CC BY
66
80
Оригинальные исследования
АРТЕРИИ ПУПОВИНЫ ЧЕЛОВЕКА СОХРАНЯЮТ
СВОИ БИОМЕХАНИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПОСЛЕ ДЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗАЦИИ
A. С. Насрединов 1, А.В. Лаврешин 1, Е.А. Лебедева 2, С.В. Анисимов 1,
B. Н. Вавилов 1, Д.И. Курапеев 1
1 Федеральный медицинский исследовательский центр им. В.А. Алмазова МЗ РФ,
Санкт-Петербург, Россия
2 Санкт-Петербургский государственный электротехнический университет «ЛЭТИ» им. В.И. Ульянова (Ленина), Санкт-Петербург, Россия
Decellularized human umbilical arteries retain their mechanical properties
A.S. Nasredinov1, A.V. Lavreshin 1, EA. Lebedeva 2, S.V. Anisimov1, V.N. Vavilov1, D.I. Kurapeev1
1 Federal Almazov Medical Research Centre, Saint-Petersburg, Russia
2 Saint-Petersburg Electrotechnical University «LETI», Saint-Petersburg, Russia
Тканеинженерные кровеносные сосуды могут восполнить клиническую потребность в биологических протезах в реконструктивной сердечно-сосудистой хирургии. Полученный методом децеллюляризации внеклеточный матрикс артерии лишен иммуногенных свойств, биосовместим, пригоден для заселения клетками и потому является привлекательным субстратом для тканевой инженерии сосудов. Ранее нами был разработан способ децеллюляризации артерий пуповины человека, эффективность которого была доказана морфологически.
Цель работы: проверить сохранность биомеханических свойств артерий пуповины человека после децеллюляри-зации, в том числе после длительного хранения.
Проведены исследования трех групп сосудов: I группа (контроль) — необработанные участки артерий; II группа — артерии, децеллюляризованные оригинальным детергент-но-ферментным способом; в III группу вошла часть децел-люляризованных артерий, которые хранили в стерильном фосфатно-солевом буферном растворе 10 мес. С помощью разрывной машины Instron образцы артерий растягивали до разрушения, измеряя нагрузку при растяжении и относительное удлинение. На этом же устройстве измеряли нагрузку, необходимую для прорезывания шовного материала. Для оценки прочности артерии заполняли физиологическим раствором до их разрушения.
Значимых различий между исследуемыми группами артерий пуповины при максимальных нагрузках не выявлено. Таким образом, биомеханические свойства децеллю-ляризованных артерий пуповины человека достоверно не отличаются от таковых у нативных артерий, что косвенно подтверждает сохранность экстрацеллюлярного матрикса. Это позволяет использовать их на дальнейших этапах тканевой инженерии.
Ключевые слова: артерии пуповины, децеллюляриза-ция, биомеханические свойства.
Введение
Сердечно-сосудистые заболевания по-прежнему остаются ведущей причиной смертности в мире [1]. При поражении артерий малого диаметра (менее 6 мм, таких как коронарные артерии), лучшим материалом для шунта являются аутогенные подкожные вены, внутренняя грудная и лучевая артерии. Однако, их количество ограничено, и кроме того, эти сосуды могут быть сами вовлечены в патологический процесс. Выходом из этой ситуации могло стать использование синтетических протезов из дакрона или политетрафторэтилена (ПТФЭ), однако, при диаметре менее 6 мм они оказались непригодны к использованию вследствие быстрого развития гиперплазии интимы в области анастомозов и довольно быстрого тромбоза всего шунта [2, 3]. Причина заключалась в несоответствии механических характеристик син-
е-mail: vsurg@yandex.ru
Tissue engineered vascular grafts can fulfill a clinical need in biological prostheses in reconstructive cardiovascular surgery. Decellularized arteries do not cause immune response, are biocompatible, could be reseeded with recipient cells und thus are attractive scaffolds for vascular tissue engineering. Earlier we developed a decullarization method for human umbilical arteries and proved its effectiveness morphologically.
The purpose of this study was to evaluate mechanical properties of the decellurized human umbilical arteries, also after long-term storage.
3 groups of vessels were investigated: I group — native arteries, II group — decellularized arteries, III group — decellularized arteries, stored in phosphate buffered saline for 10 months. Samples were stretched until rupture on the Instron universal testing machine; herewith strain and stress were recorded. The same way the suture retention strength was estimated. Also burst-pressure, that characterized the total strength of the samples, was investigated. Intergroup differences in maximum strain both longitudinal and transverse directions, suture retention strength and burst pressure were not significant.
Decellularized human umbilical arteries retain their mechanical properties, and that indirectly confirms extracellular matrix preservation. Thus they are attractive source for small diameter tissue engineered vascular grafts.
Key words: umbilical artery, decellularization, mechanical property.
тетических материалов и нативных сосудов [4, 5]. Таким образом, идеальный сосудистый протез должен быть не только прочным, но и по другим своим свойствам, таким как эластичность, растяжимость и упругость, максимально соответствовать артериям человека.
Тканевая инженерия может преодолеть эти недостатки, предложив «искусственно выращенные» сосудистые кондуиты, которые бы по всем характеристикам соответствовали естественным сосудам. Тканеинженерные графты с подходящими биомеханическими свойствами могут привести к лучшим отдаленным результатам реконструктивных операций, даже при очень небольшом диаметре шунта. К настоящему времени уже разработано несколько подходов к воссозданию кровеносного сосуда in vitro. Основной принцип заключается в выращивании клеток
Гены & Клетки Том IX, № 2, 2014
Оригинальные исследования
81
реципиента на трехмерном биосовместимом матриксе в форме трубки. Выбор материала, который будет использован в качестве носителя клеток, очень важен, так как именно он отвечает за механические свойства будущего графта. Одна из методик тканевой инженерии предполагает использование в качестве основы децеллюляризованные донорские артерии. В процессе децеллюляризации из ткани удаляются все клеточные элементы, несущие антигенную нагрузку, тогда как экстрацеллюлярный матрикс (ЭЦМ), отвечающий за механические свойства, остается интактным. Таким образом, децеллюляри-зованные артерии, помимо таких преимуществ, как отсутствие реакции отторжения со стороны реципиента после трансплантации и возможности клеточного роста на них, должны сохранять механические свойства, присущие нативным артериям.
В ряде исследований была показана возможность децеллюляризации артерий как алло-, так и ксеногенного происхождения [6—10]. Однако, ставя целью полное удаление клеточного дебриса в процессе де-целлюляризации, возможно негативное воздействие на структуру ЭЦМ, в то время как основным преимуществом использования децеллюляризованных тканей является именно сохранение трехмерной структуры нативных тканей, из которых они были получены [11, 12]. Установлено, что механические свойства ткани тесно связаны с её структурой, что особенно важно для артерий, испытывающих в организме высокую нагрузку [13, 14]. Таким образом, необходимо найти баланс между максимально полным удалением клеточного материала и минимальным повреждением ЭЦМ. Однако в некоторых исследованиях было выявлено существенное изменение механических качеств артерий после децел-люляризации [15—20]. Чаще всего это означает, что был некорректно подобран состав, концентрация или продолжительность воздействия децеллюляризиру-ющих агентов, действие которых оказалось слишком сильным и привело к повреждению ЭЦМ. С другой стороны, в ряде случаях не определялись значимые нарушения структуры матрикса при гистологическом изучении и электронной микроскопии препаратов, но изменялась их растяжимость [20—22]. Следовательно, децеллюляризованные артерии необходимо оценивать не только по структуре матрикса, но и на прочность, упругость и растяжимость.
Необходимо отметить, что одним из недостатков использования децеллюляризованных тканей является нехватка исходного донорского материала. Особенно это касается сосудов человеческого происхождения, забор которых связан с рядом этических проблем [23]. Интересный выход из этой ситуации нашли исследователи из Йельского университета и Медицинского центра Дюкского университета в Дурхаме, США, которые описали тканеинженерный метод создания кровеносного сосуда любого размера с использованием децеллюляризации [24, 25]. Сначала в специальном биореакторе культивировали аллогенные гладкомышечные клетки аорты (свиньи или человека) на быстродеградируемом трубчатом матриксе из полигликоливой кислоты нужного размера (3—6 мм в диаметре) в течение 10 нед. Затем полученный тканеинженерный сосуд децеллюляри-зовали и ЭЦМ заселяли клетками реципиента.
Однако мы нашли иной выход из данной ситуации, без использования длительного промежуточного этапа создания ЭЦМ сосуда нужного размера
на синтетическом носителе: артерии пуповины человека (АП). АП в качестве субстрата для изготовления децеллюляризованных сосудов с сохраненным ЭЦМ изучены мало, но, на наш взгляд, они обладают всеми необходимыми качествами для тканевой инженерии кровеносных сосудов малого калибра и их использование представляется весьма перспективным. Прежде всего, пуповина легко доступна и ее получение не вызывает этических проблем, так как чаще всего она утилизируется. Кроме того, при родоразрешении при помощи кесарева сечения, пуповина может быть получена в стерильном виде [26]. Длина пуповины достигает 40—60 см, следовательно обе артерии, проходящие в ней, могут быть легко выделены на протяжении 30—50 см. У АП нет боковых ветвей, их диаметр равномерный на всем протяжении и при физиологическом давлении (после выделения) приблизительно равен 3,5—4,5 мм, что подходит для большинства клинических нужд, например, для создания тканеинженерных аутогенных сосудов для аорто-коронарного и бедренно-подколенного шунтирования.
Использование АП позволяет избежать этапа синтеза ЭЦМ из аллогенных клеток на синтетическом носителе, что значительно сокращает время и стоимость производства, а получаемый в результате децеллюляризации ЭЦМ по своей структуре будет более естественным. Ранее нами был описан оригинальный способ децеллюляризации АП, позволяющий эффективно удалять клетки и их остатки с сохранением ЭЦМ [27, 28].
По сравнению с веной пуповины, которая раньше широко использовалась после фиксации в глу-таровом альдегиде (ГА), артерии пуповины изучены мало. Большой опыт работы с веной пуповины, обработанной глутаровым альдегидом, получен H. Dardik с соавт. (1976, 1978) [29, 30]. С 1975 по 1985 гг. ими было выполнено 907 реконструкций артерий нижних конечностей [31]. Однако результаты операций оказались не столь обнадеживающими, как ожидалось, из-за низкой проходимости шунтов. Кроме того, серьезной проблемой оказалась склонность материала к биодеградации, что привело к образованию аневризм анастомозов, локальных анастомозов по ходу шунта и диффузному расширению всего сосудистого кондуита, в связи с чем было предложено использовать внешнюю оболочку из дакрона [32]. Аналогичные результаты получены и другими исследователями, возлагавшими большие надежды на новый материал [33, 34]. Известно, что ткани, фиксированные в ГА, меняют свои механические свойства из-за химического связывания волокон коллагена, быстро подвергаются обызвествлению in vivo и вызывают иммунный ответ реципиента [6]. Также, в исследовании H. Yeh с соавт. (1984) было показано, что эндотелизация графтов, фиксированных в ГА, не происходит [35], вероятно, из-за того, что остатки ГА, токсичного для клеток, сохраняются даже через несколько недель интенсивного промывания [20]. В связи с вышесказанным, децеллюляризация АП, как новый способ получения биопротезов, является перспективной альтернативой.
Стоит также обратить внимание на то, что де-целлюляризованые АП не всегда могут быть востребованы немедленно, поэтому возникает вопрос их хранения.
Цель работы состояла в изучении механических свойств децеллюляризованных по оригинальной ме-
Гены & Клетки Том IX, № 2, 2014
82
Оригинальные исследования
тодике АП и децеллюляризованных АП после длительного хранения.
Материал и методы
Получение и децеллюляризация артерий пуповины. АП получали и обрабатывали по протоколам, описанным нами ранее [27, 28]. Все роженицы до родов подписывали добровольное информированное согласие. Пупочные канатики получали в родильном зале, в течение часа транспортировали в лабораторию в охлажденном фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБ, +4°С), где с помощью стандартных хирургических инструментов препарировали артерии. Часть артерий (I группа, контроль) подвергали механическим испытаниям, оставшиеся децеллюляризовали по нашему протоколу. На первом этапе участок кровеносного сосуда отмывали от крови в деионизированной воде (Milli-Q, Millipore, США) в течение 1 ч при температуре + 5°С. Затем материал помещали в 0,05% раствор трипсина (Самсон-Мед, Россия) в ФСБ с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ФСБ-ЭДТА, Росмед-био, Россия) на 1 ч при температуре 37°С. Далее артерии обрабатывали 0,075% раствором доде-цилсульфата натрия (Amresco, США) в ФСБ-ЭДТА в течение 22 ч при комнатной температуре, затем — 0,25% раствором Тритона Х-100 (Amresco, США) в ФСБ-ЭДТА в течение 22 ч при комнатной температуре. На последнем этапе материал подвергали воздействию нуклеаз (РНКаза А, 20 мкг/мл, ДНКаза I, 200 мкг/мл, Росмедбио, Россия) в питательной среде M199 ^дта-АШпсЬ|, США) в течение 6 ч при температуре +37°С. После каждого этапа обработки артерии трижды промывали в ФСБ-ЭДТА по 10—15 мин. Все этапы децеллюляризации проводили при постоянном вращательном движении и вибрации рабочей емкости.
Часть децеллюляризованных артерий (II группа) подвергали механическим испытаниям, а оставшиеся (III группа) хранили в стерильном ФСБ с добавлением антибиотиков (100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, Gibco, США), при температуре + 4°С в течение 10 мес., после чего также подвергали механическим испытаниям.
Гистологическое исследование. По три артерии из каждой группы фиксировали в 4% формалине в течение 4 ч (при нулевом давлении и без растяжения), дегидратировали в спиртах и заливали в парафиновые блоки по стандартной программе на автоматическом тканевом процессоре Leica TP 1020 (Leica, Германия). С помощью микротома изготавливали поперечные срезы артерий толщиной 5 мкм. Приготовленные срезы депарафинировали и окрашивали гематоксилином и эозином (Dako, Дания) по стандартной методике для общей оценки препарата и измерения толщины артерий. Изучение микропрепаратов проводили на световом микроскопе Leica DM1000 с фотокамерой с увеличением от х10 до х1000 (Leica, Германия).
Для измерения размеров стенки артерий фотографии микропрепаратов (сделанных при увеличении х40) загружали в программу для обработки и анализа изображений ImageJ (версия 1.47, National Institutes of Health, США), калибровали масштаб, измеряли наружный и внутренний диаметр сосуда, вручную обводили наружный и внутренний контуры сосудистой стенки, после чего автоматически рас-
считывалась площадь поперечного сечения стенки сосуда (S, мм2) по формуле:
S =
S - S ,
внешн. внутр.1
где S — площадь поперечного сечения стенки сосуда; S0He,™. - площадь по внешнему контуру; S^. - площадь по внутреннему контуру.
Для дальнейших вычислений было использовано среднее значение для трех препаратов каждой группы.
Изучение растяжимости децеллюляризованных артерий пуповины человека. Испытание проводили на универсальной разрывной машине Instron 5543 (Instron, США). Участок артерии длиной 5 см в расслабленном состоянии фиксировали в рабочих захватах аппарата так, чтобы начальное расстояние между захватами было 3-3,5 см. Во избежание выскальзывания артерий из зажимов, последние были проложены наждачной бумагой. Проводили преднатяжение измеряемого образца до нагрузки 0,05 Н (Н — Ньютон) измеряли исходную длину (L0, мм) и обнуляли показатели аппарата. Затем с постоянной скоростью 1 мм/с испытуемый образец растягивали до его разрушения.
Во время проведения испытаний аппарат измерял удельную силу, прилагаемую к образцам (нагрузка, Н), необходимую для их растяжения. Деформация сосуда - изменение длины образца относительно исходной (AL, %) — рассчитывалась по формуле:
ZlL = (----1) х 100% ,
L,,
где L — текущая длина испытуемого сосуда, мм.
Для измерения растяжимости в поперечной плоскости, артерию разрезали скальпелем, так чтобы получились кольца шириной 2 мм. Их надевали на 2 самодельных П-образных крючка (сформированы из обычной канцелярской скрепки), которые фиксировались в зажимах разрывной машины. Проводили преднатяжение до нагрузки 0,05 Н, измеряли расстояние между П-образными крючками (L0, мм) и обнуляли показатели аппарата. После этого с постоянной скоростью 1 мм/с образец растягивали до его разрушения. Формула расчета деформации та же, что приведена выше.
Результаты обоих исследований регистрировали и обрабатывали на компьютере с помощью прилагаемого программного обеспечения Bluehill2 (Instron, США).
Устойчивость к прорезыванию шовным материалом. Участки артерий длиной 2,5 см фиксировали в неподвижном захвате разрывной машины Instron 5543 (Instron, США), с противоположной стороны сосуд однократно прошивали полипропиленовой нитью (пролен 5-0, Ethicon, США), отступая 2 мм от его края. Нить фиксировали в подвижном захвате и производили растяжение с постоянной скоростью 1 мм/с. Измеряли усилие, необходимое для вытягивания нити сквозь стенку артерии, которое характеризовало устойчивость ткани к прорезыванию шовным материалом (Н). Результаты регистрировались на компьютере с помощью программного обеспечения Bluehill2 (Instron, США).
Оценка механической прочности децеллюляризованных артерий пуповины человека. Определение механической прочности АП проводили путем
Гены & Клетки Том IX, № 2, 2014
Оригинальные исследования
83
заполнения жидкостью кровеносного сосуда до его разрыва. Для проведения испытания один конец исследуемой артерии длиной 4 см перевязывали нитью (нуролон 2-0, Ethicon, США), а на втором конце фиксировали металлическую канюлю, которую с помощью ПВХ трубок и тройников подсоединяли к 20-мл шприцу (BBraun Melsungen, Германия), заполненному физиологическим раствором, и к аналоговому манометру (Росма, Россия) для регистрации давления. Артерию погружали в емкость с водой комнатной температуры. С помощью шприца повышали давление в системе со скоростью 10 мл/с до разрушения образца. С помощью цифровой видеокамеры HC-V210 (Panasonic, Япония) регистрировалось максимальное (пиковое) давление. Сравнивали результаты для трех групп сосудистых кондуитов.
Статистический анализ. Данные, полученные при проведении исследований, были обработаны в программе Microsoft Excel 2010. Результаты приводятся как среднее арифметическое значение ± стандартное отклонение. Степень достоверности межгрупповых различий средних значений оценивали с помощью парного t-теста Стьюдента с двухсторонним распределением (функция «СТЬЮДЕНТ ТЕСТ» в Microsoft Excel 2010). Нулевая гипотеза заключалась в равенстве исследуемых групп. Если результат t-теста был больше уровня значимости (а = 0,05), отличия в выборках считали достоверно не отличающимися друг от друга (P<0,05) [36, 37].
Результаты
Результаты макро- и микроскопического исследования испытуемых сосудов. Децеллюляризованные артерии сохраняли свою форму и размеры, теряя свой естественный цвет и становясь белесыми (рис. 1).
Рис. 1. Фрагмент нативной (А) и децеллюляризированной (Б] артерий пуповины человека
Нативные артерии богаты клеточными элементами, которые не определялись в образцах, подвергнутых децеллюляризации (рис. 2).
Рис. 2. Поперечные срезы нативной (А) и децеллюляризованной (Б) артерий пуповины человека. Окраска: гематоксилин и эозин.
Ув. х40
Площадь поперечного сечения (S) сосудов I группы составила 3,3±0,37 мм2. Удаление клеток из сосудистой стенки привела к уменьшению этого показателя до 2,35±0,15 мм2 (II группа) и 2,3±0,22 мм2 (III группа), что составило 71,3% и 69,6% от исходного показателя, соответственно. При этом отмечено изменение толщины стенки сосуда в II и III группах относительно I группы (424 мкм и 429 мкм против 650 мкм, соответственно) с сохранением величины внешнего диаметра (2,2 мм, 2,15 мм против 2,26 мм, соответственно). После 10 мес. хранения площадь поперечного сечения децеллюляризованных сосудов значимо не изменилась (p = 0,81).
Результаты исследования упруго-эластических свойств испытуемых сосудов. При растяжении испытуемых образцов (n = 10 в каждой группе) в продольном направлении получены воспроизводимые результаты. Исходная длина (£0) в I группе равнялась 28,9±2,9 мм, во II группе — 30,7±4 мм и в III группе — 28,7±3,1 мм. Усредненные кривые зависимости деформации от нагрузки, прилагаемой к испытуемым сосудам,-приведены на рис. 3.
Рис. 3. Зависимость растяжения испытуемого образца в продольном направлении от нагрузки: группа 1 — синяя кривая; группа 2 — красная; группа 3 — зеленая кривая
Гены & Клетки Том IX, № 2, 2014
84
Оригинальные исследования
Максимум нагрузки, при котором происходило разрушение испытуемых образцов, для нативных артерий составил 0,96±0,15 Н, для артерий II и III групп — 0,92±0,11 Н и 0,85±0,13 Н, соответственно. Межгрупповые различия статистически не значимы. При этом отмечено, что децеллюляризо-ванные артерии оказались более растяжимыми, чем нативные. Средний максимум деформации в момент разрушения равнялся 33% для сосудов I группы, 47% и 49% для сосудов II и III групп, соответственно.
При растяжении артерий в поперечной плоскости (n = 10 в каждой группе) начальное расстояние между П-образными крючками (L0) составило 2,94±0,2 мм, 2,96±0,2 мм и 2,97±0,2 мм, максимум нагрузки — 2,5±1,2 Н, 3,0±1,4 Н и 3,0±1,1 Н, а среднее изменение длины (AL) до разрушения образцов — 252±58%, 318±31% и 270±32% для I, II и III групп, соответственно. Межгрупповые различия были не значимы. На рис. 4 представлены усредненные кривые зависимости деформации от нагрузки, прилагаемой к испытуемым сосудам.
Результаты определения устойчивости к прорезыванию шовным материалом испытуемых сосудов. Сравнивали данные, полученные при тестировании 10 артерий из каждой группы. Во всех случаях происходило разрушение образца в месте шва (то есть прорезывание ткани артерии нитью). У нативных артерий нагрузка при этом составила 0,54±0,14 Н, у децеллюляризованных артерий 0,53±0,12 Н, в том числе после хранения 0,53±0,15 Н. Межгрупповые различия были статистически не значимы.
Результаты исследования механической прочности испытуемых сосудов. В данном опыте изучены показатели для 10 фрагментов артерий каждой группы. Разрушение нативных артерий происходило при давлении внутри сосуда равном 951±161 мм рт. ст.
Максимальное давление, которое выдерживали децеллюляризованные артерии, было несколько ниже, но достоверно не отличалось от показателя нативных артерий, и составило 933±124 мм рт. ст. во II группе и 915±131 мм рт. ст. в III группе (рис. 5).
Рис. 4. Зависимость растяжения испытуемого образца в поперечном направлении от нагрузки: группа 1 — синяя кривая; группа 2 — красная; группа 3 — зеленая кривая
Рис. 5. Пиковое давление в испытуемых сосудах в сравнении с физиологическим артериальным давлением человека: группа 1 — синий цвет; группа 2 — красный; группа 3 — зеленый цвет; фиолетовый столбец — физиологическое давление 120±20 мм рт. ст.
Разрушение артерий выражалось в виде продольных разрывов стенки. Нативные и децеллю-ляризованные артерии сохраняли естественную трубчатую форму без выпячиваний стенки вплоть до разрыва.
Обсуждение
Исследование было проведено на АП, оснований для экстраполяции полученных данных на другие артерии нет, так как структура сосудистой стенки может для них значительно отличаться.
Децеллюляризованные АП представляют собой подходящую основу для тканевой инженерии сосудов в связи с сохраненной нативной структурой ЭЦМ, отсутствием иммуногенных свойств [6, 7, 12, 25, 38] и оптимальной по времени биодеградации [38]. Детальному изучению морфологических свойств децеллюляризованных сосудов было уделено внимание на первом этапе работы, при разработке протокола децеллюляризации, на который впоследствии был получен патент РФ на изобретение [27, 28]. В ходе данного исследования были впервые определены биомеханические свойства АП до и после децеллюляризации. В доступной литературе была найдена всего одна статья, где описаны упруго-эластические свойства АП человека [21]. Наши данные коррелируют с данными авторов публикации в части определения пикового давления, в то же время для определения зависимости нагрузки-деформации ими была использована другая методика, основанная на измерении изменения диаметра сосуда под нагрузкой, что не позволяет напрямую сравнивать результаты. Биаксиальная методика, использованная нами, является классической и более универсальной,
Гены & Клетки Том IX, № 2, 2014
Оригинальные исследования
85
чаще используется при определении механических свойств материалов. Кроме того, исследование устойчивости к прорезыванию шовного материала было проведено нами впервые. Полученные данные представляют большой интерес, так как биомеханические свойства будущего тканеинженерного сосуда, которые влияют на его проходимость, подверженность аневризмообразованию при последующей трансплантации в кровеносное русло в экспериментах in vivo, напрямую зависят от биомеханических свойств ЭЦМ децеллюляризованной артерии.
Следует отметить разную толщину сосудистой стенки до и после обработки, выражающуюся, прежде всего, в увеличении диаметра просвета сосуда с сохранением внешнего диаметра, что, по всей видимости, связано с удалением клеточных элементов из артерии. Испытание на разрывной машине показало, что децеллюляризованные артерии сохраняют свою прочность, но при этом становятся более растяжимыми. При практически одинаковой максимальной нагрузке, деформация децеллюля-ризованных артерий была в 1,5 раза больше, чем нативных. Причем динамика растяжения наиболее отличается при низкой нагрузке, что возможно связано с отсутствием гладкомышечных клеток в сосудистой стенке децеллюляризованных артерий, обеспечивающих базальный тонус артерии. С повышением нагрузки сопротивление деформации обеспечивается в основном коллагеновыми волокнами ЭЦМ и угол наклона кривых сравнивается (см. рис. 3), отражая, таким образом, интактную структуру матрикса.
При растяжении образцов в поперечной плоскости, максимальная нагрузка оказалась существенно выше для всех трех групп, равно как и изменение длины относительно исходной, что, очевидно, связано с большей площадью поперечного сечения образцов и увеличенным сопротивлением ЭЦМ. При этом угол наклона кривых практически совпадает (см. рис. 4). Полученные данные позволяют говорить о том, что децеллюляризация не оказывает значимого влияния на упруго-эластические свойства АП.
ЛИТЕРАТУРА:
1. World Health Organization. World health statistics 2013. Geneva: WHO Press; 2013.
2. Курьянов ri.C. Механизмы гиперплазии интимы и ее значе-
ние при хирургическом лечении атеросклероза сонных артерий. Автореферат дисс___ канд. мед. наук. СПб: 2009: 19.
3. Teebken O.E., Haverich A. Tissue Engineering of Small Diameter Vascular Grafts. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 2002; 23 (6): 475-85.
4. Van Det R.J., Vriens B. H. R., van der Palen J. et al. Dacron or ePTFE for femoro-popliteal above-knee bypass grafting: short- and long-term results of a multicentre randomised trial. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 2009; 37 (4): 457-63.
5. Prichard H.L., Manson R.J., DiBernardo L. et al. An early study on the mechanisms that allow tissue-engineered vascular grafts to resist intimal hyperplasia. J. Cardiovasc. Transl. Res. 2011; 4 (5): 674-82.
6. Schmidt C.E., Baier J.M. Acellular vascular tissues: natural biomaterials for tissue repair and tissue engineering. Biomaterials 2000; 21 (22): 2215-31.
7. Kakisis J.D., Liapis C.D., Breuer C. et al. Artificial blood vessel: the Holy Grail of peripheral vascular surgery. J. Vasc. Surg. 2005; 41 (2): 349-54.
8. Ma P.X. Biomimetic materials for tissue engineering. Adv. Drug. Deliv. Rev. 2008; 60 (2): 184-98.
9. Kim B.-S., Park I.-K., Hoshiba T. et al. Design of artificial extracellular matrices for tissue engineering. Prog. Polym. Sci. 2011; 36 (2): 238-68.
10. Naito Y., Shinoka T., Duncan D. et al. Vascular tissue engineering: Towards the next generation vascular grafts. Adv. Drug Deliv. Rev. 2011; 63: 312-23.
Децеллюляризованные артерии также сохраняют устойчивость к прорезыванию шовным материалом. Кроме того, при проведении этих опытов отмечено удобство работы с сосудом, легкость наложения шва, что является несомненным преимуществом при дальнейшей имплантации биоинженерных сосудистых кондуитов на основе децеллюляризированных АП в экспериментах in vivo.
При проведении испытаний на максимальное давление, обнаружено, что децеллюляризованные артерии не теряют свою прочность и способны выдерживать давление значительно выше физиологического (см. рис. 5).
Сохранение параметров децеллюляризованных сосудов в ходе их хранения важно с точки зрения удобства работы и уменьшения времени на получение готового тканеинженерного графта. Ранее нами была опробована методика криоконсервирования как нативных, так и децеллюляризованных артерий, но в результате мы от неё отказались, так как происходило значимое снижение прочности после размораживания (данные не представлены). В итоге мы использовали способ, ранее предложенный S. Dahl с соавт. (2011), которые описали хранение децеллюляризованных сосудов в стерильном ФСБ при температуре +4°С до 12 мес. без видимого разрушения ЭЦМ и, соответственно, сохранением прочности [24]. Наши результаты также позволяют говорить о том, что децеллюляризованные сосуды могут храниться таким образом достаточно долгое время без изменения биомеханических свойств.
Заключение
Разработанный нами способ децеллюляризации сосудов малого калибра эффективно удаляет клетки и клеточный дебрис, оставляя ЭЦМ неповрежденным. Сохранность и пригодность ЭЦМ также подтверждена при изучении механических свойств децеллюляризованных сосудистых кондуитов. Де-целлюляризованные артерии пуповины могут стать подходящей основой для создания биоинженерных сосудов малого калибра.
11. Gilbert T.W., Sellaro T.L., Badylak S.F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials 2006; 27 (19): 3675-83.
12. Stegemann J.P., Kaszuba S.N., Rowe S.L. Review: advances in vascular tissue engineering using protein-based biomaterials. Tissue Eng. 2007; 13 (11): 2601-13.
13. Fung Y. C. Biomechanics. Mechanical Properties of Living Tissues. 2nd ed. New York: Springer; 1993.
14. Dobrin P.B. Mechanical properties of arterises. Physiol. Rev. 1978; 58 (2): 397-460.
15. Zou Y., Zhang Y. Mechanical Evaluation of Decellularized Porcine Thoracic Aorta. J. Surg. Res. 2012; 175 (2): 359-68.
16. Liao J., Joyce E.M., Sacks M.S. Effects of decellularization on the mechanical and structural properties of the porcine aortic valve leaflet. Biomaterials. 2008; 29 (8): 1065-74.
17. McFetridge P.S., Daniel J.W., Bodamyali T. et al. Preparation of porcine carotid arteries for vascular tissue engineering applications. J. Biomed. Mater. Res. A 2004; 70A (2): 224-34.
18. Chang Y., Hsu C.-K., Wei H.-J. et al. Cell-free xenogenic vascular grafts fixed with glutaraldehyde or genipin: in vitro and in vivo studies. J. Biotechnol. 2005; 120 (2): 207-19.
19. Dahl S.L.M., Koh J., Prabhakar V. et al. Decellularized native and engineered arterial scaffolds for transplantation. Cell Transplant. 2003; 12 (6): 659-66.
20. Roy S., Silacci P., Stergiopulos N. Biomechanical properties of decellularized porcine common carotid arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2005; 289 (4): H1567-76.
21. Gui L., Muto A., Chan S.A. et al. Development of Decellularized Human Umbilical Arteries as Small-Diameter Vascular Grafts. Tissue Eng. Part A 2009; 15 (9): 2665-76.
Гены & Клетки Том IX, № 2, 2014
86
Оригинальные исследования
22. Williams C., Liao J., Joyce E.M. et al. Altered structural and mechanical properties in decellularized rabbit carotid arteries. Acta Biomater. 2009; 5 (4): 993—1005.
23. Волова Т.Г. Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Учебное пособие. Красноярск: ИПК СФУ; 2009.
24. Dahl S.L.M., Kypson A.P., Lawson J.H. et al. Readily available tissue-engineered vascular grafts. Sci. Transl. Med. 2011; 3 (68): 1-11.
25. Quint C., Kondo Y., Manson R.J. et al. Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit. PNAS USA 2011; 108 (22): 9214-9.
26. Hoenicka M., Jacobs V.R., Huber G. et al. Advantages of human umbilical vein scaffolds derived from cesarean section vs. vaginal delivery for vascular tissue engineering. Biomaterials 2008; 29 (8): 1075-84.
27. Насрединов А.С., Лаврешин А.В., Анисимов С.В. и др. Децеллюляризованные артерии пуповины человека как основа тканеинженерных кровеносных сосудов малого калибра. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2013; VIII (1): 66-71.
28. Насрединов А.С. Способ децеллюляризации кровеносных сосудов малого калибра. Патент РФ на изобр. №2504334. 28 ноября 2012.
29. Dardik H., Dardik I. Successful arterial substitution with modified human umbilical vein. Ann. Surg. 1976; 183 (3): 252-8.
30. Dardik H., Ibrahim I.M., Dardik I. Evaluation of glutaraldehyde-tanned human umbilical cord vein as a vascular prosthesis for bypass
to the popliteal, tibial, and peroneal arteries. Surgery 1978; 83 (5): 577-88.
31. Dardik H., Miller N., Dardik A. et al. A decade of experience with the glutaraldehyde-tanned human umbilical cord vein graft for revascularization of the lower limb. J. Vasc. Surg. 1988; 7 (2): 336-46.
32. Dardik H., Miller N., Dardik A. et al. Biodegradation and aneurysm formation in umbilical vein grafts. Observations and a realistic strategy. Ann. Surg. 1984; 199 (1): 61-8.
33. Rondhuis J.J., van Iersel J.G., Taks A.C. The use of autologous graft and human umbilical vein graft in femorocrural bypasses -- a preliminary report. Neth. J. Surg. 1985; 37 (2): 50-3.
34. Nevelsteen A., D'Hallewin M.A., Deleersnijder J. et al. The human umbilical vein graft in below-knee femoropopliteal and femorotibial surgery: an eight year experience. Ann. Vasc. Surg. 1986; 1 (3): 328-34.
35. Yeh H.S., Keller J.T., Brackett K.A. et al. Human umbilical artery for microvascular grafting. Experimental study in the rat. J. Neurosurg. 1984; 61 (4): 737-42.
36. Гмурман В.Е. Теория вероятностей и математическая статистика. Учебное пособие для ВУЗов. 9-е изд., стер. М.: Высшая. школа; 2003.
37. Макарова Н.В., Трофимец В.Я. Статистика в Excel. Учебное пособие. М.: Финансы и статистика; 2002.
38. Zhao Y., Zhang S., Zhou J. et al. The development of a tissue-engineered artery using decellularized scaffold and autologous ovine mesenchymal stem cells. Biomaterials 2010; 31 (2): 296-307.
Поступила 18.03.2014
Гены & Клетки Том IX, № 2, 2014
