology), Professor and Head, Dept. of Pharmacology, S. M. Kirov Military Medical Academy. 194044, St.- Petersburg, Acad. Lebedev St., 6. E-mail: pdshabanov@mail.ru.
