CC BY
24
HayKOBMM BiCHMK ^tBiBCtKoro Ha^OHa^tHoro yHiBepcMTeTy
BeTepMHapHoi Megw^HM Ta öioTexHO^oriw iMem C.3. I^M^Koro
Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies
ISSN 2518-7554 print ISSN 2518-1327 online
doi: 10.15421/nvlvet8343 http://nvlvet.com.ua/
UDC 619:616.98:578.842:636.4
Approbation of RT-qPCR test kit for differential diagnosis of African and Classical swine fever
S.S. Mandyhra, L.M. Muzykina, L.M. Ishchenko, G.A. Kovalenko, I.V. Halka, V.G. Spyrydonov, S.A. Nychyk
Institute of Veterinary Medicine of NAAS, Kyiv, Ukraine
Article info
Received 29.01.2018 Received in revised form
05.03.2018 Accepted 09.03.2018
Institute of Veterinary Medicine of the National Academy of Agrarian Sciences of Ukraine (IVMNAAS), Donetska str, 30, Kyiv, 03151, Ukraine. Tel.: +38-098-293-99-66 E-mail: mandygra@ukr. net
Mandyhra, S.S., Muzykina, L.M., Ishchenko, L.M., Kovalenko, G.A., Halka, I. V., Spyrydonov, V.G., & Nychyk, S.A. (2018). Approbation of RT-qPCR test kit for differential diagnosis of African and Classical swine fever. Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies. 20(83), 221-225. doi: 10.15421/nvlvet8343
The first Ukrainian real-time reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-qPCR) based test kit for the differential diagnosis of African (AFS) and Classical swine fever (CSF) has been developed in the Institute of Veterinary Medicine of NAAS. The proposed test kit allows simultaneous detection of three targets: ASFV DNA, CSFV cDNA and an internal control .sample. The goal of this work was to provide an expert evaluation of the RT-qPCR kit for differential diagnosis of ASF and CSF according to appearance, analytical sensitivity, specificity and repeatability. Interdepartmental evaluation of the kit was conducted in the State Scientific and Research Institute of Laboratory Diagnostics and Veterinary and Sanitary Expertise (DNDILDEVSE) in accordance with the approved methodology. The RT-qPCR kit sensitivity was determined by testing 10-fold serial dilutions of the ASFV DNA and CSFV cDNA (concentration range was 103100 copies/^l). For specificity determination reference samples of ASFV DNA different genotypes, ASF and CSF positive and negative field samples, as well as pathogens which cause similar to ASF and CSF clinical syndromes were used. Sample preparation and amplification were performed according to the test kit instructions. The amplification was accomplished on QuantStudio™ 5 System (Applied Biosystems). As a result of accomplished interdepartmental evaluation high sensitivity, specificity and repeatability of RT-qPCR kit were confirmed. In particular, it was determined that the limit of detection of the RT-qPCR kit was 5 copies of the ASFV and CSFV genomes per one reaction. The high specificity of the assay to ASFV (I, II, V, VIII, IX and X genotypes) and CSFV was confirmed. It was shown no cross-reactions with closely related pigs viruses (porcine circovirus type 2, porcine reproductive and respiratory syndrome virus and virus of Aujeszky's disease). The high enough repeatability of results was also confirmed. In conclusion, the obtained results are in compliance with the requirements of the RT-qPCR kit normative and technical documentation. This RT-qPCR kit will be recommended for use in veterinary medicine laboratories after its registration would be done.
Key words: African swine fever, ASF, Classical swine fever, CSF, RT-qPCR
Апробащя ЗТ-ПЛР тест-системи для диференцшно'1 дiагностики африкансько'1 та класично'1 чуми свиней
С.С. Мандигра, Л.М. Музикша, Л.М. 1щенко, Г.А. Коваленко, 1.В. Галка, В.Г. Спиридонов, С.А. Ничик
1нститут ветеринарно'1' медицини НААН, м. Кшв, Укра'та
В iHcmumymi ветеринарног медицини НААН уперше в Укран розроблено diasHocmuuHuü Ha6ip для диференцшног àiasHocmuKU африканськоï (АЧС) ma класичног чуми свиней (КЧС) меmoдoм звoрomнo-mрaнcкрuпmaзнoï полтеразног ланцюговог реакцй (ЗТ-ПЛР) у режuмiреального часу. Розроблений дiaгнocmuкyм дозволяе одночасно деmекmyвamu mрu мШет: ДНК вiрycy АЧС, кДНК вiрycy КЧС i внymрiшнiй кoнmрoльнuй зразок. Меmoю рoбomu було прoвеcmu екcперmнy оцтку дiaгнocmuчнoгo набору для дифере-нцшног дiaгнocmuкu АЧС ma КЧС меmoдoм ПЛР у режuмiреального часу за показниками: зовншнт вигляд, чymлuвicmь, cnецuфiч-mcmb i збiжнicmь резyльmamiв. Мiжвiдoмчi випробування дiaгнocmuкyмy було проведено на бaзi Державного НД1 з лaбoрamoрнoï
diasnocmuKU та ветеринарно-саттарног експертизи (ДНД1ЛДВСЕ) ssidno з розробленою i затвердженою методикою. Для визна-чення чуmлuвocmi дiaгнocmuкуму до^джували серю 10-кратних розведень ДНК eifycy АЧС i кДНК КЧС (в концентрацИ 10Т-10Г котй/мкл). Для визначення cпецuфiчнocmi до^дувалиреферентн зразки ДНК вiруcу АЧСрiзнuх генотитв, пoльoвi зразки позити-вн та негативн щодо АЧС, КЧС, а також стороны збудники. Пiдгomoвку зразтв та проведення aмnлiфiкaцi^ проводили здто з лucmiвкoю-вклaдкoю до дiaгнocmuкуму. АJmлiфiкaцiю здшснювали на прuлaдi QuantStudio™ 5 System, виробник «Applied Biosystems». Урезульmami роботи тдтверджено високу чутлив^ть, cпецuфiчнicmь та збiжнicmь дiaгнocmuкуму. Зокрема визна-чено, що чутливкть тест-системи становить близько 5 копт ДНК вiруcу АЧС та 5 копт кДНК вiруcу КЧС на одну реакцЮ. Шдтверджено cпецuфiчнicmь дiaгнocmuкуму до вiруciв АЧС (I, II, V, VIII, IX,X генотитв) та КЧС. При цьому не спостер^алось неcпецuфiчнuх реакцш зi сторонтми вiруcaмu (цuркoвiруc свиней 2-го типу, вiруc репродуктивно-рестраторного синдрому свиней, вiруc хвороби Ауест). Шдтверджено також достатньо високу збiжнicmь резульmamiв. Загалом, отриман результати вiдпoвiдa-ють вимогам нормативно-техтчног документацИ дiaгнocmuкуму. Протестований дiaгнocmuкум тсля проведення реестрацп буде рекомендований для використання у лaбoрamoрiях ветеринарног медицини.
Ключовi слова: африканська чума свиней, АЧС, класична чума свиней, КЧС, ЗТ-ПЛР у режим реального часу.
Вступ
В Укра!ш зростання економ1чно1 ефективносп ви-робництва свинини завжди було прюритетним за-вданням аграрно! полтики (Nesterenko, 2015; Beltran-Alcrudo et al., 2017). Але в останш роки галузь сви-нарства в нашш держав1 перебувае у кризовому сташ, що е наслщком етзооти африкансько! чуми свиней (АЧС). Т1льки за останш чотири роки кшьшсть свиней в Укра!ш скоротилась на 23,4% i станом на 1 березня 2018 р. склало 6,07 млн голiв (ukrstat.gov.ua; Hryshchenco, 2017).
Складна етзоотична ситуащя щодо АЧС в Укра!-ш, де спалахи хвороби рееструються практично у вах областях (з 2012 р. зареестровано 356 випадшв АЧС), потребуе оперативного й ефективного виконання комплексу профшактичних i протиетзоотичних захо-дiв (asf.vet). Осшльки засобiв специфiчно! профшак-тики i лiкування АЧС не юнуе, дiагностика е ключо-вою ланкою ветеринарно-санiтарних заходiв у боро-тьбi з епiзоотiею (Costard et al., 2009; Gallardo et al., 2015).
Своечасна (рання) i дост^рна дiагностика АЧС мае першочергове значення, оск1льки дозволяе визна-чити наявшсть iнфекцiйного агенту на початкових етапах розвитку хвороби i виробити оптимальну стра-тепю боротьби. Подiбнiсть клiнiчних i патологоана-томiчних ознак за африкансько! й класично! чуми свиней (КЧС) ускладнюе встановлення дiагнозу (Moennig et al., 2003; Maksimovich and Semenov, 2016; Schulz et al., 2017). Найбшьш ефективним методом диференцшно! дiагностики АЧС i КЧС е полiмеразна ланцюгова реакцп (ПЛР) (King et al., 2003; Hoffmann et al., 2005; Oura et al., 2013). В Украш для шдтвер-дження дiагнозу користуються переважно моноплекс-ними комерцшними тест-системами, як1 не дозволя-ють одночасно виявляти обидва збудника в однш пробi. У зв'язку з цим в 1нстшуп ветеринарно! медицини НААН розроблено та устшно провалвдовано перший в Укра!ш дiагностичний набiр для диференцшно! дiагностики АЧС та КЧС методом ЗТ-ПЛР у реальному час (Mandygra et al., 2017). Розроблений дiагностикум дае можливiсть одночасно виявляти три мшеш: ДНК вiрусу АЧС, кДНК вiрусу КЧС i внутрь шнш контрольний зразок (ВКЗ), що сприяе економи часу та коштiв на проведення дослщжень.
Метою роботи було проведення експертно! оцiнки тест-системи для диференцшно! дiагностики афри-кансько! та класично! чуми свиней методом ПЛР у
режимi реального часу за показниками: зовнiшнiй вигляд, чутливiсть, специфiчнiсть та збiжнiсть результата.
Матерiал i методи дослщжень
Мiжвiдомче випробування дiагностичного набору проводили зпдно з наказом Держпродспоживслужби Укра!ни № 602-113-13/7278 вiд 4 грудня 2017 р. на базi Науково-дослвдного вiддiлу молекулярно-генетичних дослiджень Державного НД1 з лаборатор-но! дiагностики та ветеринарно-сашгарно! експертизи (ДНД1ЛДВСЕ), м. Ки!в.
Дослвдну серiю дiагностичного набору «АЧС/КЧС дуо ПЛР-РЧ» для диференцшно! дiагностики афри-кансько! та класично! чуми свиней методом ПЛР у режимi реального часу оцшювали за показниками: зовнiшнiй вигляд, чутливють, специфiчнiсть та збiж-шсть результатiв, згiдно з розробленою i затвердже-ною методикою випробувань.
Для комiсiйного випробування було тдготовлено панель зразк1в, що включала: 10-кратш розведення ДНК вiрусу АЧС (початкова концентращя 1х103 котй/мкл) та кДНК вiрусу КЧС (початкова концентращя 1х103 копiй/мкл); референс-зразки ДНК вiрусу АЧС I, V, VIII, IX, X генотитв; три польовi зразки, позитивш щодо вiрусу АЧС (№ 1-3); один зразок бюлопчного матерiалу, позитивного щодо вiрусу КЧС (штам «Вашингтон»); два польовi зразки, нега-тивнi щодо АЧС та КЧС (№ 1-2); а також вiрусовмiс-нi суспензi! культур клггин iз збудником репродукти-вно-рестраторного синдрому свиней (РРСС) - штам «Lelystad», цирковiрусом свиней 2-го типу (ЦВС-2) -штам «Stoon 1010» i вiрусом хвороби Ауеск1 - штам «ПетрЫвський-2006». Усi зразки дослвджували у трьох повторах.
Пiдготовку дослвдних зразк1в, постановку реакцп амплiфiкацi! та облiк результата проводили зпдно з листiвкою-вкладкою до дiагностичного набору.
Реакцiйну сумiш готували, змiшуючи 17,0 мкл реактиву «ПЛР-сумш» та 3,0 мкл реактиву «Праймер-сумiш» (у розрахунку на одну пробу). Видшену ДНК/РНК дослщних i контрольних зразк1в додавали в об'емi 5,0 мкл.
Амплiфiкацiю здшснювали в режимi реального часу за допомого приладу QuantStudio™ 5 System, виробник «Applied Biosystems». Умови амплiфiкацi! були такими: I) 50 °С - 30 хв, зворотна транскрипщя; II) 95 °С - 10 хв, початкова денатура^ ДНК;
III) 45 цимв (95 °С - 20 с, денатурацiя ДНК; 58 °С -20 с, вщпал праймерiв; 72 °С - 30 с, елонга^). Флуоресценцiю вимiрюють при TeMnepaTypi 58 °С за барвиками FAM (ДНК АЧС), ROX (РНК КЧС) та JOE (ВКЗ).
Результати aнaлiзу вважали достовiрними, якщо значення Ct за барвниками FAM та ROX позитивного контролю < 35, значення Ct негативного контролю ввдсутне, значення Ct по JOE вах дослщжуваних зразк1в (aмплiфiкaцiя ВКЗ) < 35. При цьому дослвджу-ваний зразок вважаеться позитивним щодо АЧС, як-що значення Ct по FAM < 40, позитивним щодо КЧС - якщо Ct по ROX < 40.
Результати та ix обговорення
На початку роботи комЫею було перевiрено якiсть маркування, пакування та комплектнiсть ПЛР тест-системи. Ус необхiднi для роботи компоненти (ПЛР сумш, Прaймер-сумiш, позитивний, негативний та внутршнш контрольнi зразки) та лиспвка-вкладка
були в наявносп. CTopoHHix домшок, трiщин пробь рок не спостерталось.
Чутливiсть дiaгностичного набору визначали шляхом тестування cepii 10-кратних розведень ДНК Bipy-су АЧС та кДНК вipyсy КЧС. Межею виявлення (limit of detection, LOD) вважалось останне розведення ДНК вipyсy АЧС та кДНК вipyсy КЧС, за яким спостерта-лося збiльшення росту криво! флуоресцешц!, а значення Ct по FAM та ROX становило < 40.
На рисунку 1 i тaблицi 1 видно, що довipчий ште-рвал аналогично! чyтливостi до вipyсiв АЧС за конце-нтpaцiй 1,0x103 - 1,0x10° котй/мкл становив 100%, вiдповiдно межа виявлення склала 1 кошю/мкл ДНК вipyсy АЧС, або 5 копш на реакцш.
Iдентичнi результати отримаш за визначення чут-ливостi дiaгностикyмy й до вipyсy КЧС: 100 % довip-чий iнтеpвaл аналггачно! чyтливостi за концентpaцiй 1,0x103 - 1,0x100 копiй/мкл, межа виявлення - 1 ко-пiя/мкл кДНК вipyсy КЧС, або 5 копiй на реакцш (рис. 2).
250.000 20С.ООО 150.00 0 100,000 50.000 0
■50.000
Cycle
Рис. 1. Крив1 ампл1ф1кацп щльово! послщовносл Bipycy АЧС за FAM К+ - позитивний контроль польов1 зразки позитивнi на АЧС; референс зразки ДНК вiрycy АЧС I, V, VIII, IX та X генотитв;
10*1, 10*0 - 10-кратт розведення кДНК вiрycy КЧС
; № 1-3 -10*3, 10*2,
Специфiчнicть дiагноcтикyмy визначали за наявнь стю флyореcцентного cигналy по FAM (детекщя ДНК вiрycy АЧС) та ROX (кДНК вiрycy КЧС) за викорис-тання явно позитивних зразшв i вiдcyтноcтi вищезга-даного cпецифiчного флyореcцентного cигналy щодо FAM та ROX за перевiрки негативних зразшв, вклю-чаючи cтороннi з6удники.
За резyльтатами, наведеними в таблиц 1, специфь чнicть дiагноcтичного набору становила 100% для доcлiджyваних зразшв, при цьому хибних резyльтатiв i неcпецифiчних реакцiй не cпоcтерiгалоcя.
Варто зазначити, що результати мiжвiдомчого ви-пробування пiдтверджyють, що розроблений в IBM НААН дiагноcтикyм виявляе ДНК вiрycy АЧС не тiльки II генотипу, який циркулюе на територп Укра!-ни та Свропи, а також I, V, VIII, IX та X генотитв.
Встановлено високу збiжнicть резyльтатiв, отри-маних за використання дiагноcтичного набору. При виявленш ДНК вiрycy АЧС та кДНК вiрycy КЧС в зразках у трьох повторах статистично значущих роз-бiжноcтей резyльтатiв не cпоcтерiгалоcь (SD було в межах 0,5).
Рис. 2. Крив1 ампл1ф1кацп цшьово! послщовносп в1русу КЧС за ROX: К+ - позитивный контроль; № 1 - РНК в1русу КЧС, штам «Вашингтон»; 10*3, 10*2, 10*1, 10*0 - 10-кратш розведення кДНК в1русу КЧС
Таблиця 1
Результати мгжввдомчого випробування д1агностичного набору «АЧС/КЧС дуо ПЛР-РЧ» (зразки дослщжеш у 3-х повторах)
№
Зразок
Результати FAM (АЧС)
Результати ROX (КЧС)
а
середне
JOE
11/11 середне SD середне SD (ВКЗ)
1 Позитивний контрольний зразок (К+) 16,64 - 17,38 - -
2 Негативний контрольний зразок (К-) - - - - -
3 ДНК в!русу АЧС (1,0х103 кошй/мкл) 22,85 0,06 - - 28,50
4 ДНК в1русу АЧС (1,0х102 котй/мкл) 26,12 0,05 - - 28,31
5 ДНК в!русу АЧС (1,0x10' копiй/мкл) 30,10 0,12 - - 28,13
6 ДНК в1русу АЧС (1,0x10° копш/мкл) 34,40 0,13 - - 28,57
7 кДНК в1русу КЧС (1,0х103коп1й/мкл) - - 22,91 0,04 27,60
8 кДНК в!русу КЧС (1,0х102коп1й/мкл) - - 26,50 0,05 27,96
9 кДНК в1русу КЧС (1,0х101коп1й/мкл) - - 29,80 0,08 27,99
10 кДНК в1русу КЧС (l,0x10°котй/мкл) - - 32,96 0,33 27,09
11 Польовий зразок позитив на АЧС №1 16,25 0,15 - - 26,47
12 Польовий зразок позитив на АЧС №2 17,10 0,09 - - 27,49
13 Польовий зразок позитив на АЧС №3 14,60 0,10 - - 27,12
14 РНК в1русу КЧС, штам«Вашингтон» - - 16,47 0,12 28,56
15 Референс зразок ДНК в1русу АЧС генотип I 23,90 0,06 - - 25,73
16 Референс зразок ДНК в1русу АЧС генотип V 28,25 0,51 - - 27,71
17 Референс зразок ДНК в1русу АЧС генотип VIII 28,65 0,74 - - 28,29
18 Референс зразок ДНК в1русу АЧС генотип IX 30,66 0,38 - - 28,40
19 Референс зразок ДНК в1русу АЧС генотип X 19,22 0,10 - - 29,06
20 Польовий зразок негативний на АЧС, КЧС №1 - - - - 27,79
21 Польовий зразок негативний на АЧС, КЧС №2 - - - - 28,06
22 ДНК ЦВС-2 - - - - 26,34
23 РНК в!русу РРСС - - - - 28,10
24 ДНК в1русу хв. Ауесю - - - - 26,44
Висновки
В ход1 м1жв1домчого випробування д1агностичного набору «АЧС/КЧС дуо ПЛР-РЧ», проведеного на баз1 ДНД1ЛДВСЕ, встановлено:
1. Чутлив1сть д1агностикуму становить близько 5 копш ДНК в1русу АЧС та 5 копш кДНК в1русу КЧС на одну реакцш.
2. Тест-система специф1чна до в1русу АЧС (I, II, V, VIII, IX та X генотитв) та КЧС, при цьому не ампль
фшуе ДНК циpковipyсy свиней 2-го типу, РНК вipyсy РРСС, ДНК вipyсy хвороби Ауеск1.
3. За дослвдження проб у трьох повторах статисти-чно значущих pозбiжностей виявлено не було (SD було в межах 0,5).
Перспективи подальших дослiджень. Шсля завер-шення реестрацп розробленого в 1ВМ НААН дiaгнос-тичного набору, плануеться впровадження його у лабораторну практику ветеринарно! медицини Укра!-ни.
References
Vypadky AChS v Ukraini z 2012 roku. Elektronnyi resurs: http:www.asf.vet.ua/index.php/purpose-
project/about-asf/198-vypadky-achs-vukrai ni-z-2012-roku (in Ukrainian). Hryshchenko, N.P. (2017). Rozvytok svynarstva v Ukraini. Naukovyi visnyk NUBIP Ukrainy. Seriia. Tekhnolohiia vyrobnytstva i pererobky produktsii tvarynnytstva. 271, 16-23. Rezhym dostupu: http://joumals.nubip.edu.Ua/index.php/Tekhnologiya/a rticle/view/10066 (in Ukrainian). Kilkist silskohospodarskykh tvaryn (shchomisiachna informatsiia). Elektronnyi resurs: Derzhavnoi sluzhby statystyky Ukrainy. Rezhym dostupu: www.ukrstat.gov.ua. Nazva z domashnoi storinky Internetu. (in Ukrainian). Maksimovich, V.V., & Semenov, S.V. (2016) Differen-cial'naja diagnostika afrikanskoj chumy svinej. Uchenye zapiski UO VGAVM. 52(1), 60-67 (in Russian).
Nesterenko, S.A. (2015). Rozvytok haluzi svynarstva u silskohospodarskykh pidpryiemstvakh. Visnyk Berdianskoho universytetu menedzhmentu i biznesu. 1(29), 80-86 (in Ukrainian). Mandyhra, S.S. (2017). Rozrobka test-systemy dlia dyferentsiinoi diahnostyky afrykanskoi ta klasychnoi chumy svynei metodom ZT-PLR u rezhymi realnoho
chasu. Veterynarna biotekhnolohiia. 31, 103-111 (in Ukrainian).
Beltran-Alcrudo, D., Arias, M., & Gallardo, C. (2017). African swine fever. detection and diagnosis - A manual for veterinarian. FAO Animal production and health. Rome. 19. ISBN 978-92-5-109752-6.
Gallardo, C., Reoyo, A.T., Fernández-Pinero, J., Iglesias, I., Muñoz, J., & Arias, L. (2015). African swine fever. a global view of the current challenge. Porcine Health Management. 14. doi: 10.1186/s40813-015-0013-y.
Costard, S., Wieland, B., & Glanville. W., et al. (2009). de African swine fever. how can global spread be prevented. Philosophical Transactions of the Royal Society B. Biological Sciences. 364(1530). 2683-2696. doi: 10.1098/rstb.2009.0098.
King, D.P., Reid, S.M., Hutchings, G.H., Grierson, S.S., Wilkinson, P.J., Dixon L.K., Bastos, A.D. & Drew, T.W. (2003). Development of a TaqMan PCR assay with internal amplification control for the detection of African swine fever virus. Journal of Virological Methods. 107(1), 53-61 doi:10.1016/S0166-0934(02)00189-1.
Moennig, V., Floegel-Niesmann, G., & Greiser-Wilke, I. (2003). Clinical signs and epidemiology of classical swine fever. A review of new knowledge. Vet. 165, 11-20 doi: 10.1016/S1090-0233(02)00112-0.
Oura, C.A.L., Edwards, L., Batten, C.A. (2013). Virologi-cal diagnosis of African swine fever - Comparative study of available tests. Virus Research. 173, 150158. doi: 10.1016/j.virusres.2012.10.022.
Schulz, K., Staubach, C., & Blome, S. (2017). African and classical swine fever. similarities, diferences and epidemiological consequences. Veterinary Research. 48, 84. doi: 10.1186/s13567-017-0490-x.
Hoffmann, B., Beer, M., Schelp, C., Schirrmeier, H., & Depner, K. (2005). Validation of a real time RT-PCR assay for sensitive and specific detection of classical swine fever. Journal of Virological Methods. 130, 36-44. doi: 10.1016/j.jviromet.2005.05.030.
