CC BY
25
10B
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
апоптоз лимфоцитов крови у детей периода
новорожденности с клебсиеллезным сепсисом
Х.С. Хаертынов 1, С.В. Бойчук1, В.А. Анохин 1, Б.Р. Рамазанов 1, А.А. Ризванов 2, С.Ф. Хайбуллина 2, С.А. Любин 3, И.В. Агапова 3
1 Казанский государственный медицинский университет, Казань, Россия
2 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
3 Городская детская больница № 1, Казань, Россия
Lymphocyte apoptosis in neonatal sepsis due to klebsiella
Kh.S. Khaertynov1, S.V. Boichuk 1, VA. Anokhin 1, B.R. Ramazanov1, AA. Rizvanov 2, S.F. Khaiboullina 2, S.A. Lubin 3, I.V. Agapova 3
1 Kazan State Medical University, Kazan, Russia
2 Kazan (Volga Region) Federal University, Kazan, Russia
3 City children's Hospital №1, Kazan, Russia
Проведено исследование апоптоза лимфоцитов у 10 детей с поздним неонатальным сепсисом, обусловленным Klebsiella pneumoniae. Большинство детей (70%) родились недоношенными . Контрольную группу составили 7 здоровых детей периода новорожденности . Оценка апоптоза лимфоцитов осуществлялась на основании количественной оценки гиподиплоидных клеток по изменению интенсивности их окраски пропидия йодидом (с помощью проточной цитометрии . Установлено, что неонатальный сепсис во всех случаях протекал на фоне активации процессов апоптоза лимфоцитов . Медиана активности изучаемого процесса к 5 дню культивирования составляла 18,1%, в то время, как в контроле она равнялась 7,8% . Развитие абсолютной лимфопении отмечалось в 30% случаев . Усиление гибели лимфоцитов по механизму апоптоза не коррелировало с исходным количественным показателем С-реактивного белка пациентов (Spearman R = 0,48, p = 0,18) . Таким образом, острый период клебсиеллезного сепсиса у детей периода новорожденности протекает на фоне повышенной активности процессов апоптоза лимфоцитов периферической крови
Ключевые слова: неонатальный сепсис, клебсиелла, апоптоз лимфоцитов
Введение
Неонатальный сепсис (НС) продолжает оставаться наиболее актуальной инфекционной патологией у детей периода новорожденности, что обуславливается значительной его распространенностью и летальностью в этой возрастной группе [1]. Исход любого инфекционного процесса, как известно, определяется соотношением сил между патогеном и иммунной системой организма . Иммунологическая недостаточность может стать решающим фактором, определяющим исход заболевания . Особенно актуальным данное положение является для детей неонатального периода, иммунная система которых характеризуется незрелостью факторов врожденного иммунитета и практически полным отсутствием адаптивных иммунных реакций, что и объясняет высокую заболеваемость сепсисом в данной возрастной группе [2]. Поэтому, при изучении патофизиологии НС актуальным представляется исследование причин, оказывающих депрессивное влияние на иммунную систему . Одной из них является апоптоз клеток иммунной системы . Апоптоз, или генетически программируемая гибель клеток, определяет патогенез различных заболеваний (онкологических, аутоиммунных), в том числе и инфекционных (ВИЧ-инфекция, сепсис) [3]. Роль апоптоза при инфекционном процессе состоит в элиминации
e-mail: khalit65@rambler . ru
The apoptosis of lymphocytes was examined in 10 infants with late neonatal sepsis induced by Klebsiella pneumoniae Most of the infants (70%) were preterm . Control group consisted of 7 healthy newborns . Apoptosis analysis was examined by counting the numbers of hypodiploid cells by using a propidium iodide (DNA staining procedure and flow cytometry analysis . We observed an elevated numbers of apoptotic cells in all cases of neonatal sepsis Median of lymphocyte apoptosis was 18 . 1% on day 5 of cell culture, whereas in control patients it was up to 7,8% . Absolute lymphopenia was observed in 30% of cases with neonatal sepsis The activity of lymphocyte apoptosis was not associated with quantitative baseline of C-reactive protein (Spearman R = 0,48, p = 0,18) . Acute phase of neonatal sepsis induced by Klebsiella pneumonia is associated with an increased apoptosis of peripheral blood lymphocytes
Keywords: neonatal sepsis, klebsiella, lymphocyte apoptosis
макрофагами «отработавших» активированных клеток иммунной системы, подвергшихся инфекционному воздействию . Индукция этого процесса может проходить двумя путями: либо через экспрессию т . н . «рецепторов смерти» (TNF-, Fas-рецепторов и др . ) плазматической мембраны (внешний путь), либо через снижение мембранного потенциала митохондрий (внутренний путь) [3, 4]. Лабораторными маркерами апоптоза иммунокомпетентных клеток являются: выраженная экспрессия белков CD95 (Fas-рецептор) и CD120 (рецептор к фактору некроза опухоли) на плазматических мембранах, снижение мембранного потенциала митохондрий и высвобождение цитохро-ма С, транслокация фосфатидилсерина с внутренней на наружную поверхность мембраны клеток, повышение активности каспаз [3, 4]. Отличительными морфологическими признаками апоптоза являются: дегидратационное сжатие клеток, утрата межклеточных контактов, блеббинг, разрушение цитоскелета, конденсация хроматина, фрагментация ядра и деградация ДНК [5].
Активация апоптоза клеток иммунной системы при сепсисе сопровождается снижением в крови количества клеток врожденного и адаптивного иммунитета — CD4+, CD8 + -лимфоцитов, В-лимфоцитов и дендритных клеток [6—8]. Результаты морфологического исследования тканей людей, умерших
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
107
от сепсиса, также подтверждают наличие выраженного апоптоза иммунных клеток [7, 9, 10]. При этом, выраженность апоптоза лимфоцитов прямо коррелирует с тяжестью септического процесса и степенью иммуносупрессии [11]. Следствием избыточной активации апоптоза иммунных клеток при сепсисе является снижение эффективности иммунного ответа и ухудшении клиренса внутренних сред организма [12]. Иммуносупрессия и развивающийся при этом «иммунный паралич» являются одними из основных причин, определяющих неблагоприятный исход при сепсисе [10]. Поэтому изучение активности апо-птоза при сепсисе имеет значение как для установления развивающейся иммуносупрессии, так и для оценки прогноза заболевания . Ранее нами на основании определения величины трансмембранного ми-тохондриального потенциала [13] и методом количественной оценки гиподиплоидных клеток [14] уже была показана высокая активность процессов апо-птоза лимфоцитов у детей с поздним началом НС . Однако, причина заболевания в этих исследованиях была неоднородной и была установлена менее, чем в 50% случаев [13, 14]. В настоящем исследовании было проведено изучение процессов апоптоза у детей с НС, этиология которой во всех случаях была обусловлена только одним возбудителем — Klebsiella pneumoniae .
Цель исследования: оценка активности апоптоза лимфоцитов крови у детей с клебсиеллезным не-онатальным сепсисом на основе учета необратимых изменений в клетках
Материал и методы
Проведено исследование методом «случай-контроль» . Обследовано 10 детей (основная группа) с поздним началом неонатального сепсиса (НС) . Доношенными родились 3 (30%), недоношенными — 7 детей (70%), из них на сроках 28—30 нед . геста-ции — двое, 35—36 нед . гестации — 5 . Диагноз «сепсис» был установлен на основании развития синдрома
системного воспалительного ответа (повышение концентрации в крови С-реактивного белка более 1,5 мг/дл), наличия одного или нескольких очагов инфекции и выделения микроорганизма из венозной крови . Во всех 10 случаях НС из крови была высеяна Klebsiella pneumoniae. В половине случаев (5 детей) заболевание развилось на 4-6 дни, у другой половины (5 детей) — на 7—10 дни после рождения . Клиническая характеристика больных представлена в таблице 1. Основными очагами инфекции были пневмония и энтероколит — по 4 случая . В двух случаях заболевание протекало в виде септицемии. Однако, основным клиническим проявлением НС было развитие синдрома диссеминированного вну-трисосудистого свертывания (ДВС), которое имело место у 8 детей (80%) и проявлялось геморрагической петехиальной сыпью, кровоточивостью из мест инъекций и тромбоцитопенией . Сопутствующая патология была выявлена у 5 детей в виде гипоксиче-ского поражения головного мозга, диагностированной по результатам проведенной нейросонографии В одном случае наступил летальный исход (ребенок с септицемией), вследствие развития декомпенсиро-ванного синдрома ДВС на 2 день заболевания . Кровь от больных для исследования активности апоптоза лимфоцитов забиралась однократно, в период развернутых клинико-лабораторных проявлений сепсиса (первые 2 дня от начала заболевания) . Контрольную группу составили 7 здоровых детей периода ново-рожденности, забор крови которым осуществлялся перед проведением БЦЖ-вакцинации .
В качестве маркера фрагментация ядер клеток и деградации ДНК [6] использовали количественную оценку гиподиплоидных клеток по изменению интенсивности их окраски пропидия йодидом (Sigma Aldrich, США) с помощью метода проточной цито-метрии (FACsCanto II, Becton Dickinson, США) [15]. Активность апоптоза лимфоцитов определялась на 5 день их культивирования . Полученные результаты обработаны с применением пакета программ Statistica for Windows 6,1 (Statsoft Inc . , США) и программного обеспечения MSExel (Microsoft, США).
Таблица 1. Клинико-лабораторная характеристика детей с неонатальным сепсисом
№ Пол Сроки гестации (в неделях) при рождении Сроки развития сепсиса (день жизни) Клинический синдром Уровень СРБ (мг/дл) Количество лейкоцитов в крови (х109/л) Количество лимфоцитов в крови (х109/л)
1 мужской 39 6 ДВС 1,5 10,6 4,24
2 мужской 36 9 ДВС 1,5 12,0 2,76
3 женский 30 4 ДВС, пневмония 1,5 5,9 1,8
4 женский 38 8 ДВС, пневмония 2,0 31,2 5,3
5 мужской 35 8 ДВС, энтероколит 2,5 31,0 8,2
6 мужской 36 4 ДВС, пневмония 3,7 22,7 4,5
7 женский 36 6 ДВС, энтероколит 1,5 11,6 3,7
8 женский 36 6 ДВС, энтероколит 11,6 15,4 5,5
9 женский 38 6 пневмония 14,1 18,0 3,4
10 женский 27 6 энтероколит 11,3 15,4 1,6
Результаты и обсуждение
Установлено, что острый период клебсиеллезного сепсиса во всех случаях протекает на фоне повышенной активности апоптоза лимфоцитов, что свидетельствует о подавлении жизнеспособности этих иммунокомпетентных клеток . По литературным данным количество подвергшихся апоптозу лимфоцитов при сепсисе превышает 10% от всех циркулирующих в крови лимфоцитов, в то время, как среди здоровых людей эта цифра составляет около 5% [16]. В нашем исследовании медиана активности изучаемого процесса к 5 дню культивирования достигала 18,1%, в то время, как в контроле она равнялась 7,8% (табл . 2) .
Среди факторов, способных повлиять на активность апоптоза лимфоцитов, следует выделить гестационный возраст ребенка . Однако, из-за небольшой выборки пациентов сравнительный анализ выраженности апоптоза лимфоцитов между доношенными и недоношенными детьми проведен не был В то же время, в ранее выполненном аналогичном исследовании активности апопотоза лимфоцитов у детей с поздним началом НС достоверной разницы между показателями этих групп детей выявлено не было [14].
Как уже было отмечено выше, результатом активации процесса апоптоза лимфоцитов является угроза истощения пула этих клеток, что может проявляться снижением в крови как лимфоцитов, так и общего количества лейкоцитов . В нашем исследовании развитие лимфопении (менее 3х109/л) отмечалось в 30% случаев (3 детей), лейкопении (менее 8х109/л) — в 10% случаев (один ребенок). При этом, наиболее высокие показатели активности апоптоза лимфоцитов были зарегистрированы именно у детей с лимфопенией Однако, достоверно значимого различия между активностью апоптоза лимфоцитов и их количеством в крови выявлено не было (Spearman R = 0,55, p = 0,12) .
Учитывая тот факт, что сепсис-индуцированный апоптоз лимфоцитов инициируется развитием воспалительной реакции организма, нами был проведен сравнительный анализ выраженности активности апоптоза лимфоцитов с содержанием в крови С-реактивного белка (СРБ), маркера воспаления с высокой специфичностью и чувствительностью Было установлено, что выраженность воспалительной реакции не влияло на активность апоптоза лимфоцитов (Spearman R = 0,48, p = 0,18) .
Активация процессов апоптоза при сепсисе в настоящее время рассматривается в качестве основной причины гибели иммунокомпетентных клеток и
формирования иммуносупрессии [9]. Традиционно считается, что формирование иммуносупрессии при сепсисе происходит во второй фазе заболевания, сопровождающегося развитием синдрома противовоспалительного ответа (СПВО) с преимущественным синтезом противовоспалительных цитокинов [17]. Начальная же стадия сепсиса, характеризующаяся формированием синдрома системного воспалительного ответа (ССВО) и синтезом провоспалительных цитокинов, ассоциируется с развитием таких клинических проявлений, как грубые микроциркуляторные расстройства, шоковая реакция, полиорганная недостаточность и т . п . [17]. Как известно, одной из причин формирования органной дисфункции является массивный некроз клеток того или иного органа, способный привести к летальному исходу Однако, морфологические исследования пациентов, погибших от сепсиса в первые сутки болезни, не всегда обнаруживают массивные некротические изменения в тканях Очевидно, что в формировании тяжелой дисфункции органов может участвовать другой механизм гибели клеток, в частности апоптоз [9]. Активация апоптоза при сепсисе может происходить как в клетках иммунной системы, так и в эпителиальных клетках пищеварительного тракта, легких, печени [4]. Усиление апоптоза эпителиальных клеток различных органов может стать причиной развития органной дисфункции. И хотя, активация апоптотических процессов и иммуносупрессия ассоциируется, прежде всего, со второй стадией сепсиса, имеются сообщения о появлении признаков ускоренного апоптоза уже в течение первых суток септического процесса [12]. И в наших работах повышение активности апоптоза лимфоцитов выявлено именно в начальной стадии сепсиса (в первые два дня от начала заболевания) [13, 14]. Кроме того, выделение двух фаз иммунного ответа при сепсисе в известном хронологическом порядке является достаточно условным, поскольку как ССВО, так и СПВО могут регистрироваться на любой стадии сепсиса — и на ранних, и на более поздних сроках заболевания . Поэтому, развитие апоптоза клеток при сепсисе на обеих стадиях заболевания представляется закономерным
В нашем исследовании у 4 из 10 детей (40%) отмечалось поражение кишечника, протекавшего в форме энтероколита . Гибель эпителиальных клеток кишечника может стать причиной нарушения целостности кишечной стенки, повышения ее проницаемости и транслокации грамотрицательной кишечной микрофлоры в кровоток В ранее проведенных исследованиях было показано развитие при сепсисе апоптоза как иммунных клеток, так и эпителия пищеварительного тракта [16].
Таблица 2. Количество и активность апоптоза лимфоцитов крови у детей с НС (Me; MKP)
Показатель Группы детей Р1-2
1. Дети с НС (n = 10) 2. Контрольная группа (n = 7)
Возраст(дней) 6 (5-8) 4 (4-8) 1,0
Количество лимфоцитов (х109/л) 3,7 (2,7-5,9) 5,8 (5,2-6,8) 1,0
Апоптоз лимфоцитов (в %) 18,1 (11,3-26,4) 7,8 (7,3-8,4) 0,0006
p — уровень значимости .
Как уже было отмечено выше, индукция апоптоза клеток при сепсисе может происходить как в результате активации Fas-, или TNF-рецепторов, так и вследствие повреждения митохондрий . Важную роль, определяющую механизм индукции апоптоза играют микроорганизмы . Так, в результате взаимодействия липополисахарида грамотрица-тельных бактерий с Fas-рецепторами индуцируется «внешний путь» активации апоптоза клеток [4]. Другая группа патогенов (Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Listeria monocytogenes), вырабатывающая поры-формирующие токсины, инициируют внутренний путь активации апоптоза [4] В нашем исследовании у всех пациентов был выделен один единственный микроорганизм — Klebsiella pneumoniae, что указывает на индукцию апоптотических процессов путем активации «рецепторов смерти» .
Активация процессов апоптоза может быть обусловлена и неинфекционными причинами, в частности состояниями, сопровождающимися гипоксией или гипероксией, а также гипо- или гиперкапнией [18]. Очевидно, что в этих случаях индукция апоптотических процессов будет осуществляться так-
ЛИТЕРАТУРА:
1. Camacho-Gonzales A ., Spearman P . W ., Stoll B . J . Neonatal infectious diseases: evaluation of neonatal sepsis . Pediatr . Clin . North . Am . 2013; 60: 367-89 .
2 . Самсыгина Г . А . О предрасполагающих факторах и факторах риска развития неонатального сепсиса и о современных подходах его лечения . Педиатрия 2012; 91 (3): 32-37 .
3 . Elmore S . Apoptosis: a review of programmed cell death . Toxicologic Pathology 2007; 35 (4): 495-516 .
4 . Da Silva F . P ., Nizet V . Cell death during sepsis: integration of disintegration in the inflammatory response to overwhelming infection Apoptosis 2009; 14: 509-21.
5 . Hacker G . The morphology of apoptosis . Cell Tissue Res . 2000; 301: 5-17 .
6 . Boomer J . S ., To К ., MD, Chang K. C . Immunosuppression in Patients Who Die of Sepsis and Multiple Organ Failure . JAMA 2011; 306(23): 2594-605 .
7 Hotchkiss R S , Tinsley К W , Swanson P E et al Sepsis-induced apoptosis causes progressive profound depletion of B and CD4+ T lymphocytes in humans . J . Immunol . 2001; 166: 6952-63 .
8 Hotchkiss R S , Tinsley К W , Swanson P E et al Depletion of dendritic cells, but not macrophages, in patients with sepsis . J . Immunol . 2002; 168: 2493-500 .
9 Hotchkiss R S , Swanson P E , Freeman B D et al Apoptotic cell death in patients with sepsis, shock, andmultiple organ dysfunction Crit. Care Med . 1999; 27: 1230-51.
же в результате повреждения митохондрий . Группу риска представляют новорожденные, родившиеся в состоянии гипоксии и асфиксии, прежде всего недоношенные дети . Повышенная активность апопто-за клеток ассоциируется с такими процессами, как бронхолегочная дисплазия, различные формы ги-поксического поражения головного мозга (внутри-желудочковые кровоизлияния, перивентрикулярная лейкомаляция), почечная недостаточность [18].
Выводы
Острый период НС клебсиеллезной этиологии протекает на фоне активации процессов апоптоза лимфоцитов периферической крови Наиболее высокие значения активности апоптоза лимфоцитов зарегистрированы у детей с лимфопенией, что имело место в 30% случаев . Основное клиническое значение усиления процессов апоптоза лимфоцитов при сепсисе заключается в снижении эффективности иммунного ответа Активация апоптоза лимфоцитов и обусловленная этим процессом иммуносупрессия является основанием для проведения больным с НС иммуностимулирующей терапии
10 Hotchkiss RS, Monneret G , Payen D Immunosuppression in sepsis: novel understanding of the disorder and a new therapeutic approach . Lancet Infect Dis . 2013; 13: 260-8 .
11. Bochud P .Y ., Calandra Th . Pathogenesis of sepsis: new concepts and implication for future treatment . BMJ 2003; 326(738): 262-5
12 . Kasten К . R ., Tschop J ., Adediran S . G . et al . T cells are potent early mediators of the host response to sepsis . Shock 2010; 34(4): 327-36
13 . Хаертынов Х. С ., Бойчук С . В . , Анохин В .А. и др . Апопотоз лимфоцитов у детей с неонатальным сепсисом . Каз . Мед . Жур . 2013; 94(5): 775-8 .
14 Хаертынов Х С , Бойчук С В , Анохин В А и др Показатели активности апоптоза лимфоцитов крови у детей с неонатальным сепсисом . Гены и клетки 2014; 9 (3): 267-71.
15 Riccardi C , Nicoletti I Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry . Nat . Protoc . 2006; 1(3): 1458-61
16 . Hotchkiss R . S ., Coopersmith C . M ., Karl I . E . Prevention of Lymphocyte Apoptosis-A Potential Treatment of Sepsis? Clin . Inf . Dis . 2005; 41: 465-9 .
17 . Hotchkiss R . S ., Karl I . E . The pathophysiology and treatment of sepsis . New Engl . J . med . 2003; 348(2): 138-50 .
18 . Hargitai B ., Szabo V ., Hajdu J . et al . Apoptosis in Various Organs of Preterm Infants: Histopathologic Study of Lung, Kidney, Liver and Brain of Ventilated Infants . Pediatr. Res . 2001; 50(1): 110-4 .
Поступила: 14.11.2015
