CC BY
192
УДК 543.54:547.973
АНТОЦИАНЫ ПЛОДОВ ШЕСТИ ВИДОВ AMELANCHIER SP.
В настоящей работе методом обращенно - фазовой ВЭЖХ со спектрофотометрическим и с масс-спектрометрическим (ESI/MS) детектированием изучен состав антоциановых комплексов 6 видов ирги выращенной в ботаническом саду БелГУ. Показано, что во всех исследованных образцах основными компонентами был цианидин-3-галактозид, в меньших количествах содержались цианидин-3-глюкозид и цианидин-3-арабинозид. Среди минорных компонентов, которые также являются производными цианидина, найден ацилиро-ванный 3-пентозид и еще одно производное неустановленного состава. Наибольшая концентрация антоцианов обнаружена в плодах ирги ольхолистной, канадской и обильноцветущей (0.250 - 0.275 г на 100 г свежих плодов), а самый наименьшая - в плодах ирги кроваво-красной (0.102 г на 100 г свежих плодов).
Ключевые слова: антоцианы, плоды, Amelanchier sp., ВЭЖХ, масс спектрометрия.
Введение
В современном урбанизированном мире огромное внимание уделяется природным антиокеидантам, источником которых являются плоды съедобных садовых и лесных растений [1], - в настоящее время доступных практически круглый год (зимой - в замороженном состоянии) и не имеющих непредсказуемых последействий для организма человека. К числу важнейших природных антиоксидантов относят антоцианы -водорастворимые соединения класса флавоноидов [2]. Основной признак присутствия большого количества антоцианов - темно-синяя (темно-красная) окраска плодов. Одним из таких растений, темноокрашенные плоды которого по литературным данным [3-6] содержат большое количество антоцианов являются плоды ирги.
Ирга, Amelanchier, - род растений подсемейства яблоневые (Maloideae) семейства розоцветные (Rosaceae), - к настоящему моменту насчитывается от 18 до 23 видов [7]. Она отличается скороплодностью, быстрым ростом, зимостойкостью, ежегодным плодоношением. Для культивирования существуют специально выведенные сорта с крупными ягодами до 15 мм и урожайностью до 15 кг ягод с куста.
По литературным данным антоциановый состав плодов ирги может быть достаточно разнообразным. Так в работе [6] методом бумажной хроматографии в гидролизате экстракта было обнаружено три агликона - пеларгонидин, цианидин и мальви-дин. Этот набор, в лучшем случае, странный, если принимать во внимание традиционные схемы биосинтеза антоцианов. Среди гликозидов были выделены 7 индивидуальных соединений вне зависимости от вида ирги (A. spicata (Lam.) C. Koch., A. alnifolia Nutt., A. oligocarpa Roem., и A. sanguinea DC.). Среди них авторы определили пеларгонидина и цианидина 3,5-диглюкозиды, 3-глюкозиды этих же антоцианидинов и цианидин-3-галактозид; гликозидный состав производных мальвидина не был установлен. Использование ВЭЖХ с масс-спектрометрией (ESI/MS) и 1Н-ЯМР [8] позволили уточнить состав комплекса антоцианов - в антоциановом комплексе плодов четырех видов рода ирга (A. alnifolia, A. arborea and A. canadensis) был найден в качестве основного антоциана цианидин-3-галактозид (155, 390 и 165 мг на 100 г свежих плодов, соответственно). В плодах видов A. alnifolia and A. canadensis обнаружили заметное (54 и 48 мг/100 г) содержание цианидин-3-глюкозида. В работе [4] к этому
Д.Н. Чулков B.M. Дейнека Л.А. Дейнека А.В. Степанова
Белгородский государственный национальный исследовательский университет, 308015 г.Белгород, ул. Победы 85.
e-mail: deineka@bsu.edu.ru
перечню добавили еще один компонент, определенный как цианидин-3-пентозид. Впрочем, в более ранней работе [9] предполагалось существование в комплексе циа-нидин-3-ксилозида в качестве минорного компонента. Хроматографическим методом, сопоставлением удерживания антоцианов различных комплексов было установлено, что основные антоцианы плодов A. ovate те же, что и в плодах других растений подсемейства яблоневые [10]: цианидин-3-галактозид, цианидин-3-глюкозид, циа-нидин-3-арабинозид и еще два не идентифицированных минорных антоциана.
В коллекции Ботанического сада БелГУ собраны и находятся в фазе плодоношения шесть видов рода Amelanchier: ирга колосистая - A. spicata (Lam.) С. Koch, ирга ольхолистная - A. alnifolia (Nutt.) Nutt ex M. Roem, ирга кроваво-красная - A. sanguinea (Pursh) DC, ирга гладкая - A. laevis Weigand, ирга канадская - A. canadensis (L.) Medik и ирга обильно цветущая - A. florida Lindl. Настоящая работа посвящена исследованию ценности плодов этих растений как источников антоцианов.
Экспериментальная часть
Плоды ирги были собраны в ботаническом саду БелГу в конце июня 2011 года. Антоцианы из плодов экстрагировали 0.1 М водным раствором соляной кислоты. Содержание антоцианов в плодах определяли спектрофотометрически на приборе СФ-56 при длине волны 510 нм с пересчетом на цианидин-3-глюкрозид с использованием литературного коэффициента экстинции [11].
Для идентификации антоцианов ирги в работе использован метод высокоэффективной жидкостной хроматографии в обращенно-фазовом варианте с с диодноматричным и масс-спектрометрическим детекторами (оборудование марки Agilent 1200 Infinity). В качестве подвижной фазы использовали смеси системы «ацетонитрил : муравьиная кислота : вода». Детектирование веществ проводили при длине волны 510 нм. Спектры индивидуальных компонентов записывали в ячейке диодноматричного детектора в диапазоне длин волн 420-600 нм. Разделение компонентов проводили на хроматографической колонке Symmetry® С18 4.6x250 мм с термоста-тированием при 40°С. Скорость подвижной фазы составляла 1 мл/мин. Перед хроматографированием соляно кислые образцы антоциановых пигментов были очищены на концентрирующих патронах ДИАПАК заполненных С18 сорбентом.
Масс-спектры записывали на квадрупольном масс спектрометре Agilent 6130 LC/MS в режиме ESI (ионизация распылением в электрическом поле) с позитивным режимом сканирования в диапазоне масс 250-1200. Напряжение на фрагментаторе -200 В. Ток на короне составлял 4 мкА. Давление газа-распылителя 2 бар, скорость газа осушителя 10 л/мин, температура газа осушителя 350°С, температура испарителя 250 °С.
Результаты и обсуждения
Антоциановый комплекс плодов всех исследованных видов ирги оказался практически одинаков в качественном отношении, с небольшими различиями в количественном соотношении между основными антоцианами. Типичная хроматограмма экстракта ирги представлена на рис.1.
По спектральным данным (вследствие практически полного совпадения в нормализованном виде) все пики №1 - №5 на рис.1. принадлежат 3-моногликозидам цианидина, рис.2. Т.е. в исследованных образцах нет 3,5-диглюкозидов и нет производных ни пеларгонидина, ни других (кроме цианидина) антоцианидинов. Только при большой перегрузке колонки удается по характерному гипсохромному смещению максимума абсорбции обнаружить следы производных пеларгонидина (в диапазоне времен удерживания 7.7 Л 7.9 мин и 9.1 л 9.2 мин).
rriU . Ю00
1400
ШЭ
Ю00
Взэ
а»
400 -
200
I 2
4 5
ю
l2 nn
l
з
в
А
б
В
2
4
Рис.1. Хроматограммы исследуемых образцов ирги А - ирга ольхолистная, В - ирга кроваво-красная
Рис. 2. Спектры компонентов антоцианов ирги
Используя совпадение удерживания антоцианов в нескольких составах подвижной фазы по методу относительного анализа удерживания [l2] можно высказать предположение о составе антоцианов пиков №l-№3, рис.з.
Это - последовательно элюирующиеся цианидина-3-галактозид (Cy-3-Gala), цианидина-3-глюкозид (Cy-3-Glu) и цианидина-3-арабинозид (Cy-3-Ara) - три из пятнадцати компонентов антоцианового комплекса плодов черники [із]. Для двух оставшихся антоцианов (пики №4 и №5) тангенсы углов прямолинейных зависимостей относительного удерживания антоцианов (l.003 и l.032, соответственно) соответствуют моногликозидам цианидина [l4].
Для подтверждения состава антоцианов в работе был использован масс-спектрометрический метод с ионизацией распылением в электрическом поле (ESI/MS). Однако на спектрах, как правило, кроме пика основного молекулярного иона могут существовать и продукты фрагментации, поэтому использование этой характеристики в ряде случаев не может дать окончательный ответ на состав веществ, если учесть, что возможны многочисленные инверсии удерживания аналитов, а сле-
НАУЧНЫЕ ВЕДОМОСТИ -.......-, | Серия Естественные науки. 2011. № 9 (104). Выпуск 15/2 212
довательно, и совпадения времен удерживания нескольких компонентов. Но по существованию на всех спектрах, рис.4, иона с отношением М^ = 287 можно подтвердить цианидиновую основу всех основных антоцианов комплекса. Для пиков №1 и №2 получены одинаковые спектры, что подтверждает их цианидин-гексозидную природу (М^ = 449). Для пика №3 М^ = 419 подтверждает его принадлежность к цианидин-3-арабинозиду.
Рис. 3. Карта хроматографического разделения антоцианов ирги относительно цианидин-3-глюкозида
- р
75 І Cy-3-Gala
50-Е :■ : - Cy-3-Glu
254 < J . 1
0- . L .
I 200 г 1 -г ■■ 1 400 • і 1 600 БО а т/г
еэ- 43- Cy-3-Ara
23 - о ¥
0 -І —
200 400 еоо S3 И т/г
15-: : с
Юг С №4
5- : : с N
0- . . . . 1.
200
400
€-00
B0Q т/г
Рис 4. Масс-спектры антоцианов в режиме ESI/MS
Относительно антоцианов, соответствующих пикам №4 и №5, можно отметить то, что они действительно являются производными цианидина. Это следовало из ана-
лиза спектров в видимой области электромагнитного излучения и подтверждается тем, что основным ионом для них является ион незамещенного цианидина с M/z = 287. Но в случае пика №4 обнаруживается сигнал с отношением M/z, равным 477, что соответствует ацилированному уксусной кислотой пентозиду цианидина. В то время как для пика №5 достоверно обнаружить фрагменты размером больше неацилированно-го цианидина не удается.
Как отмечалось выше, биологическая активность и польза для организма многих плодов связана не только с такими нутриентами, как углеводы, белки, витамины, микроэлементы и пр., но и с антиоксидантной активностью накапливаемых в них соединений. Из них на особом счету находятся антоцианы, как высоко активные водорастворимые антиоксиданты, поэтому концентрация этих веществ принципиально важна для составления сбалансированной диеты в современном обществе. В этом отношении весьма темные плоды ирги представляют несомненный интерес. По литературным данным концентрация антоцианов в плодах различных видов ирги не одинакова. В работе [3] при исследовании плодов 16 сортов A. alnifolia Nutt. (очень популярного в Канаде растения) в сезонах 1998-2000 годов было установлено, что уровень накопления антоцианов варьировал от 414 мкг на 1 г для сорта «Forestburg» до 852 мкг на 1 г для сорта «Nelson». Это ставит плоды ирги в ряд наиболее богатых антоцианами плодов. Перед определением антоцианов плоды хранили в замороженном при -40оС состоянии в пластиковых контейнерах и сведения о степени вымораживания воды из плодов при этом, к сожалению, не приводятся. Для экстракции плоды (20 г) гомогенизировали в блендере с метанольным раствором (0.1%) НС1 (50 мл), оставляли смесь на ночь, фильтровали через фильтровальную бумагу и остаток экстрагировали 200 мл того же экстрагента.
Заметно более скромные, но согласующиеся с ранее опубликованными данными, получены в другой работе канадских исследователей [4]. Они установили, что накопление антоцианов увеличивается по мере созревания (контролируемого по интенсивности окраски) и растет от 26.7 (для вишневой окраски плодов) до 136.8 мг на 100 г для плодов A. alnifolia Nutt. сорта «Smoky», причем в пересчете на сухую массу. К сожалению, в работе не приводятся экспериментальные условия, а дается ссылка на другую статью, в которой плоды не хранят в замороженном состоянии и для экстракции используют сложную смесь, содержащую ацетон, который по нашим данным разрушает антоцианы.
Довольно умеренные результаты по накоплению антоцианов в плодах двух сортов A. alnifolia приводят и чилийские исследователи [15], но удивительно то, что в экспериментальной части говорится о том, что расчет приводится в мг на 100 г свежих плодов, а в реферате и в таблицах накопление антоцианов приводят 100 г плодов заменяется одним литром (?): 196.7 мг (для сорта «Honeywood») и 213.6 мг (для сорта «Martin»).
В исследованиях, выполненных в России (Рязанская область) [5], в плодах ирги обыкновенной Amelanchier ovalis Medik, найдено от 4 до 5 % антоцианов в пересчете на сухой остаток. Результаты спектрофотометрического определения суммы ан-тоцианов (в пересчете на цианидин-3-глюкозид) в плодах шести видов ирги, выращенный в 2011 году, представлены в таблице.
Таблица
Сумма антоцианов в плодах ирги_____________________________
Вид ирги Содержание, г/100 г свежих плодов
A. spicata (Lam.) С. Koch (№1) 0.199
A. spicata (Lam.) С. Koch (№2) 0.129
A. alnifolia (Nutt.) Nutt. Ex M.Roem (№1) 0.276
A. alnifolia (Nutt.) Nutt. Ex M.Roem (№2) 0.273
A. sanguinea (Pursh) DC 0.102
A. laevis Weigand 0.126
A. canadensis (L.) Medik 0.255
A. floribunda Lindl 0.249
Как следует из представленных данных, наибольшая концентрация антоциа-нов обнаружена в плодах ирги ольхолистной, канадской и обильноцветущей (0.250 -0.275 г на 100 свежих плодов), а самый маленький уровень накопления этих антиоксидантов найден в плодах ирги кроваво-красной (0.102 г на 100 г свежих плодов). При массовой доле сухих веществ порядка 20%, максимальное содержание антоциа-нов окажется немногим выше 1 % от сухого остатка.
Заключение
Плоды ирги могут рассматриваться как ценный функциональный продукт, богатый природными антиоксидантами - антоцианами. Их накопление в плодах ирги некоторых видов (A. alnifolia (Nutt.) Nutt. Ex M.Roem, A. canadensis (L.) Medik и A. floribunda Lindl) сопоставимо с уровнем этого параметра в плодах черной смородины, хотя в черной смородине антоцианы сконцентрированы только в кожуре, а в плодах игри они равномерно распределены по всему объему.
Список литературы
1. Handbook of Antioxidants. Ed. Enrique Cadenas, Lester Packer. LLC Marcel Dekker, Taylor & Francis Group, New York, Basel, 2002. - 602 р.
2. Flavonoids Chemistry, Biochemistry and Applications Ed. 0yvind M. Andersen, Kenneth R. Markham, CRC Press, Taylor and Francis Group. 2006 - 1212 p.
3. Zatylny A.M., Ziehl W.D., St-Pierre R.G. Physicochemical properties of fruit of 16 saskatoon (Amelanchier alnifolia Nutt.) cultivars // Сат J. Plant Sci. - 2005. - V.85. - P. 933-938.
4. Ozga J.A., Saeed A., Reinecke D.M. Anthocyanins and nutrient components of Saskatoon fruits (Amelanchier alnifolia Nutt.) // Can. J. Plant Sci. - 2006. - V.86. - P. 193-197.
5. Макарова В.Г., Лаксаева Е.А., Мартынов Е.Г. Влияние микроэлементов на накопление некоторых БАВ в плодах ирги обыкновенной // Росс. Мед.-биол. Вестник. - 2006. - №3. -С. 29-35.
6. Вересковский В.В., Шапиро Д.К., Нарижная Т.И. Антоцианы плодов различных видов рода Amelanchier Medic. // Химия Прир. Соедин. - 1982. - №4. - С. 522-523.
7. Куклина А.Г. Натурализация североамериканских видов ирги (Amelanchier Medik.) во вторичном ареале // Росс. Ж. Биол. Инвазий. - 2011. - №1. - С. 52-59.
8. Adhikari D.P., Francis J.A., Schutzki R.E., Chandra A., Nair M.G. Quantification and characterisation of cyclo-oxygenase and lipid peroxidation inhibitory anthocyanins in fruits of Amelanchier // Phytochem. Anal. - 2005. - V.16. - P. 175-180.
9. Mazza G. Anthocyanins and other phenolics of saskatoon beries Amelanchier alnifolia Nutt. // J. Food Sci. - 1986. - V.51. - P. 1260-1264.
10. Дейнека В.И., Григорьев А.М., Дейнека Л.А., Ермаков А.М., Сиротин А.А., Староверов В.М. Анализ компонентного состава антоцианов плодов и жирных кислот масел семян некоторых видов семейства Rosaceae методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Растительные ресурсы. - 2005. - Вып.1. - С. 91 -98.
11. Giusti M.M, Ronald E. Wrolstad R.E. Characterization and Measurement of Anthocyanins by UV-Visible Spectroscopy // Current Protocols in Food Analytical Chemistry (2001) F1.2.1-F1.2.13.
12. Дейнека В.И. Карта хроматографического разделения и инкрементные зависимости в методе относительного анализа удерживания в ВЭЖХ //Ж. физ. химии. - 2006. - T.80, №3. - С. 511-516.
13. Дейнека В.И., Григорьев А.М., Дейнека Л.А., Шапошник Е.И., Староверов В.М. Исследование антоцианов черники в плодах и препаратах на ее основе. / / Зав. лаб. - 2006. - №3. - С. 16-20.
14. Дейнека В.И., Григорьев А.М. Относительный анализ удерживания гликозидов цианидина // Ж. физ. химии. - 2004. - T.78, №5. - С.923-926.
15. Guerrero J.C., Ciampi L.P., Castilla A.C., Medel F.S., Schalchli H.S., Hormazabal E.H., Bensch E.T., Alberdi M.L. Antioxidant capacity, anthocyanins, and total phenols of wild and cultivated berries in Chile // Chilean J. Agric. Res. - 2010. - V.70. - P. 537-544.
ANTHOCYANINS OF SIX SPECIES AMELANCHIER FRUITS
A.N. Chulkov V.I. Deineka LA. Deineka A.V. Stepanova
Belgorod National Research University, 308015Belgorod, Pobeda str. 85
e-mail: deineka@bsu.edu.ru
In the paper the composition of six species of Amelanchier fruit harvested in BSU Botanical Garden anthocyanin complex has been investigated by means of HPLC with diod-array and ESI/MS detectors. The main component of the complexes was cyanindine-3-galactoside, while the concentration of cyanidine 3-glucoside as well as that of cyanidine-3-arabinoside wae somewhat lower. Two anothe cyanidine derivative were detected also one of them being acylated with acetic acid з-pentoside. The higest anthocyanin accumulation was foun for fruits of A. alnifolia, A. canadensis and A. floribunda (0.250 - 0.275 g per loo g of fresh fruits), a lowest of was found in fruits ofA. sanguinea (0.l02 g/l00 g).
Key words: anthocyanins, fruits, Amelanchier sp., HPLC, ESI/MS
