CC BY
32
БЕЛКОВЫЙ БИОЧИП ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ОСТРЫХ РЕСПИРАТОРНЫХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ ЧЕЛОВЕКА
© Клотченко С.А.*, Плотникова М.А., Васин А.В.
ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России, г. Санкт-Петербург
Проект посвящен разработке основных подходов к созданию белкового биочипа для выявления острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ) человека в традиционном формате 96-луночного планшета, который применяется в иммуноферментном анализе, а также оптимизации колориметрической детекции гибридизации, что позволит резко удешевить этот анализ, так как для такой детекции достаточно обычного бытового компьютерного сканера. В результате проведенных исследований был создан универсальный белковый микрочип для определения и типирования ОРВИ. Разработанная тест-система может найти широкое применение как в клинико-диагностических лабораториях медицинских учреждений, так и в поликлинических центрах для быстрого подтверждения или опровержения диагноза заболевания ОРВИ на ранних и более поздних стадиях развития заболевания.
Ключевые слова: острые респираторные вирусные инфекции, иммуноферментный анализ, белковые микрочипы, диагностика point-of-care.
Грипп является одним из наиболее распространенных инфекционных заболеваний со сложным патогенезом. По данным ВОЗ в мире ежегодно регистрируется около 500 миллионов случаев этого заболевания [1]. Смертность от гриппа составляет около 2 миллионов человек, главным образом среди детей до 5 лет и людей старше 65 лет. В России ежегодно регистрируется около 50 миллионов случаев инфекционных заболеваний. До 95 % из них приходится на ОРВИ, включая вирусы гриппа и парагриппа, аденовирусы, риновирус и респираторно-синцитиальный вирус. При этом по данным Федерального центра по гриппу и ОРЗ заболеваемость среди детей в 7-10 раз превышает показатели, регистрируемые в группе взрослого населения. В период пандемии показатели заболеваемости и смертности всего населения существенно возрастают по сравнению с ежегодными эпидемиями.
Помимо вирусов гриппа в структуре заболеваемости ОРВИ достаточно высока также роль возбудителей иной этиологии, среди которых более чем в 20 % случаев выявляются вирусы парагриппа, респираторно-синцитиальный вирус и аденовирусы. При этом циркуляция вирусов парагриппа, РСВ и аденовирусов снижается в период эпидемии, но вновь возрастает в пост-
Старший научный сотрудник, кандидат биологических наук.
10
НОВОЕ СЛОВО В НАУКЕ И ПРАКТИКЕ
пандемический период. Экономический ущерб от ОРВИ можно сравнить лишь с затратами на профилактику и лечение длительно текущих сердечнососудистых и онкологических заболеваний.
Поскольку симптомы заболевания, вызванного новыми вирусами гриппа, особенно на начальных этапах, не отличаются от клинических проявлений, наблюдаемых при других респираторных вирусных инфекциях, включая сезонный грипп, конструирование быстрых и чувствительных тестов дифференциальной диагностики необходимо для надзора за заболеваемостью и назначения своевременной противовирусной терапии. В этой связи особую значимость приобретает совершенствование и развитие современных средств и методов лабораторной диагностики.
При обследовании больших по численности групп людей в целях определения трансмиссии возбудителя в популяции и распознавания атипичных форм гриппозной инфекции, а также для антигенной характеристики циркулирующих вирусов и оценки коллективного иммунитета к патогенам, в настоящее время применяются иммунологические тесты (ИФА и ИХТ). Использование моноклональных антител (МКА), специфичных к ОРВИ различных типов, при конструировании диагностических тест-систем способствует успешному решению проблемы. Кроме того, появляются и развиваются новые высокочувствительные и производительные технологии диагностики, такие как белковые микрочипы.
Потребность практического здравоохранения в белковых биочипах определяется необходимостью проведения исследований клинического материала одновременно у большого количества пациентов. Биочип на определение ОРВИ позволит исследователю параллельно проводить анализ десятков и даже сотен пациентов в течение одного рабочего дня, поэтому такая система может найти широкое применение в медицине и биологии.
Лабораторная диагностика является неотъемлемой частью современной медицины, без которой немыслима полноценная врачебная помощь. Методы лабораторной диагностики довольно многочисленны и продолжают активно развиваться. Широкое применение в клинической диагностике нашли иммунохимические методы, в частности, методы иммуноферментного анализа. На протяжении последних десятилетий наибольшее распространение получили методы твердофазного иммуноферментного анализа, в которых для иммобилизации антител / антигенов используются твёрдые носители, например, полистироловые планшеты, а образовавшиеся иммунокомплексы выявляют с помощью меченых ферментами компонентов анализа. Впервые такой анализ, основанный на использовании ферментов в качестве метки и использовании твердой фазы, провели в 1971 году Энгвал и Перлман [2] и в этом же году независимо от них Ван Веемен и Шурс [3]. Позднее стали раз-
Биологические науки
11
виваться методы иммуноферментного анализа с использованием различных меток - флуорофоров, липосом, наночастиц.
В течение последних нескольких лет в мировой аналитической практике очень интенсивно развиваются методы белковых биочипов, в основе которых лежат те же принципы, что и у традиционных методов иммунологического анализа, таких как ИФА, однако формат биочипа позволяет высокопроизводительно детектировать десятки белков одновременно у нескольких пациентов с использованием малых объёмов реагентов и образцов.
Целью настоящей работы является разработка высокоспецифичного и чувствительного метода диагностики острых респираторных вирусных инфекций человека на основе белкового микрочипа в формате 96-луночного планшета с колориметрической детекцией, а также проведение предварительных испытаний созданной системы на контрольных препаратах, содержащих очищенные концентраты вирусов.
Препараты МКА мыши для создания белкового микрочипа на определение ОРВИ были предоставлены лабораторией биотехнологии диагностических препаратов НИИ гриппа. Препараты представляли собой осаждённые сульфатом аммония белки асцитной жидкости мыши, содержащие МКА. Очистку фракции МКА проводили методами аффинной хроматографии и гель-фильтрации. Результат анализа очищенных препаратов МКА подтверждали методом денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле по методу Лэммли. Очищенный препарат МКА представляет собой две мажорных дорожки - тяжелая цепь антител представлена на уровне ~ 50 кДа, а лёгкая цепь на уровне ~ 25-30 кДа.
На следующем этапе работы было выполнено культивирование, очистка и концентрация вирусов, необходимых для проверки специфичности биочипа. Вирусы гриппа А и В культивировали в аллантоисной полости развивающихся 11-12-дневных куриных эмбрионов в течение 48 ч при 37 °С в случае гриппа А или при 32 °С в течение 72 ч в случае гриппа В. Респираторно-синцитиальный вирус, аденовирусы и вирусы парагриппа культивировали в культуре клеток МА-104 до развития интенсивного ЦПД (цитопатического действия). После накопления вирусные частицы из вируссодержащей культуральной среды или аллантоисной жидкости осаждали и очищали путем ультрацентрифугирования в градиенте сахарозы в три этапа. Осадок ресуспендировали в буфере STE, концентрацию по тотальному белку оценивали методом Лоури. Полученные цельновирионные суспензии разделяли на аликвоты и хранили до исследования при - 80 °С.
Дизайн и печать микрочипа являются нетривиальными задачами и требуют от исследователя знаний из области химии, молекулярной биологии, инженерии, программирования и управления проектами. Целью данной стадии работы было создание микрочипа в формате 96-луночного планшета
12
НОВОЕ СЛОВО В НАУКЕ И ПРАКТИКЕ
с иммобилизованными в лунках молекулами-зондами (мишенями), расположенными в строго определённом порядке в виде точек постоянной морфологии. При этом каждая точка (спот) соответствует одному зонду, который способен специфически связываться с определенными пробами в исследуемом образце. При контактном нанесении аликвоты растворов зондов остаются на дне лунки планшета при касании поверхности кончиком иглы, содержащей образец в щелевом капилляре вдоль оси иглы.
Печать антител проводили при помощи SpotBot 3 («Arrayit», США) -споттера для контактной печати с модулем для поддержания влажности воздуха и генератором ультразвука. Были выбраны оптимальные условия для печати, буфер для антител, а также механизм связывания напечатанных зондов на планшете и его хранение.
Выбор оптимально работающих пар антител проводили с помощью традиционного сэндвич-ИФА. Белки, используемые для создания диагностических тест-систем на основе взаимодействий антиген-антитело, должны быть высокоочищенными и обладать высокой специфичностью к требуемому эпитопу. При проведении необходимых работ по разработке диагностического белкового биочипа использовали МКА с различной эпитопной специфичностью к поверхностным антигенам вирусов.
В разрабатываемой мультиплексной тест-системе был опробован сэндвич-вариант твердофазного ИФА (двухцентровый иммунометрический анализ). Преимуществом такого подхода является большая специфичность, а также уменьшение фона, что позволяет увеличить порог чувствительности. Для реализации этого варианта использовали по два МКА с различными антигенными детерминантами к каждому из анализируемых вирусов. Первое антитело иммобилизовали на подложке биочипа, а второе, конъюгированное с биотином, использовали для колориметрической детекции связавшихся белков с помощью стрептавидина, конъюгированного с перокси-дазой хрена. Пробы с вирусом обычно инкубировали в семи двукратных разведениях от 5 мкг/мл до 78 нг/мл в трех технических повторах. Сканирование биочипа и последующую обработку данных проводили на сканере ScanArray («Perkin Elmer», США) с использованием прилагаемого программного обеспечения.
Для колориметрической детекции результатов гибридизации выявляющие антитела для ОРВИ биотинилировали с помощью коммерческого набора (“Abcam”, США), а затем очищены гель-фильтрацией. Для выявления сигнала использовали биотин, конъюгированный с пероксидазой хрена. Для этого было исследовано свойство пероксидазы хрена окислять ряд субстратов, а также их парных композиций в присутствии перекиси водорода, и по результатам экспериментов была выбрана одна пара субстратов, которая проявила самую высокую чувствительность при детекции. В качестве
Биологические науки
13
субстратов использовали ортодианизидин (OD), 4 -хлор-1-нафтол (CN), 3,3’,5,5’-тетраметилбензидин (TMB), 3,3’-диаминобензидин (DAB). По результатам анализа была выбрана оптимальная комбинация субстратов 4 мМ OD + 4 мМ CN, которая давала наиболее яркое окрашивание точек после гибридизации.
При проверке специфичности созданного биочипа в формате иммунопланшета были проанализированы очищенные концентраты заявленных вирусов. На этом этапе работы был подобран алгоритм гибридизации проб с биочипом, состоящий из инкубации биочипа с антигеном, инкубации слайда с окрашенными антителами, а затем колориметрическое окрашивание слайда. После каждого из этапов гибридизации требуется отмывка слайдов от несвязавшихся молекул.
Важным параметром при проведении анализа с использованием белковых биочипов является концентрация детектирующих антител, поэтому было проведено сравнительное исследование сигналов, получаемых от спотов, при разных концентрациях детектирующих антител. Также был проанализирован один из важнейших параметров, который необходимо учитывать при разработке диагностических биочипов, а именно предел детекции, определяемый наименьшей и наибольшей концентрациями пробы, которые могут быть достоверно определены. Для этого в качестве экспериментальных проб использовали серии разведений вирусных концентратов.
Для каждого из вирусов оценили нижние пределы детекции в моно-плексной (с использованием одного специфического биотинилированного антитела) и мультиплексной (с использованием смеси биотинилированных антител) модификациях. Нижние пределы детекции составили менее 100 нг/мл для ВГА, около 250 нг/мл для вирусов гриппа В, менее 200 нг/мл для аденовируса. Для РСВ результаты оказались неоднозначными. При достаточно малом выявляемом количестве РСВ в мультиплексной модификации наблюдалось также неспецифическое связывание, значительно увеличивающее флуоресценцию.
Работа поддержана стипендией Президента Российской Федерации для молодых учёных и аспирантов, осуществляющих перспективные научные исследования и разработки по приоритетным направлениям модернизации российской экономики (№ СП-6549.2013.4).
Список литературы:
1. Bulletin of the World Health Organization, 2010; 88: 216-221.
2. Engvall, Perlman. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): Quantitative assay of immunoglobulin G // Immunochemistry, 8: 871-874, 1971.
3. van Veemen and Schurs. Immunoassay using antigen-enzyme conjugate // FEBS Lett., 15: 232-237, 1971.
