CC BY
172
УДК 577.2.08
раздел БИОЛОГИЯ
Обзор
АУТЕНТИЧНОСТЬ, СОХРАННОСТЬ И ДОСТУПНОСТЬ ДРЕВНЕЙ ДНК © Р. Р. Гарафутдинов, Н. Р. Нагаев, А. Р. Сахабутдинова, А. В. Чемерис
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН Россия, Республика Башкортостан, 450054 г. Уфа, пр. Октября, 71.
Тел.: +7 (347) 235 60 88.
Email: garafutdinovr@mail.ru
В данном обзоре рассматриваются основные методические проблемы, возникающие при работе с древней ДНК и обусловленные, в первую очередь, поврежденным состоянием цепей нуклеиновых кислот (сильной фрагментацией, наличием участков без азотистых оснований и др.), ничтожным количеством копий целевой мишени и высокой вероятностью внешней контаминации. Приводятся различные способы решения указанных проблем. Описываются ключевые требования к организации всех этапов работ от забора биологического материала до оснащения лабораторного пространства, приемы экспериментального и статистического подтверждения аутентичности образцов древней ДНК и исключения вклада современной ДНК, особенно в отношении ДНК человека и микроорганизмов. Приводятся данные о сохранности (целостности) нуклеиновых кислот в ископаемых останках в зависимости от их возраста и условий пребывания, кратко упоминаются оригинальные методические подходы к оценке сохранности ДНК. Описываются также различные способы «чистого» выделения (экстракции) нуклеиновых кислот из костных останков человека (костей скелета и зубов). Отдельно подчеркиваются особенности амплификации древней ДНК с помощью полимеразной цепной реакции в части используемых ферментов и праймерных систем.
Ключевые слова: древняя ДНК, современная ДНК, деконтаминация, аутентичность ДНК, выделение ДНК, амплификация, полимеразная цепная реакция.
которых основными объектами была дДНК человека. Публикации, в которых объектами служили прочие древние организмы, упоминаются лишь в том случае, если в них отражены принципиально новые сведения или предложены оригинальные методические подходы.
Введение
Древняя ДНК (дДНК) в широком понимании -это ДНК, выделенная из биологических материалов, длительное время подвергавшихся воздействию разрушительных факторов окружающей среды. Первое сообщение о клонировании и секвенировании дДНК датировано 1984 г. [1], когда было определено 229 п.н. митохондриальной ДНК квагги - вида, близкородственного африканской зебре. Квагга была истреблена еще в 1883 г., и для анализа использовалась музейная шкура этого животного. В 1985 г. последовало сообщение о секвенировании фрагмента ДНК египетской мумии, имевшей возраст около 2400 лет [2], однако спустя некоторое время выяснилось, что сведения неверны, поскольку автор клонировал собственную ДНК. Следует отметить, что две эти работы были выполнены еще до появления полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволившей позднее работать с крайне малым исходным количеством ДНК благодаря целенаправленной амплификации специфичных участков любых геномов [3-5]. С одной стороны, высокая чувствительность ПЦР существенно расширила круг исследуемых древних объектов, но при этом столь же резко повысила требования к тщательности проведения экспериментов, поскольку присутствие даже единичных молекул современной ДНК составляет серьезную конкуренцию в ходе амплификации. Тем не менее, в последующие годы появилось множество работ, в которых сообщалось об успешной амплификации и секвенировании фрагментов дДНК различных организмов разных уровней генетической сложности, возраст которых насчитывал от десятков и сотен до десятков миллионов лет [6-8]. Оказалось, что часть этих работ несла ложную информацию, однако в целом полученные результаты оказались весьма интересными не только для молекулярных биологов, но и представителей других научных дисциплин - ботаников, зоологов, историков, археологов, геологов.
Наибольший интерес в настоящее время представляет изучение ДНК древних людей, поэтому основное внимание в данном обзоре уделено работам, в
Организация работ с древней ДНК
С развитием метода ПЦР пришло понимание того, как следует проводить исследования дДНК, и сегодня лаборатория, ведущая подобные эксперименты, должна быть оборудована соответствующим образом [9]. Известно, что при проведении обычной ПЦР существует проблема возникновения ложно-позитивных результатов, решаемая разными способами [10]. При амплификации дДНК она еще более усугубляется крайне малым количеством экстрагируемых из древних объектов молекул нуклеиновых кислот и их поврежденным состоянием.
Лаборатория, в которой проводятся эксперименты с дДНК, как и обычная ПЦР-лаборатория, должна быть обязательно зонирована, т.е. этапы выделения ДНК, ее амплификации и детекции результатов должны быть пространственно разобщены. В идеальном случае помещения, где ведется экстракция дДНК, должны быть размещены на удаленном расстоянии от мест, где проводятся последующие процедуры и прочие работы с современной ДНК. В одной из статей даже сообщается, что лаборатория, где ведется выделение дДНК, расположена в 15 минутах ходьбы от помещения, где проводится ПЦР и ведется анализ результатов амплификации [11]. При этом само помещение для выделения дДНК должно быть снабжено ультрафиолетовыми лампами, ПЦР-боксом, в том числе перчаточным, иметь отдельную приточную вентиляцию, обеспечивающую изнутри несколько повышенное по сравнению с атмосферным давление, исключающее попадание тока воздуха (потенциально загрязненного современной ДНК) снаружи. Регулярно должна проводиться влажная уборка помещения с протиранием рабочих поверхностей 5%-ным хлорок-сом (водный раствор гипохлорита натрия), разрушающим ДНК, и дезактивация ДНК во всем остальном
пространстве ультрафиолетовым светом. Все операции при работе с древним материалом должны проводиться в защитных масках, в резиновых перчатках, которые необходимо регулярно менять для исключения перекрестного загрязнения образцов, а еще лучше вести эксперименты в специальных изолированных комбинезонах. Такие строгие требования касаются главным образом тех лабораторий, в которых ведутся работы с древней человеческой ДНК из археологических источников и с криминалистическими образцами, имеющимися в крайне малых количествах или представленными в сильно поврежденном виде. Если объектами исследований служат другие организмы (кроме микроорганизмов и близкородственных человеку видов приматов), то можно не столь сильно опасаться попадания современной ДНК, которая преимущественно может быть человеческой или бактериальной.
Аутентичность древней ДНК
Вопросам аутентичности дДНК уже на протяжении многих лет уделяется повышенное внимание. Аутентичность отчасти достигается специфичным отжигом используемых праймеров, подобранных к конкретным участкам амплифицируемого фрагмента ДНК за исключением случаев, когда приходится работать с человеческой или бактериальной ДНК. Для последних специфичность праймеров не обеспечивает аутентичности, поэтому для них требуются особые условия обращения.
Считается, что древние образцы загрязняются современной ДНК еще на стадии археологических раскопок [12]. Была проведена проверка того, как на чистоту молекулярно-биологических экспериментов влияют способы обращения с археологическим материалом [13]. Для этого исследуемые образцы были разделены на две группы по способу изъятия из почвы. Одну группу составили костные останки, получаемые обычным способом, а другую - останки, которые археологи раскапывали в условиях, исключающих попадание на древний материал современной ДНК и сразу отправляли тщательно упакованные образцы в генетическую лабораторию. При проведении ПЦР вторая группа образцов показала лишь немного лучшие результаты, что не удивительно, поскольку такой тип загрязнения (внешняя контаминация) не является критичным и относительно легко исключается на последующих этапах работы. Гораздо более серьезную опасность представляют ПЦР-реакционные смеси, содержащие праймеры, ДНК-полимеразы, прочие ингредиенты, которые почти неизбежно могут содержать в себе ДНК изготавливающих их людей.
Helgason с соавт. был предложен статистический подход к верификации секвенированных последовательностей, основанный на наиболее вероятных пост-мортальных модификациях отдельных нуклеотидов [14]. Недавно написана компьютерная программа PMDtools (PostMortem Damage), позволяющая осуществлять верификацию древнего амплифицируемого материала [15]. Рекомендуется также проведение экспериментов с древней ДНК «вслепую», когда один исследователь подбирает древние образцы, шифрует их и отдает другим экспериментаторам, которые таким образом имеют дело с анонимными образцами [16]. По мнению авторов, это способствовало некоторому повышению достоверности результатов. Для доказательства аутентичности дДНК немецкими авторами был предложен оригинальный подход, заключа-
ющийся в проведении сравнительной геномной гибридизации in situ с использованием равного количества меченной разными флуорохромами современной и древней ДНК, выделенной из костной ткани, не прибегая к ПЦР [17]. При аутентичности дДНК реализация данного методического подхода должна была обеспечивать равное свечение двух красителей, тогда как в противном случае разница в их свечении свидетельствовала бы о присутствии современной ДНК в препарате дДНК. Для обнаружения контаминации был предложен высокочувствительный метод детекции с помощью ПЦР со специфическими праймерами Alu-повторов, присущих только человеку и высшим приматам, копийность которых в геноме достигает миллиона [18]. Несколько позднее этой же группой авторов была выполнена сходная работа, где мишенью служила уже альфа-сателлитная ДНК [19].
В качестве примера того, что аутентичность дДНК может дополнительно проверяться (ставиться под сомнение) соотнесением возраста и места находки палеообразцов с полученными результатами, можно привести работу греческих ученых, которые в 2006 г. сообщили об амплификации 43 п.н. фрагмента гена цитохрома b из дДНК, выделенной из костных останков карликовых слонов, найденных на островах Средиземного моря [20]. Возраст находок варьировал от 4.2 до 800 тысяч лет. При этом авторы отметили, что достоверность результатов была подтверждена проведением независимых экспериментов в двух лабораториях. Однако несколько позже достоверность результатов все же была поставлена под сомнение по причине возраста одной из находок (800 тысяч лет), слишком теплого климата географического места, где эти кости были обнаружены, а также ввиду вопросов к проведению «вложенной» ПЦР и некоторым другим моментам работы [21, 22].
Сохранность древней ДНК
В живых организмах постоянно происходят спонтанные химические точечные изменения азотистых оснований и сахарофосфатного остова молекул ДНК. Так, например, считается, что только депурини-зация в клетках человека происходит с частотой от 2 до 10 тысяч повреждений на геном за сутки [23]. Однако в живых клетках сильны процессы репарации, в результате которых в подавляющем большинстве случаев такие повреждения ликвидируются. После смерти репарационные процессы в организме прекращаются, что вызывает постмортальные изменения в ДНК. Некоторое время еще могут работать присутствующие в умерших клетках эндогенные нуклеазы, начинающие процесс разрушения (фрагментации) молекул ДНК. Возможно даже, что некоторые пост-мортальные изменения все же успевают исправить противодействующие нуклеазам другие ферменты нуклеинового обмена, но со временем на «смену» первым придут аналогичные ферменты микроорганизмов, проникающие в уже не функционирующие клетки, продолжая разрушать ДНК отмершего организма.
Таким образом, практически любая дДНК содержит довольно большое число постмортальных изменений и повреждений, зависящее как от возраста образца, так и от условий, в которых он находился, включая температурный режим [24]. Наилучшим консервантом и местом хранения древних образцов служит янтарь, представляющий собой смолу древних хвойных деревьев. При попадании в нее, например,
насекомого полностью исключался доступ к его тканям кислорода и инвазия бактерий, что служит основанием рассчитывать на лучшую сохранность ДНК. Однако было отмечено [25], что ввиду плохой воспроизводимости результатов амплификации, по всей видимости, даже в янтаре ДНК на протяжении миллионов лет не сохраняет достаточную целостность. Относительно недавно австралийскими учеными было обнаружено, что хорошую сохранность как митохон-дриальной, так и ядерной ДНК обеспечивает яичная скорлупа, поскольку она несет меньшую на два порядка бактериальную нагрузку, чем обычные кости [26].
Результатом ферментативного разрушения ДНК в отмерших организмах и неферментативного воздействия факторов окружающей среды становятся разрывы цепей ДНК, приводящие к сильной фрагментации этого биополимера. Считается, что в зависимости от условий, в которых находился отмерший организм, ожидаемый размер фрагментов ДНК после экстракции из разных тканей может достигать нескольких сотен пар нуклеотидов, и лишь в исключительных случаях (при нахождении останков в вечной мерзлоте, в безводных условиях, без доступа кислорода) можно ожидать амплификации фрагментов, превышающих 1000 пар нуклеотидов. Так, было показано, что при проведении ПЦР митохондриальной ДНК обнаруженного в вечной мерзлоте мамонта амплифицировались весьма крупные фрагменты до 1600-1700 п.н. [27]. Однако в большинстве случаев фрагменты ДНК такого размера не сохраняются, поэтому для анализа протяженных участков были предложены способы увеличения длины имеющихся обломков. Так, ферментативная обработка дДНК с помощью ДНК-полимеразы I E.coli и Т4 ДНК-лигазы, фактически выполняющих репарирую-щие функции в системе in vitro, приводит к появлению при амплификации более крупных фрагментов ДНК, чем удавалось их получить без использования этих ферментов [28, 29].
Ввиду довольно высокой трудоемкости при работе с дДНК, были предложены методы, косвенно свидетельствующие о сохранности данного биополимера в древних образцах. Было обнаружено, что рацемизация аминокислот аланина, лейцина и аспарагино-вой кислоты может указывать на степень сохранности древней ДНК; если соотношение D/L-форм аспараги-новой кислоты превышает значение 0.08, то образцы можно даже не использовать для выделения ДНК [30]. С помощью этого подхода было показано, что ткани насекомых из янтаря содержат нерацемизированные аминокислоты, что подтвердило их высокую пригодность для изучения дДНК [31]. Однако определение рацемического состояния аминокислот - довольно непростой метод, требующий специальной техники и значительного времени для анализа. Не так давно был предложен более быстрый способ предварительной оценки пригодности костного материала для выделения молекул ДНК и их ожидаемого размера [32]. Он заключается в использовании ИК-спектроскопии с Фурье-преобразованием, позволяющей определять соотношение интенсивностей характеристичных полос амидной и фосфатной функциональных групп в препаратах костных останков. Оказалось, что получаемые ИК-данные можно экстраполировать на ожидаемые размеры ампликонов, причем для такого анализа потребовалось всего 10 мкг порошка костной ткани. Итальянскими авторами было предложено гистохи-мически окрашивать ДНК на срезах костей для приня-
тия решения об их пригодности для экстракции ДНК [33]. Международной группой ученых было предпринято исследование по определению времени полужизни ДНК в костных образцах в зависимости от их местонахождения [34]. Было обнаружено, что, например, в модельных условиях для митохондриальной ДНК размером 242 п.н. время полужизни составляет 521 год при частоте повреждающих событий, равной 5.510-6 в год.
Выделение и очистка древней ДНК из костных образцов
Первыми этапами экстракции ДНК из древних костей и зубов (кроме случаев получения древнего материала в «стерильных» условиях) служат механическая и химическая обработки поверхностей, необходимые для удаления загрязненного слоя. Интенсивность таких обработок зависит от типа и сохранности древнего материала. Во многих случаях при экстракции ДНК из костей их подвергают механической очистке с помощью скальпеля или обычной наждачной шкурки, или применяя специальные фрезы, снимающие верхний слой костной ткани. Далее в зависимости от сохранности материала часто следует обработка в течение 1-15 мин 2-6%-ным хлороксом, разрушающим молекулы экзогенной ДНК [35, 36]. Продолжительность обработки для плохо сохранившегося материала не рекомендуют делать большой ввиду проникновения хлорокса внутрь ткани и разрушения не только экзогенной, но и эндогенной ДНК, что снижает выход последней. Однако в одной работе отмечается, что эндогенная ДНК сохраняется даже после обработки 6% хлороксом в течение 21 часа [37]. Удаление остатков гипохлорита натрия проводится многочисленными отмывками костного материала водой, прошедшей «стерилизацию» УФ-светом. Иногда вместо обработки хлороксом древние образцы для удаления экзогенной ДНК рекомендуют облучать только УФ-светом [38].
При экстракции ДНК из зубов предлагается после проведенной предварительной очистки вести последовательное сверление сначала сверлом с большим диаметром, потом с меньшим, что обеспечивает абсолютную чистоту получаемой костной стружки. При этом в одной из работ подчеркивается, что сверление с большей скоростью (1000 об/мин), вызывающей значительный нагрев образца, приводило к ухудшению качества выделяемой ДНК, тогда как использование дрели на скорости всего 100 об/мин улучшало выход амплифицируемой ДНК [11]. Однако ранее другими авторами сообщалось об использовании высокоскоростного вращения второго (тонкого) сверла (30 тыс. об/мин), которое тем не менее позволило им выделить из зуба древнюю ДНК, используя сорбцию на носителе Chelex [39].
Существуют несколько способов экстракции ДНК из костей. Сначала, как правило, проводится измельчение костной ткани в специальных механических мельницах вибрационного или шарового типа, в том числе с использованием жидкого азота, а также в обычной ступке с пестиком. Самым простым вариантом измельчения служит разбиение костного материала, помещенного внутрь прочного пластикового пакета с помощью обычного молотка [40]. Также может использоваться упоминавшееся выше сверление. Далее измельченный костный порошок направляют на экстракцию ДНК, что также может осуществляться разными способами.
В целом ряде статей предлагается производить полную или частичную декальцификацию костной ткани с помощью 0.5 М ЭДТА, которая может продолжаться до нескольких суток [41-44]. После де-кальцификации осуществляется удаление ЭДТА ультрафильтрацией или с помощью длительного диализа [40, 41]. Однако во многих работах процесс декальци-фикации ведут при температурах от комнатной до 65°С одновременно с экстракцией, для чего в 0.5 М ЭДТА добавляют детергенты и протеиназу К [42], и по прошествии периода времени от нескольких часов до суток образовавшийся экстракт подвергают стандартной депротеинизации смесью фенол:хлороформ [42, 45] или очистке на сорбционной колонке. Описаны также варианты фенол-хлороформной экстракции ДНК из костных тканей без декальцификации [11].
Выделение дДНК с помощью наночастиц и микрокристаллов предложили отечественные коллеги [46]. Венгерские ученые предложили вести экстракцию ДНК при 37°С в течение ночи в буфере, содержащем всего 0.1 М ЭДТА, протеиназу К и детергент лаурилсаркозинат натрия, с последующей фенол-хлороформной депротеинизацией (о которой авторы почему-то не упоминают) и расслоением фаз в микроцентрифуге [38]. Для эффективного осаждения дДНК этанолом в присутствии 4 М ацетата аммония они в качестве соосадителя добавляли предварительно стерилизованный ультрафиолетовым светом декстран голубой в концентрации 1 мкг/мл. Важным преимуществом их метода было то, что образующийся осадок дДНК благодаря декстрану голубому имел голубоватую окраску, что облегчало работу с крохотными количествами материала. В одной из работ было показано, что осаждение изопропанолом удаляет ингибиру-ющие субстанции из препаратов ДНК, выделенных из древних костей [47]. Другие авторы, напротив, обнаружили, что спиртовое осаждение не удаляет ингибиторы ПЦР из препаратов древней ДНК, и рекомендовали дополнительно очищать ее ионообменной хроматографией на колонках с диэтиламиноэтил-целлюлозой DE-52 [48] или гель-фильтрацией [49]. Оригинальный метод выделения и очистки дДНК был предложен немецкими авторами [50]. Ими был применен по сути электрофоретический метод экстракции ДНК из костного порошка, приготовленного в вибрационной мельнице или агатовой ступке и помещаемого шпателем на дно колодцев 2%-ного агарозного геля с последующей элюцией окрашенной бромистым эти-дием зоны геля. Общее время выделения и очистки дДНК составило 5-6 ч, при этом происходило эффективное освобождение ее от ингибиторов ПЦР.
Амплификация древней ДНК
Некоторыми авторами при амплификации дДНК наблюдалось возникновение эффекта так называемой «перепрыгивающей» (jumping) с матрицы на матрицу ПЦР, что искажает истинное положение дел [4]. Однако известно, что при работе с сильно фрагментиро-ванной ДНК при проведении нескольких предварительных этапов беспраймерной ПЦР происходит отжиг фрагментов самих на себя, сопровождающийся их удлинением. После добавления ограничивающих прямого и обратного праймеров это приводит к наработке ампликона более крупного размера, нежели таковой мог бы получиться при добавлении праймеров сразу [51]. Авторами отмечается, что из-за нематричной активности Taq-полимеразы, довешивающей на 3'-конце дополнительный нуклеотид, данный фермент
для этой цели использовать нельзя. Собственно, такой подход с успехом применяется в ходе ДНК-шаффлинга, рассчитанного на объединение в единую последовательность мелких фрагментов ДНК при создании химерных вариантов генов [52, 53]. Безусловно, размер амплифицируемой области исследуемых образцов ДНК подбирается в зависимости от стоящих задач, но за общее правило следует принимать, что, когда это возможно, следует ограничиваться минимальными длинами ампликонов.
Учитывая обычно малые количества выделяемой дДНК, для проведения некоторых анализов рекомендуют использовать так называемую мультиплексную ПЦР, например, при выявлении полиморфных STR-локусов [54]. В другой работе, используя 6 пар перекрывающихся праймеров, удалось увеличить размер итогового ампликона при проведении мультиплексной ПЦР на древней митохондриальной ДНК человека [55]. Аналогичную цель ставила перед собой группа немецких авторов, проводя сложно организованную мультиплексную, а затем симплексные ПЦР с перекрытием праймеров из разных наборов [56].
Во многих статьях отмечается ингибирование амплификации экстрактами дДНК, в которых нежелательными веществами, экстрагируемыми вместе с ДНК, могут быть коллаген, гуминовые и фульвовые кислоты [41, 57-61]. Было показано, что добавление в реакционную смесь незначительного количества выделенной дДНК ухудшало амплификацию современной ДНК [57]. При этом имеется немало способов преодоления таких ложно-негативных результатов при проведении ПЦР [62]. Недавно сообщено об успешном использовании коммерческих наборов [63] и отдельных ферментов [64], репарирующих перед амплификацией дДНК. Имеющиеся повреждения дДНК или сдерживают работу обычных термостабильных ДНК-полимераз, или полностью блокируют удлинение цепи. Решение данной проблемы было найдено путем конструирования новых химерных ДНК-полимераз на основе трех ферментов: Taq (Thermus aquaticus), Tth (T.thermophilus) и Tfl (T.flavus) ДНК-полимераз [65]. Созданные ферменты успешно строили новую цепь ДНК по матрице дДНК, содержащей гидантоины и даже безазотистые участки. Ранее другими авторами было показано, что выделенные ими 5 термостабильных ДНК-полимераз из архебактерий, относящихся к Y-семейству этих ферментов, также вполне успешно проходили поврежденные участки дДНК, которые Taq-полимераза преодолеть не могла [66]. Недавно американскими авторами было испытано сразу 9 термостабильных ДНК-полимераз разных производителей, из которых наиболее успешную амплификацию продемонстрировала Klentaq LA полимераза [61]. Был предложен вариант амплификации крохотного количества древней ДНК после пришивки к ней адапторов, как это делается для амплификации кДНК по методу RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) [67]. Для подсчета числа копий как ядерной, так и митохондриальной ДНК в одних и тех же образцах дДНК человека была применена ПЦР в реальном времени с детекцией амплико-нов с помощью TaqMan системы [68].
Заключение
Нет сомнений в том, что интерес к изучению древней ДНК разных организмов будет постоянно расти. Темпы роста подобных исследований будут напрямую зависеть от появления новых способов и
технологий выделения, амплификации и секвенирова-ния ДНК, включая определение полных нуклеотидных последовательностей геномов древних организмов [69]. Совершенствование методической базы обеспечит б0льшую достоверность получаемых результатов и производительность анализа, а также приведет к накоплению данных о геномах древних людей и появлению возможности использования современного инструментария для их обработки и анализа, например, ДНК-паспортизации с помощью генетического штрих-кодирования [70].
Благодарности
Интерес к данной тематике вызван проводимыми нами исследованиями по гранту Поддержки ведущих научных школ РФ № НШ-5923.2014.4.
ЛИТЕРАТУРА
1. Higuchi R., Bowman B., Freiberger M. et al. DNA sequences from the quagga, an extinct member of the horse family // Nature. 1984. V. 312. P. 282-284.
2. Paabo S. Molecular cloning of ancient egyptian mummy DNA // Nature. 1985. V. 314. P. 644-645.
3. Paabo S., Wilson A. C. Polymerase chain reaction reveals cloning artefacts // Nature. 1988. V. 334. P. 387-388.
4. Paabo S. Ancient DNA: extraction, characterization, molecular cloning, and enzymatic amplification // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 1939-1943.
5. Paabo S., Higuchi R. G., Wilson A. C. Ancient DNA and the polymerase chain reaction. The emerging field of molecular archaeology // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 9709-9712.
6. Austin J. J., Smith A. B., Thomas R. H. Palaeontology in a molecular world: the search for authentic ancient DNA // Trends Ecol. Evol. 1997. V. 12. P. 303-306.
7. Walden K. K., Robertson H. M. Ancient DNA from amber fossil bees? // Mol. Biol. Evol. 1997. V. 14. P. 1075-1077.
8. Cooper A., Wayne R. New uses for old DNA // Curr. Opin. Biotechnol. 1998. V. 9. P. 49-53.
9. Fulton T. L. Setting up an ancient DNA laboratory // Meth. Mol. Biol. 2012. V. 840. P. 1-11.
10. Чемерис А. В., Магданов Э. Г., Гарафутдинов Р. Р., Вахи-тов В. А. Как исключить появление ложно-позитивных результатов при проведении полимеразной цепной реакции // Вестн. биотехнол. и физ.-хим. биол. 2012. Т. 8. С. 34-45.
11. Adler C. J., Haak W., Donlon D. et al. The genographic consortium. Survival and recovery of DNA from ancient teeth and bones // J. Archeol. Sci. 2011. V. 38. P. 956-964.
12. Bollongino R., Tresset A., Vigne J. D. Environment and excavation: pre-lab impacts on ancient DNA analyses // General paleontol. 2008. V. 7. P. 91-98.
13. Pilli E., Modi A., Serpico C. et al. Monitoring DNA contamination in handled vs. directly excavated ancient human skeletal remains // PLoS One. 2013. V. 8. e52524.
14. Helgason A., Palsson S., Lalueza-Fox C. et al. A statistical approach to identify ancient template DNA // J. Mol. Evol. 2007. V. 65. P. 92-102.
15. Skoglund P., Northoff B. H., Shunkov M. V. et al. Separating endogenous ancient DNA from modern day contamination in a Siberian Neandertal // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2014. V.111. P. 2229-2234.
16. Yang H., Golenberg E. M., Shoshani J. A blind testing design for authenticating ancient DNA sequences // Mol. Phylogenet. Evol. 1997. V. 7. P. 261-265.
17. Hummel S., Herrmann B., Rameckers J. et al. Proving the authenticity of ancient DNA by comparative genomic hybridization // Naturwissenschaften. 1999. V. 86. P. 500-503.
18. Pusch C. M., Bachmann L., Broghammer M. et al. Internal Alu-polymerase chain reaction: a sensitive contamination monitoring protocol for DNA extracted from prehistoric animal bones // Anal. Biochem. 2000. V. 284. P. 408-411.
19. Pusch C. M., Kayademir T., Prangenberg K. et al. Documenting ancient DNA quality via alpha satellite amplification and
assessment of clone sequence diversity // J. Appl. Genet. 2002. V. 43. P. 351-364.
20. Poulakakis N., Parmakelis A., Lymberakis P. et al. Ancient DNA forces reconsideration of evolutionary history of Mediterranean pygmy elephantids // Biol. Lett. 2006. V. 2. P. 451-454.
21. Binladen J., Gilbert M. T., Willerslev E. 800000 year old mammoth DNA, modern elephant DNA or PCR artefact? // Biol. Lett. 2007. V. 3. P. 55-56.
22. Orlando L., Pages M., Calvignac S. et al. Does the 43 bp sequence from an 800000 year old cretan dwarf elephantid really rewrite the textbook on mammoths? // Biol. Lett. 2007. V. 3. P. 57-59.
23. Lindahl T. Instability and decay of the primary structure of DNA // Nature. 1993. V. 362. P. 709-715.
24. Smith C. I., Chamberlain A. T., Riley M. S. et al. The thermal history of human fossils and the likelihood of successful DNA amplification // J. Hum. Evol. 2003. V. 45. P. 203-217.
25. Austin J. J., Ross A. J., Smith A. B. et al. Problems of repro-ducibility - does geologically ancient DNA survive in amber-preserved insects? // Proc. Biol. Sci. 1997. V. 264. P. 467-474.
26. Oskam C. L., Haile J., McLay E. et al. Fossil avian eggshell preserves ancient DNA // Proc. Biol. Sci. 2010. V. 277. P. 1991-2000.
27. Rogaev E. I., Moliaka Y. K., Malyarchuk B. A. et al. Complete mitochondrial genome and phylogeny of Pleistocene mammoth Mammuthus primigenius // PLoS Biol. 2006. V. 4. e73.
28. Pusch C. M., Giddings I., Scholz M. Repair of degraded duplex DNA from prehistoric samples using Escherichia coli DNA polymerase I and T4 DNA ligase // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 857-859.
29. Di Bernardo G., Del Gaudio S., Cammarota M. et al. Enzymatic repair of selected cross-linked homoduplex molecules enhances nuclear gene rescue from Pompeii and Herculaneum remains // Nucleic Acids Res. 2002. V. 30. e16.
30. Poinar H. N., Hoss M., Bada J. L., Paabo S. Amino acid race-mization and the preservation of ancient DNA // Science. 1996. V. 272. P. 864-866.
31. Bada J. L., Wang X. S., Hamilton H. Preservation of key bio-molecules in the fossil record: current knowledge and future challenges // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 1999. V. 354. P. 77-86.
32. Fredericks J. D., Bennett P., Williams A. et al. FTIR spectros-copy: A new diagnostic tool to aid DNA analysis from heated bone // Forensic Sci. Int. Genet. 2012. V. 6. P. 375-380.
33. Guarino F. M., Angelini F., Odierna G. et al. Detection of DNA in ancient bones using histochemical methods // Biotech. Histochem. 2000. V. 75. P. 110-117.
34. Allentoft M. E., Collins M., Harker D. et al. The half-life of DNA in bone: measuring decay kinetics in 158 dated fossils // Proc. Biol. Sci. 2012. V. 279. P. 4724-4733.
35. Richards M. B., Sykes B. C., Hedges R. E.M. Authenticating DNA Extracted From Ancient Skeletal Remains // J. Archaeol. Sci. 1995. V. 22. P. 291-299.
36. Dissing J., Kristinsdottir M. A., Friis C. On the elimination of extraneous DNA in fossil human teeth with hypochlorite // J. Archaeol. Sci. 2008. V. 35. P. 1445-1452.
37. Kemp B. M., Smith D. G. Use of bleach to eliminate contaminating DNA from the surface of bones and teeth // Forensic Sci. Int. 2005. V. 154. P. 53-61.
38. Kalmar T., Bachrati C. Z., Marcsik A., Rasko I. A simple and efficient method for PCR amplifiable DNA extraction from ancient bones // Nucleic Acids Res. 2000. V.28. e67.
39. Woodward S. R., King M. J., Chiu N. M., Kuchar M. J., Griggs C. W. Amplification of ancient nuclear DNA from teeth and soft tissues // PCR Meth. Appl. 1991. V.3. P.244-247.
40. Mulligan C. J. Isolation and analysis of DNA from archaeological, clinical, and natural history specimens // Methods En-zymol. 2005. V. 395. P. 87-103.
41. Tuross N. The biochemistry of ancient DNA in bone // Experi-entia. 1994. V. 50. P. 530-535.
42. Loreille O. M., Diegoli T. M., Irwin J. A. et al. High efficiency DNA extraction from bone by total demineralization // Forensic Sci Int Genet. 2007. V. 1. P. 191-195.
43. Seo S. B., Zhang A., Kim H. Y. et al. Technical note: efficiency of total demineralization and ion-exchange column for DNA extraction from bone // Am. J. Phys. Anthropol. 2010. V. 141. P. 158-162.
44. Amoury S., Huel R., Bilic A. et al. Automatable full demineralization DNA extraction procedure from degraded skeletal remains // Forens. Sci. Int. Genet. 2012. V.6. P.398-406.
45. Barnett R., Larson G. A phenol-chloroform protocol for extracting DNA from ancient samples // Ancient DNA: Methods and Protocols. Shapiro B., Hofreiter M. (Eds.) 2012. Meth. Mol. Biol. V. 840. P. 13-19.
46. Кравцова О. А., Аникеев О. Е., Бикмуллин А. Г. Разработка метода выделения деградированной ДНК с использованием наночастиц и микрокристаллов // Структ. дин. мол. сист. 2009. №6А. С.49-53.
47. Hanni C., Brousseau T., Laudet V., Stehelin D. Isopropanol precipitation removes PCR inhibitors from ancient bone extracts // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 881-882.
48. Kim K., Kim K. Y., Jeon E. et al. Technical note: improved ancient DNA purification for PCR using ion-exchange columns // Am. J. Phys. Anthropol. 2008. V. 136. P. 114-121.
49. Matheson C. D., Marion T. E., Hayter S. et al. Technical note: removal of metal ion inhibition encountered during DNA extraction and amplification of copper-preserved archaeological bone using size exclusion chromatography // Amer. J. Phys. Anthropol. 2009. V. 140. P. 384-391.
50. Bachmann L., Scholz M., Broghammer M. et al. Voltage-induced release of nucleic acids from palaeontological samples // Electrophoresis. 2000. V. 21. P. 1488-1492.
51. Golenberg E. M., Bickel A., Weihs P. Effect of highly fragmented DNA on PCR // Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. P. 5026-5033.
52. Stemmer W. P. DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecular evolution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 10747-10751.
53. Бикбулатова С. М. Мингазетдинова С. Р., Чемерис А. В., Вахитов В. А. Эволюция in vitro - есть ли предел методам «перетасовки» генов? // Успехи современной биологии. 2009. Т. 129. С. 323-335.
54. Hummel S., Schultes T., Bramanti B. et al. Ancient DNA profiling by megaplex amplications // Electrophoresis. 1999. V. 20. P. 1717-1721.
55. Alonso A., Albarran C., Martin P. et al. Multiplex-PCR of shot amplicons for mtDNA sequencing from ancient DNA // Internat. Congr. Ser. 2000. V. 1239. P. 585-588.
56. Rompler H., Dear P. H., Krause J. et al. Multiplex amplification of ancient DNA // Nat. Protoc. 2006. V. 1. P. 720-728.
57. Hagelberg E., Bell L. S., Allen T. et al. Analysis of ancient bone DNA: techniques and applications // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 1991. V. 333. P. 399-407.
58. Scholz M., Giddings I., Pusch C. M. A polymerase chain reaction inhibitor of ancient hard and soft tissue DNA extracts is determined as human collagen type I // Anal. Biochem. 1998. V. 259. P. 283-286.
59. Arroyo-Pardo E., Ocana M. C., Arroyo J. J. et al. HPLC and UV-spectrophotometry examination of ancient DNA and PCR inhibitors in old human remains // Ancient Biomol. 2002. V. 4. P. 33-41.
60. King C., Debruyne R., Kuch M. et al. A quantitative approach to detect and overcome PCR inhibition in ancient DNA extracts // Biotechniques. 2009. V. 47. P. 941-949.
61. Monroe C., Grier C., Kemp B. M. Evaluating the efficacy of various thermo-stable polymerases against co-extracted PCR inhibitors in ancient DNA samples // Forensic Sci. Int. 2013. V. 228. P. 142-153.
62. Чемерис А. В., Чемерис Д. А., Магданов Э. Г. и др. Причины ложно-негативной ПЦР и недопущение некоторых из них // Биомика. 2012. Т. 4. С. 31-47.
63. Robertson J. M., Dineen S. M., Scott K. A. et al. Assessing PreCR repair enzymes for restoration of STR profiles from artificially degraded DNA for human identification // Forensic Sci. Int. Genet. 2014. V.12. P.168-180.
64. Rohland N., Harney E., Mallick S. et al. Partial uracil-DNA-glycosylase treatment for screening of ancient DNA // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 2015. V. 370. 20130624.
65. d'Abbadie M., Hofreiter M., Vaisman A. et al. Molecular breeding of polymerases for amplification of ancient DNA // Nat. Biotechnol. 2007. V. 25. P. 939-943.
66. McDonald J. P., Hall A., Gasparutto D. et al. Novel thermostable Y-family polymerases: applications for the PCR amplification of damaged or ancient DNAs // Nucleic Acids Res. 2006. V. 34. P. 1102-1111.
67. Pusch C. M., Blin N., Broghammer M. et al. Adaptor-mediated amplification of minute amounts of severely fragmented ancient nucleic acids // J. Appl. Genet. 2000. V. 41. P. 303-315.
68. Alonso A., Martin P., Albarran C. et al. Real-time PCR designs to estimate nuclear and mitochondrial DNA copy number in forensic and ancient DNA studies // Forensic Sci. Int. 2004. V. 139. P. 141-149.
69. Чемерис А. В., Магданов Э. Г., Гарафутдинов Р. Р. и др. Некоторое технологическое прошлое, настоящее, а также будущее современной биологии к 2030 году (часть вторая) // Биомика. 2013. Т.5. С. 75-125.
70. Гарафутдинов Р. Р., Чубукова О. В., Сахабутдинова А. Р. и др. Генетическое штрих-кодирование как подход к идентификации личности на примере популяции русских Республики Башкортостан // Вестн. биотехнол. физ.-хим. биол. 2012. Т. 8. С. 19-25.
Поступила в редакцию 09.04.2015 г. После доработки - 21.05.2015 г.
AUTHENTICITY, INTEGRITY AND AVAILABILITY OF ANCIENT DNA
© R. R. Garafutdinov*, N. R. Nagaev, A. R. Sakhabutdinova, A. V. Chemeris
Institute of Biochemistry and Genetics, Ufa Science Center of RAS 71 Oktyabrya Ave., 450054 Ufa, Republic of Bashkortostan, Russia.
Phone: +7 (347) 235 60 88.
*Email: garafutdinovr@mail.ru
The general methodological problems primarily caused by degradation of nucleic acids chains (high fragmentation, presence of extended abasic sites, etc.), negligible amounts of target copies and a high possibility of external contamination arising when ancient DNA handling are thoroughly reviewed. The various methods of solving these problems are described. The crucial requirements for the organization of all steps of the ancient DNA handling from biological material collection to the laboratory equipping and fitting as well as methods of experimental and statistical confirmation of ancient DNA authenticity and elimination of modern nucleic acids contribution (particularly human and microorganisms DNA) are considered. The data on nucleic acids integrity in the fossils depending on the age and storage conditions are shown. The original methodological approaches to DNA integrity evaluation are briefly mentioned. The various techniques to nucleic acids "pure" extraction/isolation from old human remains (skeletal bones and teeth) are described. Moreover the main features of ancient DNA amplification by polymerase chain reaction with regard to used enzymes and primers systems are emphasized.
Keywords: ancient DNA, modern DNA, decontamination, DNA authenticity, DNA isolation, amplification, polymerase chain reaction.
Published in Russian. Do not hesitate to contact us at bulletin_bsu@mail.ru if you need translation of the article.
REFERENCES
1. Higuchi R., Bowman B., Freiberger M. et al. DNA sequences from the quagga, an extinct member of the horse family. Nature. 1984. Vol. 312. Pp. 282-284.
2. Paabo S. Nature. 1985. Vol. 314. Pp. 644-645.
3. Paabo S., Wilson A. C. Nature. 1988. Vol. 334. Pp. 387-388.
4. Paabo S. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. Vol. 86. Pp. 1939-1943.
5. Paabo S., Higuchi R. G., Wilson A. C. J. Biol. Chem. 1989. Vol. 264. Pp. 9709-9712.
6. Austin J. J., Smith A. B., Thomas R. H. Trends Ecol. Evol. 1997. Vol. 12. Pp. 303-306.
7. Walden K. K., Robertson H. M. Mol. Biol. Evol. 1997. Vol. 14. Pp. 1075-1077.
8. Cooper A., Wayne R. Curr. Opin. Biotechnol. 1998. Vol. 9. Pp. 49-53.
9. Fulton T. L. Meth. Mol. Biol. 2012. Vol. 840. Pp. 1-11.
10. Chemeris A. V., Magdanov E. G., Garafutdinov R. R., Vakhitov V. A. Vestn. biotekhnol. i fiz.-khim. biol. 2012. Vol. 8. Pp. 34-45.
11. Adler C. J., Haak W., Donlon D. et al. The genographic consortium. Survival and recovery of DNA from ancient teeth and bones. J. Ar-cheol. Sci. 2011. Vol. 38. Pp. 956-964.
12. Bollongino R., Tresset A., Vigne J. D. General paleontol. 2008. Vol. 7. Pp. 91-98.
13. Pilli E., Modi A., Serpico C. et al. Monitoring DNA contamination in handled vs. directly excavated ancient human skeletal remains. PLoS One. 2013. Vol. 8. e52524.
14. Helgason A., Palsson S., Lalueza-Fox C. et al. A statistical approach to identify ancient template DNA. J. Mol. Evol. 2007. Vol. 65. Pp. 92-102.
15. Skoglund P., Northoff B. H., Shunkov M. V. et al. Separating endogenous ancient DNA from modern day contamination in a Siberian Neandertal. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2014. V.111. Pp. 2229-2234.
16. Yang H., Golenberg E. M., Shoshani J. Mol. Phylogenet. Evol. 1997. Vol. 7. Pp. 261-265.
17. Hummel S., Herrmann B., Rameckers J. et al. Proving the authenticity of ancient DNA by comparative genomic hybridization. Naturwissenschaften. 1999. Vol. 86. Pp. 500-503.
18. Pusch C. M., Bachmann L., Broghammer M. et al. Internal Alu-polymerase chain reaction: a sensitive contamination monitoring protocol for DNA extracted from prehistoric animal bones. Anal. Biochem. 2000. Vol. 284. Pp. 408-411.
19. Pusch C. M., Kayademir T., Prangenberg K. et al. Documenting ancient DNA quality via alpha satellite amplification and assessment of clone sequence diversity. J. Appl. Genet. 2002. Vol. 43. Pp. 351-364.
20. Poulakakis N., Parmakelis A., Lymberakis P. et al. Ancient DNA forces reconsideration of evolutionary history of Mediterranean pygmy elephantids. Biol. Lett. 2006. Vol. 2. Pp. 451-454.
21. Binladen J., Gilbert M. T., Willerslev E. Biol. Lett. 2007. Vol. 3. Pp. 55-56.
22. Orlando L., Pages M., Calvignac S. et al. Does the 43 bp sequence from an 800000 year old cretan dwarf elephantid really rewrite the textbook on mammoths?. Biol. Lett. 2007. Vol. 3. Pp. 57-59.
23. Lindahl T. Nature. 1993. Vol. 362. Pp. 709-715.
24. Smith C. I., Chamberlain A. T., Riley M. S. et al. The thermal history of human fossils and the likelihood of successful DNA amplification. J. Hum. Evol. 2003. Vol. 45. Pp. 203-217.
25. Austin J. J., Ross A. J., Smith A. B. et al. Problems of reproducibility - does geologically ancient DNA survive in amber-preserved insects?. Proc. Biol. Sci. 1997. Vol. 264. Pp. 467-474.
26. Oskam C. L., Haile J., McLay E. et al. Fossil avian eggshell preserves ancient DNA. Proc. Biol. Sci. 2010. Vol. 277. Pp. 1991-2000.
27. Rogaev E. I., Moliaka Y. K., Malyarchuk B. A. et al. Complete mitochondrial genome and phylogeny of Pleistocene mammoth Mam-muthus primigenius. PLoS Biol. 2006. Vol. 4. e73.
28. Pusch C. M., Giddings I., Scholz M. Nucleic Acids Res. 1998. Vol. 26. Pp. 857-859.
29. Di Bernardo G., Del Gaudio S., Cammarota M. et al. Enzymatic repair of selected cross-linked homoduplex molecules enhances nuclear gene rescue from Pompeii and Herculaneum remains. Nucleic Acids Res. 2002. Vol. 30. e16.
30. Poinar H. N., Hoss M., Bada J. L., Paabo S. Science. 1996. Vol. 272. Pp. 864-866.
31. Bada J. L., Wang X. S., Hamilton H. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 1999. Vol. 354. Pp. 77-86.
32. Fredericks J. D., Bennett P., Williams A. et al. FTIR spectroscopy: A new diagnostic tool to aid DNA analysis from heated bone. Forensic Sci. Int. Genet. 2012. Vol. 6. Pp. 375-380.
33. Guarino F. M., Angelini F., Odierna G. et al. Detection of DNA in ancient bones using histochemical methods. Biotech. Histochem. 2000. Vol. 75. Pp. 110-117.
34. Allentoft M. E., Collins M., Harker D. et al. The half-life of DNA in bone: measuring decay kinetics in 158 dated fossils. Proc. Biol. Sci. 2012. Vol. 279. Pp. 4724-4733.
35. Richards M. B., Sykes B. C., Hedges R. E.M. J. Archaeol. Sci. 1995. Vol. 22. Pp. 291-299.
36. Dissing J. J. Archaeol. Sci. 2008. Vol. 35. Pp. 1445-1452.
37. Kemp B. M., Smith D. G. Forensic Sci. Int. 2005. Vol. 154. Pp. 53-61.
38. Kalmar T., Bachrati C. Z., Marcsik A., Rasko I. Nucleic Acids Res. 2000. V.28. e67.
39. Woodward S. R., King M. J., Chiu N. M., Kuchar M. J., Griggs C. W. PCR Meth. Appl. 1991. V.3. P.244-247.
40. Mulligan C. J. Methods Enzymol. 2005. Vol. 395. Pp. 87-103.
41. Tuross N. Experientia. 1994. Vol. 50. Pp. 530-535.
42. Loreille O. M., Diegoli T. M., Irwin J. A. et al. High efficiency DNA extraction from bone by total demineralization. Forensic Sci Int Genet. 2007. Vol. 1. Pp. 191-195.
43. Seo S. B., Zhang A., Kim H. Y. et al. Technical note: efficiency of total demineralization and ion-exchange column for DNA extraction from bone. Am. J. Phys. Anthropol. 2010. Vol. 141. Pp. 158-162.
44. Amoury S., Huel R., Bilic A. et al. Automatable full demineralization DNA extraction procedure from degraded skeletal remains. Forens. Sci. Int. Genet. 2012. V.6. P.398-406.
45. Barnett R., Larson G. Ancient DNA: Methods and Protocols. Shapiro B., Hofreiter M. (Eds.) 2012. Meth. Mol. Biol. Vol. 840. Pp. 1319.
46. Kravtsova O. A., Anikeev O. E., Bikmullin A. G. Strukt. din. mol. sist. 2009. No. 6A. Pp. 49-53.
47. Hanni C., Brousseau T., Laudet V., Stehelin D. Nucleic Acids Res. 1995. Vol. 23. Pp. 881-882.
48. Kim K., Kim K. Y., Jeon E. et al. Technical note: improved ancient DNA purification for PCR using ion-exchange columns. Am. J. Phys. Anthropol. 2008. Vol. 136. Pp. 114-121.
49. Matheson C. D., Marion T. E., Hayter S. et al. Technical note: removal of metal ion inhibition encountered during DNA extraction and amplification of copper-preserved archaeological bone using size exclusion chromatography. Amer. J. Phys. Anthropol. 2009. Vol. 140. Pp. 384-391.
50. Bachmann L., Scholz M., Broghammer M. et al. Voltage-induced release of nucleic acids from palaeontological samples. Electrophoresis. 2000. Vol. 21. Pp. 1488-1492.
51. Golenberg E. M., Bickel A., Weihs P. Nucleic Acids Res. 1996. Vol. 24. Pp. 5026-5033.
52. Stemmer W. P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. Vol. 91. Pp. 10747-10751.
53. Bikbulatova S. M. Mingazetdinova S. R., Chemeris A. V., Vakhitov V. A. Uspekhi sovremennoi biologii. 2009. Vol. 129. Pp. 323-335.
54. Hummel S., Schultes T., Bramanti B. et al. Ancient DNA profiling by megaplex amplications. Electrophoresis. 1999. Vol. 20. Pp. 17171721.
55. Alonso A., Albarran C., Martin P. et al. Multiplex-PCR of shot amplicons for mtDNA sequencing from ancient DNA. Internat. Congr. Ser. 2000. Vol. 1239. Pp. 585-588.
56. Rompler H., Dear P. H., Krause J. et al. Multiplex amplification of ancient DNA. Nat. Protoc. 2006. Vol. 1. Pp. 720-728.
57. Hagelberg E., Bell L. S., Allen T. et al. Analysis of ancient bone DNA: techniques and applications. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 1991. Vol. 333. Pp. 399-407.
58. Scholz M., Giddings I., Pusch C. M. Anal. Biochem. 1998. Vol. 259. Pp. 283-286.
59. Arroyo-Pardo E., Ocana M. C., Arroyo J. J. et al. HPLC and UV-spectrophotometry examination of ancient DNA and PCR inhibitors in old human remains. Ancient Biomol. 2002. Vol. 4. Pp. 33-41.
60. King C., Debruyne R., Kuch M. et al. A quantitative approach to detect and overcome PCR inhibition in ancient DNA extracts. Biotechniques. 2009. Vol. 47. Pp. 941 -949.
61. Monroe C., Grier C., Kemp B. M. Forensic Sci. Int. 2013. Vol. 228. Pp. 142-153.
62. Chemeris A. V., Chemeris D. A., Magdanov E. G. i dr. Prichiny lozhno-negativnoi PTsR i nedopushchenie nekotorykh iz nikh. Biomika. 2012. Vol. 4. Pp. 31-47.
63. Robertson J. M., Dineen S. M., Scott K. A. et al. Assessing PreCR repair enzymes for restoration of STR profiles from artificially degraded DNA for human identification. Forensic Sci. Int. Genet. 2014. V.12. P.168-180.
64. Rohland N., Harney E., Mallick S. et al. Partial uracil-DNA-glycosylase treatment for screening of ancient DNA. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 2015. Vol. 370. 20130624.
65. d'Abbadie M., Hofreiter M., Vaisman A. et al. Molecular breeding of polymerases for amplification of ancient DNA. Nat. Biotechnol. 2007. Vol. 25. Pp. 939-943.
66. McDonald J. P., Hall A., Gasparutto D. et al. Novel thermostable Y-family polymerases: applications for the PCR amplification of damaged or ancient DNAs. Nucleic Acids Res. 2006. Vol. 34. Pp. 1102-1111.
67. Pusch C. M., Blin N., Broghammer M. et al. Adaptor-mediated amplification of minute amounts of severely fragmented ancient nucleic acids. J. Appl. Genet. 2000. Vol. 41. Pp. 303-315.
68. Alonso A., Martin P., Albarran C. et al. Real-time PCR designs to estimate nuclear and mitochondrial DNA copy number in forensic and ancient DNA studies. Forensic Sci. Int. 2004. Vol. 139. Pp. 141-149.
69. Chemeris A. V., Magdanov E. G., Garafutdinov R. R. i dr. Nekotoroe tekhnologicheskoe proshloe, nastoyashchee, a takzhe budushchee sovremennoi biologii k 2030 godu (chast' vtoraya). Biomika. 2013. Vol. 5. Pp. 75-125.
70. Garafutdinov R. R., Chubukova O. V. Vestn. biotekhnol. fiz.-khim. biol. 2012. Vol. 8. Pp. 19-25.
Received 09.04.2015. Revised 21.05.2015.
