Бетацианины корнеплодов красной столовой свеклы Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

УДК 543.421/424:543.544

БЕТАЦИАНИНЫ КОРНЕПЛОДОВ КРАСНОЙ СТОЛОВОЙ СВЕКЛЫ 1

В работе методом ВЭЖХ и спектрофотометрическим методом исследован, беталаиновый состав корнеплодов восьми сортов красной столовой свеклы, Beta vulgaris L. («Красный шар», «Мулатка», «Цилиндра», «Кубинка», «Тема Потема», «Голландская», «Цыганочка» и «Бор-до»^. Наивысший уровень накопления суммы бетанина и изобетанина найден для сорта «Красный шар» (195 мг/100 г ± 12%), а наивысший уровень накопления бетаксантинов (в пересчете на вульгаксантин-I) обнаружен в корнеплодах сорта «Цилиндра»

(45 мг/100 г ± 12%). Обнаружено, что часть бетаксантинов при стоянии превращается в бетанин.

Ключевые слова: ВЭЖХ, спектрофотометрия, бетацианины, бе-таксантины, Beta vulgaris, сорта.

И.И. Саенко О. В. Тарасенко В.И. Дейнека Л.А. Дейнека

Белгородский государственный национальный исследовательский университет,

Россия, 308015, г. Белгород,

ул. Победы, 85

E-mail: deineka@bsu.edu.ru

Введение

Среди плодов, листьев и др. частей растений, окрашенных в красные тона, можно найти такие, окраска которых обусловлена биосинтезом соединений из класса флавоноидов - антоцианов. При этом ряд объектов может иметь близкую окраску, обусловленную присутствием в тканях принципиально иных природных колорантов -бетацианинов [1, 2]. Не удивительно, что даже в научной литературе встречается путаница - в фитолакке определяют антоцианы [3], хотя в этом растении синтезируются исключительно бетацианины [4], а к настоящему времени не найдены растительные объекты, содержащие одновременно и бетацианины и антоцианы.

Предложено несколько схем биосинтеза бетациа-нинов, одна из которых приведена на рисунке 1 [4, 5].

Рис.1. Схема биосинтеза бетацианинов

O

R

1 Исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ «Государственное задание вуза на 2012 г., проект 3.1785. 2011 г.

Начальным субстратом в данной схеме является тирозин (I), хотя его может заменить и тиронин. I на первой стадии под действием фенолоксидазы (медьсодержащего бифункцонального фермента) окисляется до ДОФА (3,4-дигидроксифенилаланин, II). Далее II превращается по трем направлениям, в одном из которых под действием того же фермента образуется хинон III (dopaquinone), а другая часть II превращается в секо-производное IV (4,5-seco-DOPA). Третье направление связано с декарбоксилированием II и с рядом соответствующих метаболитов. Далее III самопроизвольно циклизуется до производного дигидроиндола V (cyclo-DOPA), а IV также самопроизвольно преобразуется в беталамовую кислоту VI. Объединение двух фрагментов по самопроизвольной реакции приводит к синтезу бетанидина (VII), который под действием бетанидин 5-О-глюкозилтрансферазы превращается в бетанин (VIII). Конденсация беталамовой кислоты с другими аминокислотами IX приводит к синтезу бетаксантинов (X). Среди приведенных на схеме веществ с красной окраской (бетацианинов) обладают соединения VII и VIII, а соединения типа X (у которых отсутствует дополнительная делокализация на ароматическом кольце дигидроиндольного фрагмента) имеют желтую окраску и называются бетаксантинами. Сумма этих пигментов в англоязычной литературе называется беталаинами. Отметим, что в корнеплодах золотистой свеклы - разновидности красной, B. vulgaris var. lutea [6], основной компонент, отвечающий за окраску - вуль-гаксантин-I (XI), рис. 2. Наконец, в сумме красных пигментов присутствует изомер VIII, - изобетанин, XII [7].

Рис.2. Дополнительные компоненты пигментного комплекса свеклы

Бетацианины помимо красящей способности обладают широкой и разнообразной биологической активностью благодаря высоким антиоксидантным свойствам: способствуют расщеплению и усвоению белков пищи [8], активно участвуют в образовании холина, повышающего жизнедеятельность клеток печени, ингибируют процессы пролиферации раковых клеток, препятствуя возникновению злокачественных опухолей [2] и т.д.

К одним из важнейших овощных растений нашего региона, богатых именно бе-тацианинами, относится красная столовая свекла, Beta vulgaris L., издавна выращиваемая как на промышленных плантациях, так и на частных огородах. За многие годы усилиями селекционеров создано множество разнообразных сортов, но информация об уровне накопления бетацианинов в них в доступной нам литературе не обнаружена.

Целью работы явилось исследование уровня накопления бетацианинов в нескольких сортах красной столовой свеклы, доступных на рынке Белгорода.

Материалы и методы исследования

Для обобщенного количественного определения беталаиновых пигментов использовали спектрофотометрический метод. Навеску мелко измельченной свеклы в диапазоне 0.50-1.00 г исчерпывающе (до обесцвечивания исходного материала) экстрагировали порциями 2 % раствора муравьиной кислоты в воде при гомогенизации в фарфоровой ступке под слоем экстрагента; порции фильтровали через бумажный фильтр и собирали в мерной колбе объемом V, мл, доводя до метки экстрагентом.

Фильтрат фотометрировали относительно экстрагента в кварцевых кюветах при X = 400-700 нм (спектрофотометр СФ-56). Суммарное содержание бетацианинов,

он

он н он

XII

а1 (мг/г), определяли (в пересчете на бетанин), используя коэффициент молярного погашения 8=60000 [7] при Amax по формуле:

А(535нм) V ■ М -1000

а = —-----------------------, мг/г

8(535нм) ■I 1000■т

где: A(535нм) - оптическая плотность раствора в максимуме абсорбции бетациани-

нов;

81(535нм) - коэффициент молярного погашения бетацианинов на этой длине волны;

l - длина оптического пути, см;

V - объём экстракта, мл,

M - молярная масса бетанина, 550 г/моль, m - масса навески, г.

Для количественного определения бетаксантинов, а2 (мг/г), в пересчете на вульгаксантин I с коэффициентом молярного погашения 8=48000 [7], использовали абсорбцию экстракта на двух длинах волн по формуле, учитывающей остаточное поглощение бетаксантинов при 469 нм:

А(469нм) - к ■ А(535нм) V ■ М -1000

а = —----------------------------------, мг/г,

82 (469нм) ■I 1000■т

где: A(469нм) - оптическая плотность раствора в максимуме абсорбции бетаксанти-

нов;

A(535нм) - оптическая плотность раствора в максимуме абсорбции бетациани-нов;

k = 81(4б9нм)/81(535нм) - коэффициент пересчета, принятый в настоящей работе равным 0.323;

82(469нм) - коэффициент молярного погашения бетацианинов при 469 нм; l - длина оптического пути, см;

V - объём экстракта, мл,

M - молярная масса вульгаксантина I, 339 г/моль, m - масса навески, г.

Для разделения комплекса беталаинов на бетацианины и бетаксантины использовали метод твердофазной экстракции на патронах ДИАПАК С18. Экстракты пропускали через подготовленный активацией ацетоном и кондиционированием экстрагентом патрон. Первые порции элюата имели желтую окраску и содержали практически не сорбирующиеся в использованных условиях бетаксантины. Пропускание экстракта прекращали до начала проскока бетацианинов. Патрон промывали небольшой порцией экстрагента (5-15 мл) для удаления бетаксантинов - до исчезновения желтой окраски элюата. Бетацианины десорбировали раствором, содержащим 50% ацетонитрила и 2 % муравьиной кислоты (по объему) в воде.

Результаты исследования и обсуждение

Бетаксантины и бетацианины обладают разными размерами систем сопряженных двойных связей, и, как следствие, различными электронными спектрами поглощения. Добавление ароматического кольца дигидроиндольного фрагмента при переходе от бетаксантинов к бетацианинам приводит к батохромному смещению максимумов абсорбции от 469 нм до 535 нм. Поэтому в исходном экстракте обычно обнаруживается наличие двух перекрывающихся полос; причем, как следует из полученных в настоящей работе результатов соотношение между бетацианинами и бетаксантина-ми различно для различных сортов свеклы, (рис. 3).

Для использования литературных значений коэффициентов молярного погашения (£у, 1-го компонента на ./-ой длине волны) аналитов для количественного определения их концентрации (с) в сложных смесях необходимо убедиться в отсутствии перекрывания полос абсорбции при аналитической длине волны, или учесть вклад каждого из компонентов (по методу Фирордта): для л-компонентной смеси задача

может быть решена определением суммарной абсорбции (А,) при (минимум) л различных аналитических длинах волн, решением системы линейных уравнений:

А1 = 811 ■ С1 + 821 ■ С2 + ••• + 8п1 ■ Сп А2 = 812 ■ С1 + 822 ■ С2 + ••• + 8п2 ■ Сп

An = 8ln • Cl +82n • C2 + ••• + 8nn • C

Рис.3. Спектры экстрактов корнеплодов некоторых сортов красной столовой свеклы: Сорта Beta vulgaris L.: 1 - «Красный шар»; 2 - «Мулатка»; 3 - «Цилиндра»; 4 - «Кубинка»; 5 - «Тема Потема»; 6 - «Голландская», 7 - «Цыганочка»; 8 - «Бордо»

Анализ спектров бетаксантинов и бетацианинов проводили после их разделения методом твердофазной эктракции на патронах ДИАПАК Сі8. Спектры несорбиро-ванной части экстракта, содержащей желтые пигменты (бетаксантины), представлены на рис. 4. Полнота извлечения в этой фракции бетаксантинов подтверждается отсутствием соответствующей полосы абсорбции в спектрах очищенных бетацианинов, рис. 5.

0 . 7

О . 6

0.5

О . 4

Й 0.3

0.2

0.1

0 . 0

400 500 600 700

Длина волны, нм

Рис. 4. Спектры бетаксантинов. Номера сортов см. рис. 1

Спектры бетаксантинов экстрактов всех исследованных сортов свеклы оказались однотипными (в смысле совпадения в нормированном виде), что не удивительно для соединений, в которых цепь сопряжения заканчивается на атоме азота иминного

типа. И хотя иминная составляющая бетаксантинов может быть различной, расчет удобно производить на один конкретный бетаксантин, в качестве которого можно использовать, например, вульгаксантин I. При этом интенсивность полосы абсорбции бетаксантинов после максимума при 469 нм с ростом длин волн быстро уменьшается. Однако на спектрах обнаруживается небольшое количество некоторого компонента с параметрами, подобными спектрам бетацианинов. Этот компонент по нашим данным постепенно образуется из желтых исходных веществ: при хранении несорбированной на патроне Сі8 части исходного экстракта чисто желтого цвета через несколько часов раствор приобретает красно-оранжевую окраску. Нам удалось методом ВЭЖХ обнаружить, что образующиеся бетацианины неотличимы от бетанина, поэтому бетациани-ны могут быть определены непосредственно по абсорбции при 535 нм без поправок на другие компоненты.

Спектры бетацианинов всех образцов также оказались подобными, хотя на хроматограммах обнаруживали пики двух изомеров (Сі5 эпимер бетанина, VIII) в разных соотношениях, рис. 6.

Рис. 5. Спектры растворов очищенных бетацианинов. Номера сортов см. рис.1

Рис. 6. Разделение и спектры изомеров бетанина Хроматограммы очищенных экстрактов свеклы сортов А - «Тема» и Б - «Цилиндра»:

1 - бетанин, 2 - изобетанин

Но если бетаксантины не мешают количественному определению бетациани-нов спектрофотометрическим методом, то абсорбция бетацианинов при 469 нм не может считаться пренебрежимо низкой, поэтому система линейных уравнений для спектрофотометрического определения бетацианинов и бетаксантинов при совместном присутствии упрощается:

[.4(535) = £п • с + 0 • с2 4(469) = sl2 • с +£22^ с2

Обобщенный уровень накопления бетацианинов и бетаксантинов в исследованных в настоящей работе сортах Beta vulgaris L. представлен в табл. 1. Разброс в найденных значениях связан с различным уровнем накопления веществ в различных частях одного даже одного и того же корнеплода.

В сорте «Красный шар» бетаксантинов практически не остается, а в корнеплодах сорта «Кубинка» доля желтых пигментов немногим превышает 39 % (от суммы пигментов), хотя максимальный уровень накопления бетаксантинов найден для корнеплодов сорта «Цилиндра».

С использованием метода ВЭЖХ были определено соотношение между бетанином и изобе-танинов в очищенных экстрактах, табл. 2.

Таблица 1

Уровень накопления беталаи-нов в корнеплодах некоторых сортов Beta vulgaris L.

Сорт Содержание компонентов, мг/100 г, ± 12%

VIII* X**

Красный шар 195 0.0

Мулатка 167 17

Бордо 68 25

Цилиндра 143 45

Цыганочка 85 19

Голландская 45 8

Кубинка 33 21

Тема Потема 47 13

Таблица 2

Соотношение основных компонентов бетацианинов в корнеплодах различных сортов красной свеклы

Сорт Бетанин, % Изобетанин, %

Красный шар 73.78 16.24

Мулатка 77.58 17.73

Бордо 86.78 10.36

Цилиндра 71.92 26.15

Цыганочка 55.70 20.53

Голландская 76.21 23.79

Кубинка 74.97 23.04

Тема Потема 84.83 12.34

* - содержание бетацианинов в пересчете на бетанин;

** - содержание бетаксантинов в пересчете на вульгаксантин I

Как видно из представленных данных, соотношение между бетани-ном и изобетанином различно для исследованных сортов свеклы: доля изомера варьирует от 10 до 26 %. Отметим, что отмеченное выше спонтанное превращение желтого пигмента в бетанин может указывать на то, что в цепи метаболизма имеется некоторое гликозилированное соединение с хромофором бетаксантинового типа, которое может далее превращаться в бетанины.

Выводы

Из восьми сортов свеклы красной столовой, выращенной в Белгороде в 2011 году, наивысший уровень накопления бетацианинов найден для сорта «Красный шар», несколько уступают им по данному показателю сорта «Мулатка» и «Цилиндра». Наивысший уровень накопления бетаксантинов обнаружен для корнеплодов сорта «Цилиндра».

Список литературы

1. Бриттон Г. Биохимия природных пигментов: Пер. с англ. - М.: Мир, 1986. - 422 с.

2. Henriette M.C. Betalains: properties, sources, applications, and stability // Intern. J. Food Sci. Technol. - 2009. - V. 44. - P. 2365-2376.

3. Куликов Ю.И., Дадян Н.К. Перспективы использования натурального красителя «Лаконос американский» при производстве колбасных изделий // Вестник СевероКавказского государственного университета. - 2008. - №3 (16). - P. 1997-9541.

4. Kirsten M.H., Florian C.S., Reinhold C. Betalain Stability and Degradation—Structural and Chromatic Aspects//J. Food Sci. - 2006. - V. 71. - P. 41-50.

5. Pavokovic D., Krsnik-Rasol M. Biotechnological Production of Betalains // Food Technol. Biotechnol. - 2011. - V.49. - P. 145-155.

6. Savolainen K., Pyysalo H., Kallio H. The influence of water activity on the stability of vul-gaxanthin I // Z. Lebensm. Unters. Forsch. - 1978. - V.167. - P.250-251.

7. Stitzing F.C., Carle R. Analysis of betalains / In: Food colorants. Chemical and functional properties. Ed. C. Socaciu. CR Press Taylor & Francis Group. 2008. P. 507-520.

8. Bohm H. “Opuntia dülemi” - An Interesting and Promising Cactaceae Taxon // J. Profess. Assoc. Cactus Develop. - 2008. - V.10. - P. 148-170.

BETACYANINS OF RED BEETROOT ROOT

HPLC and spectophotometrical method were used for investigation of red beetroot root, Beta vulgaris L., cultivars («Krasny shar», «Mulatka», «Tsylindra», «Kubinka», «T’oma Pot’oma», «Gollandskaya», «Tsyganochka» and «Bordo»). The upmost level of betanine isomers accumulation has been found for cv. «Krasny shar» (195 mg/100 g ± 12%), while that of betaxanthines (as vulgaxanthin I) has been found for cv. «Cylindra» (45 mg/100 g ± 12%). Some betaxanthine component was determined to gradually convert into betanine.

Key words: HPLC, spectrophotometry, betacyanines, betaxanthines Beta vulgaris, cultivars.