CC BY
113
УДК 577.1 577.15
Белковая инженерия пенициллинацилаз
В. И. Тишков12,3*, С. С. Савин2,3, А. С. Ясная 2,4
'Химический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 3
2Учреждение Российской академии наук Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071, Москва, Ленинский просп., 33
3ООО «Инновации и высокие технологии МГУ», 109559, Москва, Цимлянская ул., 16, оф. 96 4РНЦ «Курчатовский институт», 123182, Москва, пл. Академика Курчатова, 1 *Е-таіІ: vitishkov@gmail.com Поступила в редакцию 05.09.2010 г.
РЕФЕРАТ Пенициллинацилазы широко используются на практике для получения полусинтетических Р-лактамных антибиотиков и хиральных соединений. В данном обзоре рассмотрены последние достижения по получению рекомбинантных ферментов, а также результаты по белковой инженерии пенициллинацилазы G с помощью различных подходов.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА пенициллинацилаза, Escherichia coli, экспрессия, структура, белковая инженерия. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ПА - пенициллинацилаза, EcnA - пенициллинацилаза из Escherichia coli, А/ПА - пенициллинацилаза из Alcaligenes faecalis, 6-АПК - 6-аминопенициллановая кислота, ФГА -D-фенилглицинамид, ФУК - фенилуксусная кислота, ФГМ - метиловый эфир D-фенилглицина, ЦА - це-фалоспоринацилаза из Penicillium diminuta.
ВВЕДЕНИЕ
Пенициллинацилаза (ПА, КФ 3.5.1.11) была открыта 60 лет назад как катализатор гидролиза амидной связи в антибиотиках пенициллинового ряда [1]. Этот фермент относится к классу гидролаз, подклассу амидогидролаз и является представителем семейства так называемых N-концевых нуклеофильных гидролаз. ПА была найдена в бактериях, дрожжах и низших грибах. Физиологическая роль фермента до конца не ясна. По-видимому, он служит для утилизации гетероциклических соединений в качестве источника углерода.
ПА изучается уже более 50 лет. На практике этот фермент нашел широкое применение в производстве 6-аминопенициллановой кислоты - основного синтона для получения антибиотиков пенициллинового ряда. Также ПА применяется непосредственно для синтеза различных полусинтетических Р-лактамных антибиотиков. Такие свойства этого фермента, как широкая субстратная специфичность, высокие регио-, хемо- и стереоселективность обуславливают его применение для получения оптически чистых соединений (они все больше используются в фармацевтической промышленности), а также для защиты гидроксильных и аминогрупп в пептидном и тонком органическом синтезе.
В настоящее время наиболее широко применяется пенициллинацилаза из Escherichia coli (ЕсПА). Среди
других пенициллинацилаз этот фермент изучен лучше всего, однако эффективность катализируемого .ЕсПА ацильного переноса на Р-лактамные ядра недостаточна для того, чтобы полностью вытеснить уже устаревшие методы химического синтеза существующих антибиотиков. В то же время из-за активного распространения патогенов, резистентных к существующим антибиотикам, очень остро стоит проблема поиска новых антибактериальных препаратов с неприродными заместителями, для синтеза которых эффективность ПА дикого типа будет очень низкой. Поэтому задача получения новых мутантных форм фермента с улучшенными синтетическими характеристиками по отношению к неприродным субстратам имеет большое практическое и фундаментальное значение. Другой, не менее важной и актуальной задачей является повышение стереоселективности ПА в реакциях ацилирования аминоспиртов или гидролиза их П-ацильных производных, так как стереоселективность ПА в реакциях получения аминоспиртов на порядок ниже, чем для аминокислот.
Для получения новых форм ферментов с улучшенными свойствами могут быть использованы самые разнообразные подходы, например, различные методы неупорядоченного мутагенеза(направленная эволюция, генная мозаика и т.д.) или направленное введение аминокислотных замен на основе анализа пространственной структуры белковой глобулы (ра-
Ацилазы ß-лактамов
Пенициллины
NH «.
я" vrvcib
Цефалоспорины NH .S,
0'
Рис. 1. Современная классификация ацилаз Р-лактамов по типу гидролизуемого субстрата [7]. 7-АЦК - 7-ами-ноцефалоспорано-вая кислота.
соон
Пенициллин G Пенициллин V
Фенилацетил Класс I
«•"у
Ампициллин
NHi
Цефалоспорин
С
ОН
nh2
Глутарил-7-АЦК
он
Феноксиацетил а-Аминоацил ô-Аминоадипил
II III IV
Глутарил
Ацилгидролазы a-aцилaмино-ß-лaктaмов
циональный дизайн). В настоящее время все более широко используется последний подход, однако он требует знания трехмерной структуры фермента, которая может быть получена или экспериментально (рентгеноструктурный анализ, ЯМР), или с помощью компьютерного моделирования. В данном обзоре мы рассмотрим последние достижения по получению рекомбинантных пенициллинацилаз с улучшенными свойствами.
классификация пенициллинацилаз
Пенициллинацилазы относятся к ß-лактамным аци-лазам и классифицируются по типу гидролизуемого субстрата: на ферменты, гидролизующие преимущественно пенициллин G, пенициллин V и ампициллин. В 1963 г. была предложена классификация, включающая пенициллинацилазы класса I и класса II [2]. Ферменты, относящиеся к классу I, преимущественно гидролизуют пенициллин V (феноксиметилпеницил-лин), а ПА класса II - пенициллин G (бензилпеницил-лин). Позднее к этой классификации был добавлен класс III - ферменты, отвечающие за гидролиз ампициллина (D-a-аминобензилпенициллин) [3-6].
Современная классификация ацилаз ß-лактамов по предпочитаемому «ядру» и соответствующим природным боковым радикалам [7] приведена на рис. 1. Согласно этой классификации, ПА класса II дополнительно подразделяются еще на две подгруппы: класс На - ферменты, относящиеся к этой группе, осуществляют предпочтительный гидролиз ароматических амидов, и класс IIb - предпочтительный гидролиз алифатических амидов [7, 8].
ИСТОчНИКИ И ЛОКАЛИзАЦИя ПЕНИЦИЛЛИНАЦИЛАз
Впервые пенициллинацилазная активность была описана японскими учеными в 1950 г. [1]. Авторы обнаружили, что мицелий грибов Penicillium chrysoge-num и Aspergillus oryzae способен превращать бен-зилпенициллин в фенилуксусную кислоту и некое вещество, названное авторами «пеницин», которое позже было идентифицировано, как 6-аминопени-циллановая кислота (б-АПК) [1, 9, 10]. Более детальные и тщательные исследования этого фермента относятся уже к 60-м годам XX века. Именно в это время появляется большое число публикаций, посвященных изучению свойств и способов, а также перспектив применения данного фермента, причем число статей, посвященных пенициллинацилазам, с каждым годом только увеличивается.
Пенициллинацилазная активность была обнаружена в бактериях, дрожжах и низших грибах [11-14]. В настоящее время описаны ПА более чем из 40 различных микроорганизмов. Еще большее количество генов пенициллинацилаз было найдено при аннотировании геномов микроорганизмов.
В зависимости от источника фермент может быть локализован как вне, так и внутри клетки. Для пени-циллинацилаз G (класс II) характерна локализация активного фермента в периплазматическом пространстве клетки. Внеклеточная экспрессия встречается у штаммов-продуцентов как пенициллинацилаз V (класс I), так и пенициллинацилаз G (класс II). Физиологическая роль ПА до сих пор не ясна, несмотря на то, что этот фермент изучается уже около 60 лет.
Таблица 1. Основные характеристики пенициллинацилаз из различных источников
Класс Источник Гидролизуемые субстраты* Индуцибельность Локализация в клетке Ссылка
Класс I ПА-V Streptomyces lavendulae Пен-V, Пен-K нет вне [3]
Dermatophytes Пен-V да внутри [3]
Penicillium chrysogenum Пен-V, Пен-K да внутри [3]
Bacillus sphaericus Пен-V н.д. вне [16]
Fusarium sp. Пен-V н.д. вне [17]
Класс II ПА-G E. coli Пен-G, Пен-X да внутри [18]
Bacillus megaterium Пен-G, цефалексин, цефалоглицин, цефалоридин н.д. вне [19]
Alcaligenes faecalis Пен-G н.д. внутри [20]
Providencia rettgeri Пен-G н.д. внутри [21]
Класс III Amp-ПА Pseudomonas melanogenum Амп, цефалоглицин, цефадрин, цефалексин н.д. внутри [22]
* Амп - ампициллин, Пен-G - пенициллин G, Пен-V - пенициллин V, Пен-K - пенициллин K, Пен-X - пенициллин X.
Вероятнее всего, ПА служит для утилизации амидов ароматических соединений в качестве источника углерода [15]. В табл. 1 приведены основные характеристики для некоторых наиболее хорошо изученных пенициллинацилаз.
особенности экспрессии пенициллинацилазы g
Ген ПА-G кодирует фермент в виде неактивного предшественника. Он состоит из 4 структурных элементов: сигнального пептида, а- и Р-субъединицы и межсубъединичного спейсера. Зрелый фермент в случае ПА-G представляет собой гетеродимер общей массой 86 кДа. Он состоит из двух субъединиц, а- и Р-, массой 23 и 63 кДа соответственно [23, 24]. Также в состав молекулы ПА входит связанный атом кальция, который, согласно некоторым данным, способствует процессингу фермента [18].
Посттрансляционная модификация ПА-G является многостадийным процессом и была довольно хорошо изучена на примере фермента из E. coli. На первом этапе с помощью сигнального пептида происходит транспорт неактивного белка-предшественника из цитоплазмы в периплазматическое пространство клетки, затем сигнальный пептид отщепляется. Далее происходит выщепление спейсера с образованием активного гетеродимера [23, 25, 26].
В клетках E. coli большинство ферментов переносится через мембрану с помощью Sec-транслоказы.
Sec-система распознает сигнальные пептиды, не имеющие совпадений в аминокислотной последовательности, но обладающие похожими физикохимическими свойствами. SecB-шаперон распознает короткую последовательность, включающую ароматический и положительно заряженный аминокислотные остатки, которая затем обрабатывается Sec-транслоказой [27]. SecB - основной компонент, участвующий в транслокации многих секреторных и периплазматических белков. В работе [28] было показано, что белок SecB необходим для образования ЕсПА-G в активной форме.
Другой путь секреции белков - Tat-система (twin arginin translocation). Считают, что она позволяет транспортировать через мембрану свернувшиеся белки, содержащие кофакторы. Tat-система, по-видимому, является полностью независимой от Sec-системы. Для транспорта с помощью Tat-системы необходимо наличие в последовательности сигнального пептида мотива SRRXFLK, содержащего два остатка аргинина [29]. Последовательность сигнального пептида в белке-предшественнике ЕсПА содержит два остатка аргинина, разделенных остатком аспарагина (рис. 2). В литературе есть данные, что такой сигнальный пептид также может обеспечивать процессинг фермента с помощью Tat-системы. Более поздние по сравнению с работой [28] исследования показывают, что сигнальный пептид фермента из E. coli обеспечивает транслокацию белка-предшественника
ОБЗОРЫ
Е.соН
АЛаесаНв
B.ЬасИи5
C.аддгедап Ы.рипсШо Р. с/е п ИгН Р.ху1апорИ ТАИегторИ
-МКУКУКМХУ КСУТАБ^МУУ И$ЬР----------
ИРХСЬУКГ <7УАЛ . О. 1ЬС ¿ЛИ------
-АМЕ;-558 ЕГ ■ ».шип эУЕ
-МККВЧЬЖ 1М1УРА.УЬР ОЫГГ------Г.КЕОККУЕ *
-------------НЯЫдКК1АС УГ1АУС1А1//Ь УЕСЗБСЗУЕИ ЬНОБ-ЬАОТЕ СЕ1!1УАС1.С 3*
МР0РА01КЗГ ЛКВХРРРГЬК ВБЕГУЕЕУЕС ШДК51АТ.Т УВОЗ-ГРСЕв СТЮЬР.ЬКА .’
---------------------------мг.гылв ьы-г.о.гуь тас,-------------...о—т <у
-------------ННЙОШ?АС ГААААЪУАЬЬ АААБСбСУЬ. ЬК-вТЭРОТИ СТЕЕЬ.ОЫФ
------МЪГР ТМКЙГиЮь1/ №Е1Х5ЕГЕПА ШЛЗЕ.СУЬ. ЕВА5-ЬРОСЕ <Ж1А1.6Ь.А
Е»ТН ньгЛу БНУ б. у. .
.
ТЕТ СА1Г Ь [АМЭН о. .м§: .УН е.
..ей о...
ТЬК Б. .Г
—КВ г?кг PGEQDV У.
----ЕЕУ УТ
—ЕА ТЬОТ —88 О.ОТ
-----1Е ВЕР.
—ЛА АЬ& -----ЕА ТЕРО
:-.::
МЩУ
О ОБЕ Э С.БОДЕ
: :
.п
ЙУ1
щг
ГЬ
Р.ГЕ
р. ктлроа: а .гг-аэ
Г ЬС’/АЕ. МС.АВУА
нп•
ГСГУК.А Т КСГУВ.
Е.соН
А/аеса/к
B.ЬасНи5
C.аддгедап Ы.рипсШо Р.с1епИп{ Р.ху1апорИ ТАИегторИ
Е.соН
А/аеса/к
B.ЬасНи5
C.аддгедап Ы.рипсШо Р.с1епИп{ Р.ху1апорИ ТАИегторИ
Е.соН
АЛаесаПз
B.ЬасНиз
C.аддгедап Ы.рипсШо Р.с/епИМ Р.ху1апорИ ТАИегторИ
Е.соН
АЛаесаПз
B.ЬасНиз
C.аддгедап Ы.рипсШо Р.с/епИМ Р.ху1апорИ ТАИегторИ
ЯЕА
ОКУП—Т ЫРЕТЕЕРКОР ятгсгт ЕО.К—И Н..-....ЕТ УБ.Ю ЛУК— ооокк.б.е. НБУВ. А1»4Р—V Ь.РЕЕЛЬ—
КЕИО«НА ЬБЬЕУАУЬК. ЕКР.У! .И.Ь—А П.АК.М.Я.. .О..
ЯТОР—С Ь.1ЕТЪЪ1----------.У]
ДБСА—Р Ь.РЕРРЬЬ----------..I
г.
КР« ЕРГОУАМ1РУ СТМАиВЕББЗ
.рь то.. .V. .х. .г........т ыц
К. КАТ.-УЛЬУН УБ.Т-У.М.Ы н<р БР. 0« I -51.УНАК МУАИОЕООКН N0 01ЬНБЬ’ПЮК УМАУОЬвТЫГ 0-|
ТЕ.......У.......б____СУ 5А
И. А. . ЬУНАК »ЙГОЕБАИУ Е. ТбР. . ЬУМАК ЬИЗУОЬ-Я^Ш ЕР
ЭЫЕАЕЕ ТАЪКОКУСУЭ 0СЭ4АУГМС ГА..МВ Q5.EKQH.PE К.Е.Ь.СЕ |К. АЕ1. AR.ERT.-KE KA.AKM.ED
I АО-УЭАЕО----------АО*
СЯА1.. КТ-ЬТРТО-- --------УЕЕ
¡.АКТ. AE.EAQF.PE КАКУЬ.Б.
гЯУВ.Р АЯСЬЕРРЙ-----------1;
СИНЯ. . АЙСУЭРКЯ----------ЫЕ
К ШЛТОРБА Ь . ИГОТТ. • ЮЮЬЕ. РАЕТ. рруроо: .ИЕО.Ь. РРУРЕГХЗ РРУРЕР.
246 РМЕРВРАК<5А РбАИЛЬТАС УМВЕТТУАСР ЛОБ--------------БАЫ бЪАСУРПЪ
234
241
24&
262
226
232
-.АНУ££-
-QVLA.ee ERQDKHW.GR .РРРА.КА|
----------------------А5КК1УКЕ КЕЕРУОБЗЕЕ 1ЛЕРЕК1С
---------------------------РТ.АЯ.М. ОЕИАТУУОТТ ..СЕЮЬАС
----------------------Е.У.ЕЭГТ КРММАЬЕОЫ .РТЛСЮ!
--5E.gr-----------------------ГАЕЬЬ НА.-----,ЬР .СООЯ.Ра!
----------------------ЕНОАЕ.Ы. ЯЬНРгЬРУБ----------ЬЕМ
236 ------------------------—. . ЕАР5А1. -ЬННАРРНГ----------МЕ.-1
МК’.ЧбКЗКАО
Ь.ЗТИРЕНУ.
AMiV.AK.bK
К____б.НТА
N...вСЕЬТО
К. .УБСУи^ТЕ К..УАС.ЯТЕ
ГУ.
ЬИ1
У01
•т:
: .
БАв----------УОУТ
.. .---------Р. .V
. БР.----------Е.МЕ
.С-----------А ШАГ
.С1вК БАЕСР.К..
5р-----------ТЬЕАУ
ар—---------сьва:
375 КРСУУЬНКСК »ГЛОЛБН 351 RADQ.WF.NA .КТ.ЕО.: 353 N^0.ГУК. . .КН.ЕК.Т 350 -QN.VEy.NT ВЕРУТУМ 380 М.№.ЕУ.........О.КЬУС
336 Н.ЕС.ЕАНЕХ; .КЕ.ТА.И
337 -СВЙ.ИУИ.Е УИРУРУ.. 339 -бРО.НУК.Н У.РУОУ..
Т I1 В- -3
, л £ .К
. О
к .
V .Й
-
N-----С ОАЕТРТУНР
ЯС-----О АСРЕМ.I..
ЯбЕНбКА ККУЕКУГРН
,0-----А EPI.L-.RV
£-----Б .Р1У0..НУ
.С-----О РЕУЕТ_
50-----. EDV.bR.РЕ
.6-----. RE.VLK.RE
|10Т0-
------------ОТТОТАУ
------------УЕОС...
15МЕ------------------КЕККУ. .
|150У---------------ЯС'01МЕ.-Ь
.БОУБ РМЬККГОАБО РЬЕ1Р0ЫУ.У
3.1.-------------------РС.А____
ЗСУ---------------УРАРСАРРЕ
■ТТОА- ------------ -ЬЕОРРК.РМ
KS|AWDGKE УА5Ь1 ...У. .0...
ГН.Тб АО.Ю ТАЬОБР О.Т ТА1ЕР- БКЕСУ .К.О. 1БТ.
■
ЕР УвЕОЕ
ШТ.
496 1 4"72 V 478 Р 472 . 514 У 457 . 461 А 463 V
УРБ-ТСКН АК.-О.БМ
[Г. -ЕПГ
...М.ЮАУ . . .Н.ЕСУ
АЯ—Р..0 .-О.К.
.-Н.Е.
.
А^Лв^РО КБ У РАБ Б Ь ГА П £~А0 'Л К. А Р.—КТЭТОТ У У туе. ИМ К.А -УИ-НМСЕУБ IV -КС^ УТАИКУТ С.Э-УРУ.1Л 75 ААРЕ /М RK--ypy.IT АС УУСУ ИБА РО-О.АЬРЕ. ТР -Б..
КАУ Р.Б-УРУЯ15 ЬЕ АЕРУ
ггл1 РКС-ГРУАТТ уо аеру
Е1БЯ1ХЕСКР В-ЬТАГвАМС VIROTSRQD •ЕТБОУОО.С Ь-НБУ0|1.С FNKKA.YS.
.0 ОПНСМ.АНО К-УХШЯ АО К.1Е.1. К-.
АО Н.УЕШБ.ОТ ЕР15Ье[ .V . .НАК.ОАЯЕ К-..Р-1 АЕ Я.К.НГЬБАС АЕ Я.ЕЕ..ЬА.Е К-.БЬЕ|
[Г.ПЕ INYTA.FAO !КА МЬЗОУУ-/00 10<300В--Ы I.. IN.EI.FL. УЯ ЮООКК—Э
тоооок—3
Т ОСААКОАЬТ-Ь О..Б.М.ГБ-0 .А.БЕГТМБ-Г/ ААТЛОУКАРМ PH ТА. БКУОУРА .Ь О..Е.У.Т.-ГН ЕАЬЯЬУКАРБ ГК KALLPYSAPS
ААТБСЕ-ТОБ РРШ1ОДУ£1 КЬАОБ.-РАМ .АОЭААЬТ. KTLKKYOSEN КЕУАУ...0
1Г/.Р----ТЕ РИЕТУАЕ.I
51. у----от EP0.CAA.QK1
Б.АЕ.1-ОРО БО.АЕ...I ОЬйР----1£. РКА. .ИЯ
ьь.?-----ъ. Есь.ъття
|АУОЕБМУРЬ КР№ОЫБОТА АЪЬРРУРЬРА 245
РАР-------ААЕЯКРОАО. вТОН-------234
ОРЕЮфТЕАК .DGKTSI.PL 55АУ1С----241
РЕбМРТБАР ЭРГЭбО.ТРЕ О---------- 240
■РЕРиКвКТй ЕСЕЫБОЕТОГ ТАГБ!----- 262
|?Е------------СС.УОЯК. С.А.------226
-----------СССАБРО .---------232
|ЯА-------------ЕГЕКЬРЬ К---------
1И-АЕНЬЗАЕ 374 Ш-О.К.МРА 350 .|-Е...КРА 352 Ш-Г-.Ю.- 350 1|-1.ИОТК 379
tRLE.NP. 335 Е.ЕАЯБ- 337 Ь.&1Е— 339
QSGHDPR 495 РАЕ«0.1. 471 5№1.0. 477 Е^.О-в. 471 АК-Н-в. 513
АЕ____О. 456
НЕ..ЗвЬ 460 КЕ..ТОМ 462
ООСКТМООРС 632 -МЕН .ОАСОНАС.А 604 ЫЬКЕБК ННОСУУОАйУ 614
------АМКСЕЗАА 596
-----01<СМТ55А. 638
1.001КА Е..ВАТТБ-А 590
----- —ОАЯРСБЯЕ 584
---------ТМАРСБЕЕ 586
Е.соН
АЛаесаНз
B.ЬасНи5
C.аддгедап Ы.рипсШо Р.с1епИп{ Р.ху1апорИ ТАИегторИ
633 БАПКУ^ТБ 605 RVLFKT-.ee 615 А.ГГСЕ.КЬИ 597 А.УУОБУУУА €39 А.ЪГЕ.ГККН 591 VGLFQA..ОУ 585 А^ГЕА.У-Т 587 АЛ-УГАЛ-.У-Т
Н1КНТЯ/ААУ Р-МРГОК-----
.У.ОУТНРУ. .-ЕЗНЯА-----
АШ1КЬГИББЬ ИТУБЭЬТ-----
А.ЕАУгАС'ЕЕ НСГРТ.УУРЪ
Ъ..О.ГНООЬ -ЕВУ.PH-----
.VEDVLRDDN .А1.РА1-----
Е.ТАРАВЕ. ОЯРУН.Е— Е.Т.1РОКЕ. СЕАУИ.Е-----
---НУБАБбУ ЕТТОООРТСБ ЬМ1БУСАК1Ь УЕАУОСОКБР ТР0АУО1ГАС
---М. .ОТ.Г А.О.бРНР.. Ю.Н.Т.У. LR.LAI.EAH. D-KR.NV.GE
-------------------------веххонам <ЗАТ1ЛУК^Б сертыуонкт
0ЫЫГРА1А1В БУЬЬС.НОСТ СИГЛТРО.У ЕОСРТТкАОА 1РКСЕАТМ-Т -СГ,СРИУАУУ АМЬУКО-НЗ. ХУТЕ’КРКТРКУ ЕНЯОЕГЬКОЗ РТЕ...ЕЬЕК
------------------------—..РТ.ОМ. HN.LL.ERAG V. .ТН.Г.Н.
----РРУЕЕВ АМКИС*-ОВ. СВР---ЗООН СССЕВГААВА ЬЕВ.ЕЕЯ-Е.
----РЯУ1ЕК А1ЖЕ6—ОКН СООРЕ-ТЕУН Е50.0УАА1А ЕЕК^.ВКЕА
КРОО----ЕУУ ЬААЬЕОТХЕТ LSKRYGNN-V ЗЯНКТРАМАЬ ТГРАтРГСУ
RSS.--.TM НТ..0КА0АН ..0Е0.А0-М ER.TM.TSVH R.SDK..Т.Т
. ЕЕА--.К1 Ш'ЗАИЕА!.-. ЮНЕЕКСТАА D0.RM.1KTM . . С. КБ11А.1
ЕОСЕМВРТКИ ВкТЯУН0А1Г РННРГБО-------- VEALRGFFER РУРТССОТГТ
ТОЗК-ОРКК^ КЖСКЬН.УТГ ВКАТЕ-КБС. АРТЕЗЬГМКС А.АТАСКСЕТ ADEAGRK.II ..Э. 0?1АААР ,А1>.ГС30ЕР А1>.Н1Е1К0Н V.ETS.YL.I
ЕЕУР-------ЕЖЗААНВАУГ БНР^Т-БВ-------Т?ЕАВ-ГАСР. ЕУА.ООПАУТ
1САР------- АИ^ЕУНВАРГ РНАУЬТН------- ТРЕ.В~Е5СВ ЕУАГСССВУТ
РОАААЕЕТВН 7 61 ..ТТБСК.ГА 733 .НЗ—УвЭКТ 724 1МУСР\Л11.Е 733 УМ-МЯКВАНК 773 ...бЕО.У.А 709 ’/МУбРУОР-А. 699 У№КЗРГ0Р-Е 704
Е.соН 762 ОАЕУОЬ’РС!
АЛаесаНв 734 РТС 1
В.ЬасИи5 725 Е1ХЕМ. . .]
С.аддгедап 734 руеоу.ср!
Ы.рипсШо 77 4 БГ. УТ01Р1
Р.ЫепИгй 710 1СТЗМ 1
Р.ху1апорИ 700 эрвмсзср!
ТАИегторИ 705 ТЕАМСНСР|
ТбРТТ 31ЖРУ1АМОУ
-АКБ.ЕГС.А МР.| —КОРЕСГН. ТР.| --Ни^БРЕМ НТ --КЕВМЗУА1 НТ.1 -ЕСКАЕГСА. ТР.Г
Ъ.------РЕСВБЬУ . 1РМ
—СМЕСЗЬГ. ИРМ
Е1А РБСТУОК .ТО ВМ.УНБР ..НК..,Ь8П
яу-------Lsa
НА-------РНТ
..Б .Б.ЕАБГ
5Р--------ЬЗС
НТ-------ЕЭР
КМУЕИГС RK3LWLTK.CE
.Ъ____Е С.ТМОУ.НТ.
БЬ.А.ХК Г.РРЪГО.К. GLWQRGE 01РЮ1ГПАЕУ ^ИБХВ. IЕ УНСМЬЗОСРЯ ..в.О СНРОА..КОЕ 1ЛоЬХБСС. УЕЯМЯТАСУЕ РЕ^ОЯСО УЕРМА-ГСАР
VEAHK.ES СЕ V 1ВВЫА0.БТМ •КВААУ.УЗЕ
ОСЕ-----РЕ.
.ТОЫТААТЕК
___УАУ.Я.Т
АСЮ-----АЕТ
ЕСВ-----ТЕЕ
УОН— 846 ЬХ.РОР 816 ТСК— 805 ^РТР-- 804 1РКЕ6Е 850 ,Р.-- 790 РА.— 770 ■¡РЕРБР 776
Рис. 2. Сравнение аминокислотных последовательностей пенициллинацилаз С из различных источников. Звездочкой отмечен каталитически важный остаток серина |ЗБег 1, а знаком # - остатки оксианионного центра. Последовательности сигнальных пептидов выделены полужирным курсивом с подчеркиванием, а просто подчеркиванием - последовательности межсубъединичных спейсеров.
ТОМ 2 № 3 (6) 2010 I АСТА ЫАТиИАЕ | 61
Таблица 2. Влияние условий культивирования на выходы рекомбинантных ПА
Источник фермента Штамм- продуцент Промо- тор Анти- био- тико- устой- чивость Индуктор Т, °С Среда Добавки Выход фермента Ссылка
орга- низм штамм
E. coli E. coli JM109 trc ИПТГ/ арабино- за 30 LB 112 ^/л/^ 193 Ед/л/А600 [66]
E. coli JM109, BL21, HB101 Т7 Kn арабино- за 30 LB глицерин 330 Ед/л/А600, 820 Ед/л, 440 Ед/л/А600, 690 Ед/л [63]
E. coli GM48 HB101 Т7 Trc Kn ИПТГ 30 LB 84 Ед/л/А600 [32]
E. coli MC1000 lacZ Kn ИПТГ 28 M9 ФУК 14-650 Ед/г [67]
E. coli DH5a tac lacI CmR ИПТГ [68]
E. coli x6212 trc ИПТГ 1000 Ед/л, 700 Ед/г [69]
E. coli JM101, JM103, JM105 lac Kn ИПТГ, галактоза М9 глюкоза, галактоза, глюкоза+ галактоза 20-800 Ед/л [70]
E. coli SecB- шаперон 40-126 Ед/л/А600 [28]
E. coli Cm ИПТГ 28 М9 Са2+ 1 г/л 1700 Ед/г [31]
E. coli trc T7 araB Kn Cm ИПТГ, арабино- за degP- шаперон ПА: 20-800 Ед/л, ПА: 10450 Ед/л [65]
E. coli BL21 (DE3) T7 [60, 71]
E. coli HB101, JM109, MC4100 araB Cm Kn Amp degP- шаперон 14-470 Ед/л, 570 Ед/л/А600 [60]
A. faecalis E. coli Cm ИПТГ М9 Са2+ 2.3 г/л, 14000 Ед/г^ПА) [31]
E. coli HB101 1000 Ед, 23 мг/л [20]
E. coli JM109 rhaBAD Amp рамноза M9 LB глюкоза, пролин 4500 Ед/л, 0.96 Ед/мг [72]
E. coli JM109 (DE3) T7 Kn ИПТГ LB (200-270)* 103 Ед/л [21]
K. citrophila E. coli BL21 (DE3) T7 Kn ИПТГ YE TH M9 MR 13460 Ед/л 1190 Ед/л/А600 28056 Ед/л 1576 Ед/л/А600 [60]
именно за счет Та1-системы [30]. В случае ПА из А1-caligenes faecalis для транспорта используется Sec-система [31].
Эксперименты с белком-предшественником, не содержащим сигнальный пептид, свидетельствуют, что межсубъединичный спейсер сначала отщепляется от П-конца Р-субъединицы. В резуль-
тате образуется свободная Р-субъединица и полипептид, состоящий из а-субъединицы и спейсера [23]. В процессе созревания белка-предшественника ПА непосредственно в клетке отщепление спейсе-ра также происходит в две стадии [23]. Этими же авторами было показано, что отщепление спейсе-ра от П-конца Р-субъединицы возможно только
в периплазме, в то время как отщепление спей-сера от С-конца а-субъединицы также возможно и в цитоплазме клетки. В то же время результаты работы [26] свидетельствуют, что первой сворачивается а-субъединица, которая затем выступает в качестве «матрицы» для правильного сворачивания Р-субъединицы. Позже было показано, что отщепление межсубъединичного спейсера является автокаталитическим процессом [25]. Критическую роль в правильном сворачивании фермента играют остатки Lys299 и Thr263 (нумерация аминокислотных остатков неактивного предшественника). Аминокислотные замены в этих положениях приводят к существенному снижению выхода активного фермента и преимущественному образованию неактивного предшественника [25, 32].
Суммируя литературные данные, следует отметить, что все стадии процессинга ПА-G играют важную роль в экспрессии фермента в активной и растворимой форме. Введение аминокислотных замен может повлиять на любую из стадий созревания белка-предшественника, поэтому получение новых мутантных ферментов в активной форме потребует тщательного индивидуального подбора условий культивирования.
ЭКСПРЕССИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ПА В E. coli
Для клонирования и экспрессии рекомбинантных ферментов в зависимости от задач можно использовать множество различных систем: бактерии [33-36], дрожжи [37-40], растения [41-43], клетки насекомых [44-47] или искусственные бесклеточные системы [48-51]. Поскольку ПА-G встречается только в бактериях, то для ее экспрессии, как правило, выбирают бактериальные системы на основе клеток E. coli. Ниже мы рассмотрим различные варианты экспрессии ПА-G в клетках E. coli.
Выбор промотора и вектора для экспрессии
В литературе содержится большое количество информации по гетерологической и гомологической экспрессии ПА в E. coli. В качестве вектора использовали как низкокопийные, так и высококопийные плазмиды, а для контролируемой экспрессии использовали самые разные типы промоторов: lac, tac, trc, T7 и araB. Гены ПА-G были клонированы из E. coli [52, 53], Actinomyces viscosus [54], Providencia rettgeri [55], Kluyvera citrophila [56], Bacillus megaterium [35, 57] и A. faecalis [20]. Влияние типа промотора на выход ПА из различных источников суммировано в табл. 2. Строгой зависимости между типом промотора и выходом активного фермента нет. Как правило, более сильные промоторы (например, промотор РНК-полимеразы фага Т7) приводят к высокому уровню экспрессии, однако за-
H. marismortui
Г P. denitrificans
'-------------------------A. faecalis
S. wiüichii S. proteamaculans A. \\io:o\idan:
— í-----------------------P. rettgeri
LS. boydii E. coli
-----------------------------A. baumanii
------------------------------Sphingomonas_sp.
O. ihe\en:::
V . eiseniae R. pirkettii R. bitoimata
B. maHei
1----- i----------------- T. thermophilus
R. \\ianophiiu:
G. \iö¡зcëu:
C. auiantiaru:
R. castenhoizii
------------C. aggregans
-------------------------- N. punctiforme
B. weihenstephanensis i B. thuringiensis -■ B. cereus B. megaterium ------------- B. badius
Рис. 3. Филогенетическое дерево пенициллинацилаз G.
частую именно это препятствует правильному сворачиванию фермента и приводит к образованию целевого белка преимущественно в нерастворимой форме в виде так называемых телец включения. Использование менее сильных промоторов часто позволяет увеличить долю растворимого фермента. В каждом случае для конкретного фермента отдельно подбирался оптимальный вариант экспрессирующего вектора.
Фактором, определяющим уровень экспрессии фермента, может быть как транскрипция, так и трансляция [53]. Лимитирующая стадия определяется выбранным вектором и зависит от природы штамма-хозяина. В любом случае большинство исследователей выбирают сильные промоторы - tac и Т7, а в качестве индуктора используют изопропил-ß-D-тиогалактозид (ИПТГ). Проблему увеличения доли растворимого белка в клетке решают за счет оптимизации параметров культивирования.
Влияние температуры
В работе [58] было показано определяющее влияние температуры культивирования на выход ак-
тивной ПА. Эксперименты по экспрессии проводили при трех температурах: 22, 28 и 37°С. Для всех комбинаций плазмида/штамм-хозяин наибольшие выходы активного фермента наблюдались при 22°С. Такой эффект, вероятнее всего, связан с тем, что при пониженной температуре фермент успевает пройти все стадии посттрансляционной модификации и свернуться в правильную конформацию, за счет этого увеличивается доля растворимого и активного фермента в клетке. При повышении температуры культивирования происходит ускорение синтеза белка, и фермент накапливается в цитоплазме в нерастворимой форме.
Влияние состава среды и различных добавок
Многочисленные исследования показали, что среда для культивирования оказывает большое влияние на уровень экспрессии фермента и на его выход в активной форме. В работе [59] было показано, что наибольшие выходы активной ПА^ достигались при использовании минимальной среды М9 и глюкозы в качестве источника углерода. По сравнению с другими использованными средами доля периплазмати-ческого фермента в противовес внутриклеточному возрастала на 2 порядка. В другом случае [60] максимальный выход фермента наоборот был получен при использовании самой богатой среды YE из всех рассмотренных ^Е, ТН, МИ, М9).
Одним из важнейших параметров при культивировании ПА является наличие ионов кальция в среде для культивирования. Са2+ необходим как для роста клеток [61], так и для формирования ПА в активной и растворимой форме, поскольку он входит в структуру молекулы активной ПА [24, 60]. По мнению исследователей, Са2+ необходим для транспорта белка-предшественника через мембрану, а также для корректного сворачивания фермента и созревания белка-предшественника в периплазме [31].
Еще один подход, позволяющий повысить долю растворимой ПА в клетке, - это добавление в богатые среды низкомолекулярных источников углерода. Дополнительный источник углерода позволяет не только увеличить выход биомассы, но и приводит к снижению доли нерастворимого фермента в клетке [62]. В качестве таких источников углерода используют лактозу, глюкозу, арабинозу и глицерин. В работах [62, 63] показано, что добавление глицерина приводит к снижению нерастворимой фракции фермента в периплазматическом пространстве клетки. Как считают некоторые авторы, глицерин может выступать не только в качестве источника углерода, но и как «химический шаперон», облегчая сворачивание и созревание фермента.
Регулирование посттрансляционной модификации
В работе [59] в дополнение к подбору оптимального штамма для экспрессии с одновременной оптимизацией состава среды была модифицирована система транслокации ПА за счет замены сигнального пептида. Как отмечалось выше, сигнальный пептид .ЕсПА обеспечивает транспорт белка-предшественника с помощью Та1-системы [31], в то же время, согласно литературным данным [64], Sec-зависимый экспорт белков происходит быстрее. Замена системы транслокации позволила существенно увеличить долю растворимого фермента в периплазматической фракции.
Использование шаперонов для правильного фолдин-га ПА
Еще один активно развивающийся в последние десятилетия подход - это использование шаперонов при оптимизации экспрессии ферментов. В случае ПА большинство исследователей используют degP-шапероны, или же шапероны Sec-системы, если фермент транспортируется внутри клетки с ее помощью [65]. Использование этого метода позволяет увеличить выходы активного фермента в несколько раз.
Суммируя все вышесказанное, следует отметить, что экспрессия ПА^ зависит от множества факторов. Для создания штамма-суперпродуцента рекомбинантной ПА необходимо иметь детальное представление о лимитирующих стадиях экспрессии
Рис. 4. Структура активного гетеродимера ПА-G из E. coli (PDB 1PNK) [24]. Желтым и темно-синим цветом изображены а- и ß-субъединицы соответственно. Красным цветом указан каталитический остаток ßSerl, зеленым цветом - ион Ca2+.
Рис. 5. Структура активного гетеродимера ПА-G из A. faecalis (PDB 3K3W). Желтым и темно-синим цветом изображены а- и ß-субъединицы соответственно. Красным цветом указан каталитический остаток ßSerl, зеленым цветом - ион Ca2+. Малиновым цветом указана дисульфидная связь в ß-субъединице между остатками Cys492 и Cys525 в ферменте дикого типа. Вставка справа показывает фиксацию N-конца а-субъединицы и С-конца ß-субъединицы за счет ди-сульфидной связи (выделена оранжевым цветом), полученной в результате парной аминокислотной замены aQ3C/ ßP751C.
для каждого конкретного организма и экспрессион-ной системы. Выходы активного фермента также могут быть увеличены за счет использования штаммов, дефектных по протеиназам, и изменения системы транслокации фермента.
СТРУКТУРА ПЕНИЦИЛЛИНАЦИЛАЗ G
Первичная структура ПА-G
В настоящее время в базах данных (GeneBank) имеются полные нуклеотидные и аминокислотные последовательности ПА-G из 40 различных источников. На рис. 2 представлено выравнивание аминокислотных последовательностей ПА-G из некоторых источников. Для сравнения были отобраны ферменты, наиболее отличающиеся друг от друга. Полностью на рисунке приведена последовательность ПА из E. coli, для остальных ферментов для наглядности указаны только отличающиеся остатки. Темно-серым цветом выделены строго консервативные остатки, а светло-серым - подобные.
Как видно из рисунка, в области сигнальных пептидов не наблюдается никаких консервативных остатков или консенсусных последовательностей. Все они отличаются не только по последовательности аминокислотных остатков, но и по их количеству. Межсубъединичные спейсеры также существенно
отличаются и не имеют консервативных аминокислотных остатков в своей последовательности.
В приведенных последовательностях ПА-G можно выделить два основных консервативных мотива: AQ(D/E)RXXQ(M/L)(E/D) в а-субъединице и NXXYADXXGNI(G/A)Y в ß-субъединице. Кроме этих двух участков встречаются еще несколько высококонсервативных остатков, в частности первый и второй аминокислотные остатки в ß-субъединице -каталитически важный остаток серина и следующий за ним остаток аспарагина. Общее число высококонсервативных аминокислотных остатков в последовательностях ПА-G не превышает 7%.
На рис. 3 представлено филогенетическое дерево пенициллинацилаз G. Как видно из рисунка, наибольшее число этих ферментов встречается в про-теобактериях.
Четвертичная структура ПА-G
Первая трехмерная структура пенициллинацилазы-G была определена в 1995 г. для ПА из E. coli с разрешением в 1.9 Ä (PDB 1PNK) [24]. Она представлена на рис. 4. Активный фермент - это гетеродимер массой 86 кДа, состоящий из двух субъединиц: а -меньшего размера (24 кДа) и ß - большего размера (62 кДа). На N-конце ß-субъединицы расположен каталитический остаток серина (на рис. 4 выделен красным цветом). Гетеродимер имеет усредненные размеры 70 x 50 x 55 Ä. Полипептидные цепи двух субъединиц формируют пирамидальную структуру с глубокой чашеобразной выемкой в центре, на дне которой находится активный центр.
Как и все Ntn-гидролазы, ПА-G содержит типичный мотив укладки aßßa [73]. ПА содержит один aßßa-домен, состоящий из а- и ß-субъединиц [24], который является одним из самых больших aßßa-доменов среди всех известных Ntn-гидролаз [73].
Со структурной точки зрения, вся белковая глобула разделяется на три региона - А, В и С. Регион С включает 8 высококонсервативных для всего семейства Ntn-гидролаз элементов вторичной структуры. Эти 8 элементов образуют три слоя из 4-слойных aßßa-мотивов, и все они антипараллельны. Регионы A и В объединяют похожие элементы вторичной структуры, пространственное расположение которых совпадает для всех Ntn-гидролаз, а положение этих элементов в полипептидной цепи различно для разных представителей семейства. Для ПА-G регионы A, B и С в полипептидной цепи чередуются в порядке С-В-А.
В конце 2009 г. в базе трехмерных структур белков PDB была выложена структура ПА рекомбинантной пенициллинацилазы из A. faecalis (А/ПА), экспрессированной в клетках E. coli (PDB 3K3W) (рис. 5),
Рис. 6. Ключевые остатки активного центра ПА из E. coli (структура PDB 1AI4). Красным и оранжевым соответственно указаны каталитический остаток ßSerl и остаток ßGln23, регулирующий нуклеофильность каталитического остатка. Остатки оксианионного центра выделены малиновым. Зеленым выделены остатки субдомена S1 (связывание ацильной части субстрата), желтым - остатки субдомена S2 (связывание нуклеофильной части субстрата), синим цветом указан остаток aPhe146, который входит в оба субдомена.
хотя впервые этот фермент был выделен и охарактеризован еще в начале 90-х годов прошлого века. В мае 2010 г. в PDB была депонирована вторая структура А/ПА, полученная из орторомбического кристалла (PDB 3ML0). Особый интерес к А/ПА связан с тем, что ее термостабильность одна из самых высоких среди известных пенициллинацилаз G. Анализ структуры этого фермента свидетельствует, что повышенная температурная стабильность связана с наличием в ß-субъединице дисульфидной связи между остатками Cys492 и Cys525 (на рис. 5 выделены малиновым цветом), которой нет в .ЕсПА. Структура А/ПА демонстрирует высокую пространственную гомологию с таковой для .ЕсПА. Компьютерное наложение структур этих ферментов показывает, что молекула А/ПА обладает такой же пространственной организацией полипептидной цепи, особенно в области активного центра. Небольшие отклонения в укладке полипептидной цепи обнаруживаются только на «периферии» во внешней оболочке фермента. Следует отметить, что обе структуры А/ПА имеют низкое по современным меркам разрешение - 3.3 и 3.5 Â для PDB3K3W.ENT и PDB3ML0.ENT соответственно. Такое разрешение не позволяет судить о положении и взаимодействии отдельных остатков в области ак-
тивного центра, что особенно важно при обсуждении их роли в катализе.
структура активного центра ЕсПА
Строение каталитического домена
В ранних работах по изучению ПА было показано, что ключевую роль в катализе играет остаток серина. Ковалентная модификация этого остатка при помощи фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ) приводит к полной потере ферментом каталитической активности [74]. Данные рентгеноструктурного анализа ковалентного комплекса ПА с ФМСФ (PDB 1PNM) [18] уточнили, что этим ключевым остатком является N-концевой остаток серина p-цепи. Вблизи остатка pSerl нет имидазольных и карбоксильных групп, которые обычно присутствуют в активном центре сериновых протеиназ и принимают участие в каталитических актах ацилирования и деацилирования посредством переноса протона. Поэтому ПА отнесли к классу так называемых гидролаз с N-концевым нуклеофилом или Ntn-классу (N-terminal nucleophile) [75].
На основании данных по структуре .ЕсПА в 1995 г. была предложена модель каталитического механизма Ntn-гидролаз [24]. N-Концевой остаток серина pSerl выступает в роли нуклеофила (на рис. 6 показан красным). В ходе реакции ковалентный интермедиат формируется через образование переходного состояния, которое стабилизируется так называемым оксианионным центром. Рядом с нуклеофилом PSerl расположен остаток PGln23 (рис. 6, показан оранжевым). Этот остаток повышает нуклеофильность каталитического серина. Оксианионный центр образуют остатки PAsn242 и PAla69 (на рис. 6 выделены малиновым).
Сравнение аминокислотных последовательностей ПА-G из различных источников (рис. 3) свидетельствует, что остаток PAsn242 строго консервативен для всех представленных ферментов, в то время как остаток PAla69 встречается только в половине последовательностей, а в остальных четырех случаях на этом месте располагается остаток аспарагина.
Строение субстратсвязывающего домена
Субстратсвязывающий домен активного центра состоит из двух поддоменов - S1 и S2. Наиболее высокую специфичность проявляет субдомен Sl, он отвечает за связывание ацильной части субстрата и состоит в основном из гидрофобных остатков. Закрытая структура этого домена и его гидрофобность делают фермент очень селективным по отношению к бензольному кольцу с небольшими заместителями у Са-атома или ароматического кольца. Основными
остатками, которые формируют закрытую структуру домена S1, являются следующие: аМеИ42, аPhe146, pPhe24, pPhe57, рТгр154, Р11е177 и pSer67 (на рис. 6 выделены зеленым). Их дополняют остатки РРго22, PGln23, pVаl56, pТhr68, pPhe71, PLeu253 и pPhe256 [24, 73] (на рис. 6 не показаны). Как видно из перечисленного списка, только два остатка принадлежат а-субъединице, а большинство гидрофобных остатков, играющих основную роль в связывании ацильной части субстрата, находятся в Р-цепи. Стерически ограниченная гидрофобная полость в свободном состоянии имеет термодинамически невыгодный контакт с окружающей средой. В результате гидрофобного взаимодействия субстрата с ферментом имеет место двойной выигрыш в энергии. Во-первых, за счет энергии переноса гидрофобного субстрата из воды в гидрофобную полость фермента и, во-вторых, за счет вытеснения воды из активного центра.
Предполагаемые л-л-взаимодействия существуют между бензольными кольцами фенилуксусной кислоты (ФУК) и pPhe24, которые располагаются параллельно друг другу. Остаток аPhe146 находится на противоположной стороне гидрофобного кармана. Он также взаимодействует с ФУК и при этом экранирует активный центр от растворителя. Еще один остаток фенилаланина, pPhe57, локализован на дне полости. Наименьшее расстояние между ним и ингибитором составляет 4.7 А, что слишком много для прямого взаимодействия. Однако этот остаток может быть важен для поддержания структуры сайта связывания, поскольку находится на расстоянии 3.5 и 3.9 А от остатков РРго22 и pPhe24 соответственно, которые непосредственно участвуют в связывании субстрата.
Второй важный субдомен субстратсвязывающего участка активного центра - поддомен S2, отвечающий за связывание нуклеофильной части. Он представляет собой дно чашеобразной выемки в центре структуры и обеспечивает довольно широкую специфичность фермента к нуклеофильной части. Кроме того, этот субдомен энантиоселективен и дает возможность использовать фермент для разделения оптических изомеров аминов. Домен S2 составляют остатки аА^145, аPhe146, pPhe71 и РА^263 (рис. 6, выделены желтым) [76-80].
Как показывает анализ структуры комплекса неактивного мутанта .ЕсПА рАзп241А1а с пенициллином [79], антибиотик на первом этапе связывается в открытой конформации, что позволяет объемной амидной части субстрата войти в активный центр фермента. В открытой конфомации фенильное кольцо остатка pPhe71 оказывается в плоскости, параллельной в-лактамному кольцу субстрата. Более того, в результате сорбции субстрата возникают ван-дер-ваальсовы взаимодействия между метильной груп-
пой пенициллина и С81-атомом aPhe146, что также усиливает связывание.
Комплекс нативного фермента с «медленным» субстратом сульфоксидом пенициллина G (PDB 1PNM) дает представление о структуре фермента перед актом катализа [78]. Позиции остатков aArg145 и аPhe146 в данном случае соответствуют закрытой конформации, а амидная группа ßAsn241 образует водородную связь с карбонильным кислородом субстрата.
Мутационный анализ остатков aArg145 и ßArg263 показывает, что оба остатка существенны для катализа, а ßArg263 необходим также для автокатали-тического созревания [77]. Полученные структурные и кинетические данные также указывают на то, что остаток ßArg263 принимает участие в стабилизации переходного состояния, положительный заряд которого увеличивает полярность оксианионного центра. Следует отметить, что остатки как ßArg263, так и aArg145 консервативны и присутствуют в пе-нициллинацилазах G почти из всех известных источников (см. рис. 2).
Еще одной особенностью каталитического механизма ПА является существование активного центра в открытой и закрытой конформации, что было показано в работе [80], в которой были определены структуры Е^А в комплексе с различными лигандами. Открытая конформация необходима для связывания субстрата, а для катализа необходимо экранирование активного центра от растворителя, что достигается в закрытой конформации.
белковая инженерия ПА-G
Раньше основным подходом для увеличения эффективности промышленно значимых процессов была оптимизация условий биокаталитического процесса. Такая оптимизация проводилась на основании кинетических параметров ферментативной реакции и физико-химических свойств компонентов реакционной среды. Такой подход вполне оправдывает себя и дает возможность получить очень хорошие результаты. Однако в настоящее время этот подход практически полностью реализовал свой потенциал и уходит на второй план, уступая место дизайну самих ферментов.
Рентгеноструктурный анализ ПА, ее мутантов и комплексов с различными субстратами открыл совершенно новые возможности как для понимания структурно-функциональных взаимосвязей, так и для рационального дизайна активного центра фермента. Цель такого дизайна улучшение свойств фермента, в первую очередь тех, которые могли бы увеличить эффективность ПА в реакциях синтеза антибиотиков и разделения энантиомеров.
В силу термодинамических причин для синтеза антибиотиков используется не прямая конденсация, а реакция нуклеофильного замещения. Минимальная схема приведена ниже:
Таблица 3. Синтетические свойства родительских и гибридных ПА (15 мМ D-ФГА, 25 мМ 6-АПК, рН 7.0)
Минимальная схема получения полусинтетических Р-лактамных антибиотиков с помощью реакции нуклеофильного замещения. Е, S и ES - фермент, субстрат (донор ацильной части) и фермент-субстратный комплекс соответственно, ЕА, № и ЕА№ - ацилфер-мент, нуклеофил и двойной комплекс ацилфермент-нуклеофил соответственно. К5, Кп и Кр - константы связывания субстрата, нуклеофила и продукта синтеза со свободным ферментом Е, ацилферментом ЕА и свободным ферментом Е соответственно.
В работах [81, 82] приведен подробный анализ этой схемы, а также различных ее модификаций. Основным результатом проведенного анализа является вывод о том, что для описания эффективности процесса нельзя использовать «привычные» энзимоло-гам параметры, такие, как величины каталитической константы, константы Михаэлиса и констант ингибирования продуктами реакции. Вместо них используют параметры а, в и у. Параметр а = (к 4/Кр)/(к2/Кз) характеризует специфичность фермента по отношению к продукту и исходному ацильному донору, параметр в = к4/(к3-Кп) - максимальную нуклеофильную активность акцептора, а у = к5/к4 - способность тройного комплекса ЕАПи превращаться по гидролитическому или синтетическому пути (соотношение скоростей синтеза и гидролиза S/H при превращении комплекса ЕАПи). В связи с вышесказанным, именно эти параметры и будут нами использованы для оценки эффективности экспериментов по белковой инженерии ПА при исследовании мутантных ферментов в синтезе антибиотиков.
Получение химерных ПА с помощью генной мозаики
В настоящее время для получения мутантных ферментов с улучшенными свойствами широко используются самые различные подходы, основанные как на упорядоченном, так и на неупорядоченном введении аминокислотных замен и даже целых фрагментов полипеп-тидной цепи. Одним из таких методов, который стал популярен в последние годы и который успешно ис-
Фермент а в, мМ-1 Y P , мМ max’ %
ПА E. coli 7.8 78 0.14 2.2 100
ПА K. cryocrescens 12.7 98 0.19 2.1 110
ПА P. rettgeri 5.8 32 0.30 1.9 59
ПА 6G8 11.1 130 0.12 2.6 9 1
ПА 73C4 11.6 120 0.12 2.4 95
ПА 6B11 6.4 115 0.13 2.5 115
пользуется для улучшения свойств ферментов, вовлеченных в технологические процессы, является генная мозаика (DNA shuffling). Этот метод основан на рекомбинации генов гомологичных ферментов из различных организмов, в результате чего получаются химерные белки с самым разнообразным набором отдельных фрагментов из исходных ферментов.
Методика генной мозаики была применена для пе-нициллинацилаз из E. coli, K. cryocrescens и P. rettgeri [83]. Степень идентичности между генами этих ферментов составляет 77% (E. coli - K. cryocrescens), 61% (E. coli - P. rettgeri) и 61% (K. cryocrescens - P. rettgeri). Анализ 81 трансформанта выявил 3 гибридных фермента как с более высокой каталитической активностью (vps), так и с улучшенными синтетическими свойствами (табл. 3).
Интересно отметить, что для гибрида 6B11 избирательно улучшаются все параметры, при этом уменьшение а, что было показано в независимом эксперименте, вызвано двукратным увеличением Кр для продукта синтеза - ампициллина, а для гибрида 73С4 увеличение а вызвано двукратным увеличением KS для D-ФГА.
Секвенирование показало, что гибридные мутанты 6B11 и 73С4 получены за счет включения в ген ПА из E. coli участков гена ПА из K. cryocrescens. Также были найдены случайные мутации, не относящиеся ни к одному из родительских генов, большинство из которых находилось далеко от активного центра. Однако даже такие мутации могут быть достаточно эффективны. Так, мутация остатка PGly385Ser, находящегося на расстоянии 13.5 А от активного центра и найденная в гибриде 6G8, может влиять на доступность активного центра в целом. Для изучения вклада этой мутации в синтетические свойства гибрида 6G8
Таблица 4. Каталитическая эффективность мутантных ЕсПА в реакциях синтеза антибиотиков [84]
Фермент Донор ацильной части Ампициллин Цефалексин
а ß, мМ-1 1/Y а ß, мМ-1 1/Y
PAS2 ФГА 13.2 0.5 6 7.3 0.5 59
ФГМ 16.4 0.5 6 9.1 0.5 59
aR160K aF161L ßF24M ФГА 218 6.3 364 58.8 18.4 69
ФГМ 8.8 6.3 364 2.4 18.4 69
ßF24A ФГА 209 10.2 286 СО СО 8 21.5 154
ФГМ 11.6 10.2 286 4.9 21.5 154
aR160P aF161A ßF24A ФГА 200 4.9 167 57.2 21.1 58
ФГМ 7.6 4.9 167 2.2 21.1 58
авторы сделали соответствующую одиночную замену в ПА E. coli. Полученные результаты впечатляют своей непредсказуемостью: максимальный выход продукта увеличился на 22%, а соотношение S/H на 80% по сравнению с ферментом дикого типа в идентичных условиях, при этом также не наблюдалось увеличения параметра а. Аналогично была обнаружена случайная мутация aAsp148Gly, которая для вновь созданного одиночного мутанта дает увеличение выхода в синтезе ампициллина на 20% при увеличении S/H на 80%. В отличие от предыдущего случая, этот эффект можно объяснить тем, что остаток aAsp148 расположен в основании каталитической а-петли, ответственной за конформационные переходы в активном центре, и, как было показано на примере мутагенеза остатков aArg145 и aPhe146, любые изменения в этой петле могут привести к изменению как субстратной специфичности, так и каталитической активности.
Таким образом, метод генной мозаики можно использовать не только как инструмент получения гибридных мутантов ПА с улучшенными свойствами, но и как многообещающий инструмент поиска новых мишеней для сайт-направленного мутагенеза, которые невозможно было бы предсказать на основании изучения трехмерной структуры фермента.
Комбинационный насыщающий мутагенез
В работе [84] для трех аминокислотных остатков, расположенных вблизи от активного центра фермента, aR160, aF161 и ßF24, был использован подход, сочетающий насыщающий мутагенез каждого остатка с комбинированием введенных мутаций (т.е. получали как одинарные, так и двойные, и тройные мутанты). С помощью вырожденных праймеров был проведен неупорядоченный мутагенез этих остатков и получена библиотека, содержащая более 700 различных клонов. Скрининг проводился с помощью высокоэффективной
жидкостной хроматографии по способности полученных мутантов к синтезу ампициллина. В результате были отобраны три мутанта с повышенными каталитическими характеристиками в реакции синтеза ампициллина (табл. 4). Причем один из мутантов -PF24A, также проявляет повышенные каталитические характеристики в реакции синтеза цефалексина.
Однако метод неупорядоченного мутагенеза в случае ПА не нашел широкого применения из-за отсутствия простой системы скрининга полученных мутантов. Наиболее широкое распространение получил метод направленного мутагенеза.
рациональный дизайн
Участок связывания ацильной части
Для эффективного гидролиза природных антибиотиков с целью получения Р-лактамных ядер желательна низкая специфичность к побочному продукту гидролиза бензилпенициллина - фенилуксусной кислоте, конкурентному ингибитору ПА. Для эффективного синтеза полусинтетических неприродных антибиотиков важна высокая специфичность к Са-замещенным производным ФУК (О-фенилглицин, миндальная кислота, Са-метил-ФУК), при этом достигается более полное насыщение по ацильному донору. Для природных ПА значения константы Михаэлиса для С -замещенных производных ФУК составляют величину порядка 10-100 мМ, что в 1001000 раз выше, чем для ФУК [85]. В связи с этим получение мутантов с низкими значениями константы Михаэлиса для С -замещенных ФУК и высокими константами ингибирования для ФУК представляет большой практический интерес.
В работе [86] были получены точечные pPhe24Ala и aPhe146Tyr и двойной pPhe24Ala/aPhe146Tyr мутанты, отвечающие этим требованиям. Напри-
мер, в случае мутанта .ЕсПА ßPhe24Ala ингибирование ФУК по сравнению с ферментом дикого типа было снижено в 18 раз (Kp = 1.1 и 0.06 мМ соответственно), а сродство к С -замещенным производным ФУК было увеличено в 5 раз. При конструировании мутантов авторы предположили, что замена гидрофобных остатков, составляющих основу центра связывания ацильной части, может существенно изменить специфичность фермента по отношению как к С -замещенным ФУК, так и к самому природному субстрату.
Рентгеноструктурные данные, полученные для этих мутантов в комплексе с различными производными ФУК, объясняют наблюдаемые эффекты. Так, удаление ароматического кольца в мутанте ßF24A приводит к структурным перестройкам в активном центре, в результате чего в этом мутанте ФУК связывается в открытой конформации в отличие от фермента дикого типа, где ФУК связывается в закрытой конформации. В результате такого связывания исчезают водородные связи между карбонильным кислородом ФУК и остатками ßAla69 и ßAsn241, образующими оксианионный центр, что объясняет многократное увеличение константы ингибирования.
В отличие от ФУК С -метил-ФУК в мутанте ßF24A связывается в закрытой конформации. При этом Са-СН3 занимает место удаленной фенильной группы, что приводит к десятикратному улучшению связывания.
Интересно также заметить, что мутация по остатку ßPhe24 оказывает сильное влияние на стереоспецифичность фермента по отношению к (К)-изомерам С -замещенных производных ФУК и может рассматриваться как потенциальная мишень для изменения энантиоизбирательности фермента с целью получения оптически чистых Са-замещенных производных ФУК.
Замена фенилаланина на тирозин в мутанте aF146Y не приводит к конформационным перестройкам в активном центре, что объясняет связывание ФУК, сравнимое с .ЕсПА дикого типа. Однако при связывании Са-замещенных ФУК образующиеся ван-дер-ваальсовы контакты между Са-заместителем и aTyr146:OH делают связывание более продуктивным.
В работе [87] была изменена природная пенициллиновая специфичность ПА E. coli на цефалоспори-новую, что открыло возможность использования ПА для получения 7-аминоцефалоспорановой кислоты. Для установления соответствия остатков, ответственных за связывание ароматической гидрофобной ацильной части пенициллина в ПА и линейной гидрофильной (глутарильной) ацильной части це-фалоспорина в цефалоспоринацилазе из P. diminuta (ЦА), было проведено выравнивание аминокислот-
Таблица 5. Кинетические параметры синтеза ампициллина для ЕсПА дикого типа и мутантов по аАгд145 (15 мМ D-ФГА, 25 мМ 6-АПК, pH 7.0)
Фермент а (5, мМ-1 Y P , мМ max7
ЕсПА дикий тип 7.7 80 0.14 2.2
ЕсПА aArg145Gly 29 420 0.04 3.6
ЕсПА aArg145Ser 14 350 0.05 3.3
ЕсПА aArg145Leu 15 280 0.06 2.8
ных последовательностей .ЕсПА и ЦА. На основании проведенного сравнения семь остатков гидрофобного кармана ЕсПА заменили на соответствующие семь остатков из ЦА. Полученный таким образом многоточечный мутант характеризовался восьмикратным улучшением специфичности по отношению к це-фалоспорину С. К сожалению, эти результаты пока представляют собой не более чем научную ценность, так как величина удельной активности полученного мутанта была намного ниже активности природного цефалоспоринового фермента.
Направленный мутагенез на участке связывания нуклеофила
Одного лишь улучшения связывания ацильной части субстрата недостаточно для повышения синтетических способностей фермента. Как было показано в работе [88] для мутанта pPhe24Ala, улучшение связывания О-фенилглицинамида приводит также к увеличению связывания продукта синтеза - ампициллина и, как следствие, к увеличению параметра а. Однако интересным оказался тот факт, что мутации по остаткам pPhe24 и аPhe146, отвечающим за связывание ацильной части, приводят также к улучшению нуклеофильности 6-АПК более чем в 2 раза.
С одной стороны, это не противоречит базовым принципам структурной организации белковой молекулы в том, что изменение или удаление одного из звеньев белковой цепи может привести к структурным перестройкам в близлежащих областях. Мутации на участке связывания ацильной части могут, в принципе, привести к изменениям на участке связывания нуклеофила, при том что остатки pPhe24 и aPhe146 находятся на пограничной области, образуя горлышко гидрофобного кармана (рис. 6).
С другой стороны, нельзя точно определить какой из факторов - улучшение связывания нуклеофила (Кп) или уменьшение реакционной способности воды (к3, к5), играет решающую роль. Так, замена pPhe24Alа могла спровоцировать изменение поло-
жения соседнего остатка, PGlu23, координирующего деацилирующую молекулу воды и, таким образом, уменьшить скорость гидролиза. Однако на основании имеющихся данных совершенно точно установлено, что улучшение специфичности фермента по отношению к нуклеофилу приводит к увеличению в, поэтому эффекты от мутаций на участке связывания нуклеофила являются наиболее предсказуемыми. В работе [89] авторы добились значительного увеличения параметра в за счет мутаций по остатку аА^145, который по данным рентгеноструктурного анализа взаимодействует с карбоксильной группой пенициллина в закрытой конформации и может также влиять на эффективность связывания 6-АПК. Для изучения всех возможных эффектов от замены аА^145 был проведен насыщающий мутагенез. Предварительные исследования реакций ферментативного синтеза ампициллина в разбавленных растворах показали, что у всех 19 мутантов возрастает способность к переносу ацильной группы на 6-АПК. Далее были отобраны три наиболее перспективных мутанта .ЕсПА - аArg145Leu, аArg145Gly, аArg145Ser, и проведено детальное изучение их кинетических параметров (табл. 5).
Полученные данные свидетельствуют о том, что удаление положительного заряда в позиции а145 приводит к значительному увеличению нуклеофильной способности 6-АПК. Почти синхронное увеличение а наводит на мысль о том, что улучшение связывания нуклеофила (К , см. схему выше), выраженное в увеличении в, неизбежно ведет к улучшению связывания продукта синтеза (Кр, см. схему выше) и невозможно улучшить оба параметра сразу. Однако негативное влияние а можно в какой-то степени нивелировать, если выводить ампициллин из реакционной среды.
С целью уточнения влияния эффекта от замены остатка aPhe146, который, по данным рентгеноструктурного анализа, взаимодействует с метильной группой пенициллина при его связывании в открытой конформации и, в принципе, может оказывать влияние на связывание в-лактамного кольца 6-АПК, был произведен аналогичный мутационный анализ. Предварительные исследования реакций синтеза ампициллина показали, что практически у всех 19 мутантов возрастает способность к переносу ацильной группы на 6-АПК, однако каталитическая активность падает по крайней мере на порядок, что не позволяет авторам более детально исследовать их синтетические способности.
Ярким примером эффективности использования рационального дизайна для улучшения каталитических свойств ЕсПА является работа [90]. Авторами были проведены анализ структуры и компьютерное моделирование связывания в активном центре ЕсПА
ряда лигандов. Результаты моделирования показали, что мутация по остатку ßPhe71 изменяет ориентацию субстрата и усиливает взаимодействие субстратов с оксианионным центром, поэтому следовало ожидать, что мутация по этому остатку может увеличить каталитическую активность пенициллинацилазы и изменить стереоселективность, так же как и специфичность фермента по отношению к уходящей группе. Было получено четыре мутанта - ßPhe71Lys, ßPhe71Glu, ßPhe71Leu и ßPhe71Arg. Три мутанта показали более высокие каталитические характеристики при синтезе антибиотиков, а два мутанта - более высокую стереоселективность при разделении энантиомеров, однако эффект введения определенной аминокислоты для вышеописанных процессов был противоположный. Например, мутант с заменой ßPhe71Leu имел наиболее высокие каталитические характеристики в синтезе антибиотиков, в то время как его энантиоселективность была почти на порядок хуже, чем у фермента дикого типа. Самый большой эффект увеличения энантиосе-лективности наблюдался для мутанта ßPhe71Lys, однако его эффективность в синтезе антибиотиков была намного ниже по сравнению с мутантом ßPhe71Leu. На основании полученных данных был сделан вывод, что одновременное улучшение всех основных каталитических свойств фермента для использования в биокатализе вряд ли представляется возможным, и для решения конкретной задачи в зависимости от структуры субстрата необходимо проводить тонкую индивидуальную настройку фермента.
Получение пермутированного фермента
Еще один подход к изменению свойств фермента - это получение так называемых пермутиро-ванных ферментов. Как видно из рис. 4 и 5 в ПА из E. coli и A. faecalis N-конец a-субъединицы сближен с С-концом ß-субъединицы, что позволяет получить пермутированный одноцепочечный фермент за счет соединения этих концов гибким спейсером. Создание такого одноцепочечного фермента позволит получать рекомбинантный фермент прямо в цитоплазме, в этом случае будут исключены стадии транспортировки белка-предшественника в периплазму и вы-щепления межсубъединичного спейсера, которые, как было показано выше, являются основными причинами низкого выхода фермента в существующих системах экспрессии ПА-G. В настоящее время для ПА-G известна всего одна работа по получению пермутированного фермента [91]. В качестве сшивки была выбрана последовательность из четырех случайных аминокислотных остатков. Была создана библиотека мутантных клонов с геном пермутиро-ванного фермента. В результате скрининга этой библиотеки было найдено 20 клонов, продуцирующих
активный фермент, однако по величине специфической активности все полученные варианты значительно уступали ферменту дикого типа.
Стабилизация AfПА за счет образования дисуль-фидных связей
Как уже отмечалось выше, ПА из A. faecalis является одной из самых термостабильных среди известных пенициллинацилаз [20], и это свойство обусловлено наличием в структуре AfnA дисульфидной связи внутри ß-субъединицы (рис. 5). Для дальнейшей стабилизации фермента было решено ввести дополнительную дисульфидную связь [92]. Поскольку на момент проведения экспериментов (2006 г.) структура фермента еще не была определена, то авторы построили модельную структуру методом гомологичного моделирования на основе известной структуры ЕсПА. Для поиска возможных положений введения дисульфидной связи авторы использовали программу MODIP. В результате компьютерного анализа модельной структуры программой было предложено 32 варианта введения дисульфидной связи, из которых после дополнительного анализа авторы выбрали только два варианта - парные аминокислотные замены aQ3C/ßP561C и aT52C/aY64C. В случае первой пары замен должна была образоваться ковалентная связь между N-концом a-субъединицы и С-концом ß-субъединицы (рис. 5, вставка), который практически не структурирован (рис. 5). В случае второй пары замен образующаяся дисульфидная связь должна была стабилизировать петлю, соединяющую две a-спирали. Анализ свойств полученных мутантов показал, что введение точечных замен aGlu3Cys и ßPro561Cys не влияло на скорость термоинактивации, в то время как в случае двойной замены тем-
пература, при которой фермент терял 50% активности, за 20 мин возросла на 3оС - с 50 до 53оС. В случае второй пары замен термостабильность фермента не изменилась. Отсутствие эффекта стабилизации для второй пары замен позволяет предположить, что стабильность двух а-спиралей не является критической для общей стабильности белковой глобулы. Это предположение согласуется с последними данными рентгеноструктурного анализа, согласно которым эти а-спирали имеют дополнительные контакты со структурными элементами в-субъединицы.
выводы
Несмотря на большое количество работ по белковой инженерии пенициллинацилаз, проблема направленного изменения каталитических свойств и стабильности ПА еще очень далека от решения. Как видно из приведенных данных, на катализ влияют остатки в радиусе 15-20 А вокруг каталитического центра фермента. Поэтому задача детального изучения роли аминокислотных остатков в области активного центра в катализе и субстратной специфичности и получение информации об их влиянии на конкретные каталитические характеристики с теми или иными субстратами являются очень актуальными как с точки зрения практической биотехнологии, так и с позиций фундаментальной науки. Можно надеяться, что выделение и изучение свойств пени-циллинацилаз из других источников также позволит выявить основные закономерности во взаимосвязи структура-функция этого фермента.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 10-04-01334-а).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Sakaguchi K., Murao S. // J. Agr. Chem. Soc. Japan. 1950. V. 23. P 1-3.
2. Claridge C.A., Luttinger J.R., Lein J. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1963. V. 113. P. 1008-1012.
3. Hamilton-Miller J.M. // Bacteriol. Rev. 1966. V. 30. P 761-771.
4. Valle F., Balbas P., Merino E., et al. // Trends Biochem. Sci. 1991. V. 16. P. 36-40.
5. Arroyo M., de la Mata I., Acebal C., et al. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. V. 60. P 507-514.
6. Rajendhran J., Gunasekaran P // J. Biosci. Bioeng. 2004. V. 97.
P 1-13.
7. Polderman-Tijmes J.J. Biochemical characterization of alpha-amino acid ester hydrolases. Ph.D. Thesis. Groningen: University of Groningen, 2004.
8. Deshpande B.S., Ambedkar S.S., Sudhakaran V.K., et al. // World J. Microbiol. Biotechnol. 1994. V. 10. P. 129-138.
9. Murao S. // J. Agr. Chem. Soc. Japan. 1955. V. 29. P. 404-407.
10. Batchelor F.R., Doyle F.P, Nayler J.H.C., et al. // Nature. 1959. V. 183. P 257-259.
11. Vanderhaeghe H. // Methods Enzymol. 1975. V. 43. P. 721-728.
12. Shewale J.G., Deshpande B.S., Sudhakaran V.K., et al. // Process Biochem. Int. 1990. V. 25. P. 97-103.
13. Shewale J.G., Sudhakaran V.K. // Enzyme Microb. Technol.
1997. V. 20. P. 402-410.
14. Bruggink A., Roos E.C., De Vroom E. // Org. Process. Res. Dev.
1998. V. 2. P. 128-133.
15. OBHgac B.K., KnecoB A.A., Htic n.C. / // Ahtm6motmkm. 1976. T. 21. C. 698-704
16. Pundle A., SivaRaman H. // Curr. Microbiol. 1997. V. 34.
P. 144-148.
17. Sudhakaran V.K., Shewale J.G. // Hindustan Antibiot. Bull. 1995. V. 37. P. 9-15.
18. Hewitt L., Kasche V., Lummer K., et al. // J. Mol. Biol. 2000.
V. 302. P. 887-898.
19. Savidge T.A., Cole M. // Methods Enzymol. 1975. V. 43. P. 705-721.
20. Verhaert R.M., Riemens A.M., van der Laan J.M. // Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63. P. 3412-3418.
21. Cheng T., Chen M., Zheng H. // Protein. Expr. Purif. 2006.
V. 46. P. 107-113.
22. Kim D.J., Byun S.M. // Biochim. Biophys. Acta. 1990. V. 1040.
P. 12-18.
23. Schumacher G., Sizmann D., Haug H., et al. // Nucleic. Acids Res. 1986. V. 14. P. 5713-5727.
24. Duggleby H.J., Tolley S.P., Hill C.P., et al. // Nature. 1995.
V. 373. P. 264-268.
25. Kasche V., Lummer K., Nurk A., et al. // Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1433. P. 76-86.
26. Lindsay C.D., Pain R.H. // Eur. J. Biochem. 1990. V. 192. № 1.
P. 133-141.
27. Economou A. // FEBS Lett. 2000. V. 476. P. 18-21.
28. Chou C.P., Tseng J.H., Kuo B.Y., et al. // Biotechnol. Prog. 1999. V. 15. P. 439-445.
29. Berks B.C. // Mol. Microbiol. 1996. V. 22. P. 393-404.
30. Ignatova Z., Hornle C., Nurk A., et al. // Biochem. Biophys.
Res. Commun. 2002. V. 291. P. 146-149.
31. Kasche V., Ignatova Z., Markl H., et al. // Biotechnol. Prog. 2005. V. 21. P. 432-438.
32. Chou C.P., Yu C.C., Tseng J.H., et al. // Biotechnol. Bioeng.
1999. V. 63. P. 263-272.
33. Cai G., Zhu S., Yang S., et al. // Appl. Environ. Microbiol. 2004. V. 70. P. 2764-2770.
34. Zhang L.F., Li Z.W., Zhang Q.J. // Chin. J. Biotechnol. 1991. V. 7. P. 63-72.
35. Martin L., Prieto M.A., Cortes E., et al. // FEMS Microbiol. Lett. 1995. V. 125. P. 287-292.
36. Polderman-Tijmes J.J., Jekel P.A., de Vries E.J., et al. // Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68. P. 211-218.
37. Kang H.K., Park J.Y., Ahn J.S., et al. // J. Microbiol. Biotechnol. 2009. V. 19. P. 172-177.
38. Lu Y., Chi X., Yang Q., et al. // Extremophiles. 2009. V. 13.
P. 875-884.
39. Lu Y., Zhao H., Zhang C., et. al. // Biotechnol. Lett. 2009. V. 31. P. 1525-1530.
40. Madhavan A., Tamalampudi S., Ushida K., et al. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2009. V. 82. P. 1067-1078.
41. Karimi M., De Meyer B., Hilson P. // Trends. Plant. Sci. 2005.
V. 10. P. 103-105.
42. Karimi M., Depicker A., Hilson P. // Plant. Physiol. 2007. V. 145. P. 1144-1154.
43. Sando T., Takeno S., Watanabe N. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2008. V. 72. P. 2903-2917.
44. Cao Y., Lu Z., Sun P., et al. // Wei Sheng Wu Xue Bao. 2008.
V. 48. P. 312-316.
45. Khodabandehloo M., Shamsi Shahrabadi M., Keyvani H. // Iran Biomed. J. 2009. V. 13. P. 9-18.
46. Liu Z., Yang G., Li B. // Mol. Biotechnol. 2003. V. 24. P. 21-26.
47. Liu Z., Yang G.Z., Chi C.W., et al. // Protein. Pept. Lett. 2002.
V. 9. P. 419-426.
48. Farrokhi N., Hrmova M., Burton R.A., et al. // Methods Mol. Biol. 2009. V. 513. P. 175-198.
49. Schwarz D., Dotsch V., Bernhard F. // Proteomics. 2008. V. 8.
P. 3933-3946.
50. Schwarz D., Junge F., Durst F., et al. // Nat. Protoc. 2007. V. 2.
P. 2945-2957.
51. Спирин А.С. // Биоорган. химия. 1992. Т. 18. C. 1394-1402.
52. Oh S.J., Kim Y.C., Park Y.W., et al. // Gene. 1987. V. 56. P. 87-97.
53. Chou C.P., Kuo B.Y., Lin W.J. // J. Biosci. Bioeng. 1999. V. 88.
P. 160-167.
54. Ohashi H., Katsuta Y., Nagashima M., et al. // Appl. Environ. Microbiol. 1989. V. 55. P. 1351-1356.
55. Daumy G.O., Williams J.A., McColl A.S., et al. // J. Bacteriol. 1986. V. 168. P. 431-433.
56. Barbero J.L., Buesa J.M., Gonzalez de Buitrago G., et al. // Gene. 1986. V. 49. P. 69-80.
57. Meevootisom V., Somsuk P., Prachaktam R., et al. // Appl. Environ. Microbiol. 1983. V. 46. P. 1227-1229.
58. Dai M., Zhu Y., Yang Y., et al. // Eur. J. Biochem. 2001. V. 268.
P. 1298-1303
59. Ignatova Z., Mahsunah A., Georgieva M., et al. // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. P. 1237-1245.
60. Jiang Y.M., Tong W.Y., Wei D.Z. // Biotechnol. Prog. 2007. V. 23. P. 1031-1037.
61. Norris V., Grant S., Freestone P., et al. // J. Bacteriol. 1996.
V. 178. P. 3677-3682.
62. Scherrer S., Robas N., Zouheiry H., et al. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994. V. 42. P. 85-91.
63. Xu Y., Rosenkranz S., Weng C.L., et al. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. V. 72. P. 529-536.
64. Berks B.C., Sargent F., Palmer T. // Mol. Microbiol. 2000. V. 35. P. 260-274.
65. Narayanan N., Xu Y., Chou C.P // Biotechnol. Prog. 2006. V. 22. P. 1518-1523.
66. Xu Y., Weng C.L., Narayanan N., et al. // Appl. Environ. Microbiol. 2005. V. 71. P. 6247-6253.
67. Maresova H., Stepanek V., Kyslik P. // Biotechnol. Bioeng.
2001. V. 75. P. 46-52.
68. Sriubolmas N., Panbangred W., Sriurairatana S., et al. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. V. 47. P 373-378.
69. Vohra PK., Sharma R., Kashyap D.R., et al. // Biotechnol. Lett. 2001. V. 23. P. 531-535.
70. De Leon A., Breceda G.B., Barba de la Rosa A.P., et al. // Biotechnol. Lett. 2003. V. 25. P. 1397-1402.
71. Huang S.W., Lin Y.H., Chin H.L., et al. // Biotechnol. Prog. 2002. V. 18. P. 668-671.
72. Deak P.M., Lutz-Wahl S., Bothe H., et al. // Biotechnol. Lett. 2003. V. 25. P. 397-400.
73. Oinonen C., Rouvinen J. // Protein. Sci. 2000. V. 9. P. 2329-2337.
74. Швядас В.К., Марголин А.Л., Шерстюк С.Ф. и др. // Биоорган. химия. 1977. Т. 3. С. 546-554.
75. Brannigan J.A., Dodson G., Duggleby H.J. // Nature. 1995.
V. 378. P. 416-419.
76. Alkema W.B., Hensgens C.M., Snijder H.J., et al. // Protein. Eng. Des. Sel. 2004. V. 17. P. 473-480.
77. Alkema W.B., Prins A.K., de Vries E., et al. // Biochem. J. 2002. V. 365. P. 303-309.
78. McVey C.E., Walsh M.A., Dodson G.G., et al. // J. Mol. Biol.
2001. V. 313. P. 139-150.
79. Alkema W.B., Hensgens C.M., Kroezinga E.H., et al. // Protein. Eng. 2000. V. 13. P. 857-863.
80. Done S.H., Brannigan J.A., Moody PC., et al. // J. Mol. Biol.
1998. V. 284. P. 463-475.
81. Gololobov M.Yu., Borisov I.L., Svedas V.K. // J. Theor. Biol.
1989. V. 140. P. 193-204.
82. Youshko M.I., Bukhanov A.L., Svedas V.K. // Biochemistry (Moscow). 2003. V. 68. № 3. P 334-338.
83. Jager S.A.W., Jekel P.A., Janssen D.B. // Enzyme Microb. Technol. 2007. V. 40. P. 1335-1344.
84. Gabor E.M., Janssen D.B. // Protein Eng. Des. Sel. 2004. V. 17.
P. 571-579.
85. Margolin A.L., Svedas V.K., Berezin I.V., et al. // Biochim. Biophys. Acta. 1980. V. 616. P. 283-289.
86. Guranda D.T., van Langen L.M., van Rantwijk F., et al. // Tetrahedron. Asym. 2001. V. 12. P. 1645-1650.
87. Oh B., Kim K., Park J., et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. V. 319. P. 486-492.
88. Alkema W.B., Dijkhuis A.J., De Vries E., et al. // Eur. J. Biochem. 2002. V. 269. P 2093-2100.
89. Jager S.A., Shapovalova I.V., Jekel P.A., et al. // J. Biotechnol. 2008. V. 133. P. 18-26.
90. Шаповалова И.В., Алкема В.Б.Л., Ямскова О.В. и др. // Acta Naturae. 2009. T. 1. C. 102-109.
91. Flores G., Soberon X., Osuna J. // Protein Sci. 2004. V. 13.
P. 1677-1683.
92. Wang T., Zhu H., Ma X., et al. // Protein. Pept. Lett. 2006. V. 13. P. 177-183.
