CC BY
260
543.42
АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ АНТОЦИАНОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ВИНОГРАДНОГО ВИНА
Т.Г. ЦЮПКО, H.A. НИКОЛАЕВА, О.Б. ВОРОНОВА, Д.А. ЧУПРЫНИНА
Кубанский государственный университет,
350040, г. Краснодар, ул. Ставропольская, 149; факс: (861) 219-95-71, электронная почта: tsypko@kubsu.ru
Модифицирована методика сорбционного выделения суммы антоцианов из виноматериалов. Изучены изменения хроматических характеристик и антиоксидантной активности (АОА) выделенного препарата в зависимости от величины pH. Определен вклад антоцианов в АОА сухого красного вина Каберне, при естественном значении рН вина он составляет около 34%.
Ключевые слова: антоцианы, антиоксидантная активность, вино.
Антоцианы в сухом красном вине в основном присутствуют в виде 3-гликозидов антоцианидинов - мо-ногликозидов мальвидина, петунидина, пеонидина, дельфинидина, цианидина и их эфирных форм. Антоцианы могут взаимодействовать с другими компонентами вина, изменяя его свойства. В частности, они образуют с танинами интенсивно окрашенные комплексные соединения, т. е. танины являются копигментами антоцианов [1].
Качественный и количественный состав смеси антоцианов, присутствующих в вине, а также их суммарное содержание зависят от множества факторов, характеризующих сорт винограда, накопление антоцианов в ягоде и технологию получения вина. Изменение рН приводит к переходам антоцианов в новые формы, отличающиеся структурой соответствующих молекул. Такие переходы влияют на хроматические характеристики вина и, возможно, на его антиоксидантные свойства. Однако взаимосвязь антиоксидантной активности (АОА) компонентов вина, в том числе антоцианов, и кислотности вина практически не изучена. Неизвестен и вклад антоцианов в общую АОА виноматериалов.
Мы исследовали эти характеристики антоцианов на примере сухого виноматериала из винограда сорта Каберне. Сумму антоцианов селективно выделяли сорбционным методом [2], используя их способность адсорбироваться на тальке. О составе и свойствах выделенной смеси антоцианов судили по цветовым характеристикам препарата [3], измеряя их при разных рН. Антиоксидантную активность исходного виноматериала и выделенных из него препаратов определяли спектрофотометрическим методом [4], используя индикаторную систему Ре(Ш)/Ре(П)-о-фенантролин. Сопоставление значений АОА исследуемого виноматериала и полученного из него препарата антоцианов позволило оценить вклад антоцианов в общую АОА исходного ви-номатериала. Эта схема в дальнейшем может быть применена для изучения других красных сухих вин.
При выделении суммы антоцианов образцы вина подвергали деалкоголизации и упариванию. Затем отбирали аликвоту полученного раствора (10 см3) и последовательно обрабатывали ее тремя порциями таль-
капо 3 г в течение 10 мин, как описано в работе [2]. После отделения каждой порции талька от исследуемого раствора и их объединения сорбент промывали дистиллированной водой. При этом с его поверхности удаляются частично адсорбированные танины. Присутствие танинов в промывных водах контролировали с помощью ванилинового реактива, продолжая промывку вплоть до отрицательной реакции на танины. Затем адсорбированные на тальке антоцианы элюировали 50%-м этиловым спиртом, подкисленным до рН 1,2. Полученный водно-спиртовый раствор (препарат) антоцианов использовали в дальнейших исследованиях. Суммарное содержание антоцианов в препарате, определенное спектрофотометрическим методом, составляло около 11 мг/дм3.
Оптическую плотность образцов вина или препарата антоцианов измеряли на спектрофотометре КФК-3 при 420, 520 и 620 нм в кювете с толщиной слоя 1,0 см. Показатели интенсивности I и оттенка N рассчитывали по формулам [3]:
I = А420 + А520 + А620; N = А420/А520.
Для определения АОА к аликвоте (0,2-0,5 см3) исследуемого раствора (разбавленный виноматериал или препарат антоцианов) прибавляли 1,0 см3 раствора, содержащего Fe(III) и о-фенантролин, а также дистиллированную воду до общего объема 100 см3. Концентрации реагентов в конечном разбавлении составляли 0,12 и 0,20 ммоль/дм3 соответственно. После 60-минутной экспозиции при 25°С оптическую плотность полученного окрашенного раствора фенантролината железа (II) измеряли при 490 нм. Показатель АОА рассчитывали по градуировочному графику, построенному по растворам вещества-стандарта - аскорбиновой кислоты, как описано в работе [4]. Результаты измерений выражали в миллимолях аскорбиновой кислоты на 1 дм3 препарата или виноматериала.
Сложный состав смеси антоцианов и возможность существования каждого из них в разных формах, отличающихся по протонированности и структуре молекулы [5], затрудняет выделение и изучение свойств антоцианов, может приводить к потерям и химическим пре-
вращениям антоцианов в ходе их извлечения. Это следует учитывать при выборе способа выделения антоцианов и разработке соответствующей методики.
Известен ряд способов селективного выделения антоцианов из виноградной ягоды и вина в присутствии других фенольных соединений. Так, антоцианы можно селективно экстрагировать этилацетатом при рН 2,0, тогда как катехины и флавоноиды экстрагируются при рН 7,0 [6]. Антоцианы извлекают из вин и методом сорбции (твердофазной экстракции). В частности, в качестве сорбента нередко применяют глины. Однако при использовании этого сорбента не удается извлечь антоцианы, находящиеся в форме псевдооснований [7]. Предложен способ разделения антоцианов, фенольных кислот, катехинов и флавонолов, основанный на их разной полярности, на практике этот метод применяют наиболее часто. Перечисленные фенольные соединения предварительно выделяют на патроне С18, а затем поочередно элюируют вещества разных классов растворителями разной полярности [8].
В виноделии известен метод селективного извлечения антоцианов, основанный на их способности адсорбироваться на тальке, с последующим элюированием антоцианов [2]. Тальк относится к слоистым сорбентам с жесткой структурой. Активная поверхность талька обусловлена вторичной структурой, а пористость -зазорами между контактирущими частицами. Невысокая сорбционная емкость талька сочетается с высокой степенью десорбции антоцианов. Если адсорбированные на тальке антоцианы элюировать цитратным буферным раствором, потери могут достигать 15% [9]. На основе анализа литературных данных для извлечения антоцианов из виноматериала мы выбрали методику, описанную в работе [2], но модифицировали ее, стремясь к минимальным потерям антоцианов и переводу этих соединений в более устойчивую форму, доминирующую в слабокислых растворах. Основная часть антоцианов сорбировалась в ходе первой обработки пробы тальком, а 3-кратная обработка виномате-риала и последующая десорбция антоцианов подкисленным до рН 1,2 50%-м раствором этанола в воде снижает потери до пренебрежимо малых величин.
Следовало проверить, не происходят ли в ходе сорбционного извлечения и последующей десорбции антоцианов необратимые изменения их состава и свойств. Для этого определяли хроматические характеристики выделенного препарата экспресс-методом, как это принято для вин [3]. Предварительно препарат разбавляли дистиллированной водой и устанавливали необходимые значения рН в интервале 2,0-10,0 с шагом 1,0. Установлено, что зависимости показателя интенсивности от величины рН (в интервале от 3,0 до 10,0) для исходного виноматериала и для выделенного препарата антоцианов однотипны (табл. 1). Однотипными были и зависимости показателя оттенка N от рН. Это свидетельствует о сохранении свойств, а следовательно, о сохранении состава смеси антоцианов в ходе ее выделения из виноматериала.
Известно, что структуры основных антоцианов вина отличаются количеством ОН-групп в кольце В, которые участвуют в окислительно-восстановительных
Таблица 1
рН I
Препарат Виноматериал
3,0 0,68 10,8
4,0 0,67 11,0
5,0 1,06 11,4
6,0 1,04 11,8
7,0 1,24 13,0
9,0 1,42 15,8
10,0 1,57 16,2
реакциях и обусловливают антиоксидантные свойства этих антоцианов (табл. 2).
Таблица 2
Антоцианы Количество ОН-групп
в кольце В общее
Н О /00Н3 .^,0^ (/ ~Ч-0Н Т "Г \=£ 1 3
Мальвидин- 3-гликозид оснз он б) форма при pH 6-7 /00Н3 Н0^о^> кА.А ^0СНз - 2
Пеонидин-
3-гликозид
Петунидин-
3-гликозид
Цианидин-
3-гликозид
Дельфини-
дин-3-гли-
козид
Для единичного антоциана изменение pH раствора всегда приводит к изменению формы его существования в растворе, что, в свою очередь, может изменить его активность как восстановителя. Основным анто-цианом красных вин является мальвидин-3-гликозид, который в водной фазе находится в виде смеси четырех форм, различающихся по протонированности, заряду и спектру поглощения соответствующих молекул (рис. 1) [5].
Доли разных форм зависят от рН. При рН 1-3 преобладает флавильный катион красного цвета, при рН 4-5 - бесцветное метанольное псевдооснование, при рН 6-7 - сине-пурпурное хиноидное основание, которое может переходить в халкон желтого цвета при длительном выдерживании при рН 7-8 [5]. Аналогичные обратимые или необратимые структурные переходы характерны и для других антоцианов. Этими переходами объясняется изменение хроматических характеристик вина (или препарата антоцианов) при изменении
1
3
2
4
2
4
3
5
Рис. 1
рН раствора. Те же переходы могут влиять на величину АОА антоцианов. Так, увеличение рН вина от естественного значения, порядка 3,2-3,8, до рН 7 приводит к переходу мальвидин-3-гликозида в форму с хиноидной структурой без ОН-группы в кольце В. Такой переход должен снижать АОА мальвидина. Для суммы разных антоцианов прогнозировать изменение АОА при изменении рН гораздо труднее.
Определить показатель АОА при разных рН можно лишь экспериментальным путем, устанавливая необходимое значение рН добавкой небольших количеств щелочи или кислоты. При этом следует учесть, что сама методика измерения АОА [4], как и другие методики измерения этого интегрального показателя, весьма чувствительна к колебаниям рН. Максимальная величина аналитического сигнала любого антиоксиданта достигается при рН 3,6, а при подкислении и подщела-чивании исследуемого раствора сигнал снижается за счет побочных реакций с участием ионов железа (III) [10]. Таким образом, изменение рН не только влияет на восстановительные свойства антоцианов, но и меняет чувствительность их детектирования. Для исключения влияния второго фактора АОА антоцианов следует измерять при постоянной величине рН, обеспечивающей постоянную (максимальную) чувствительность измерений. Это требование существенно затрудняет изучение влияния рН на активность антоцианов, как и других антиоксидантов.
Для решения этой задачи мы готовили из ранее выделенного препарата разбавленные водные растворы с одинаковым содержанием антоцианов, но разными значениями рН - в диапазоне 2,0-10,0, выдерживали их в течение 1 ч, а затем добавляли небольшие аликвоты полученных растворов к индикаторным системам, содержащим Fe (III) и о-фенантролин. Так как компоненты индикаторной системы содержались в большом избытке, величина рН реакционной смеси определялась именно этими компонентами и практически не зависела от кислотности исследуемых растворов. В слу-
Рис. 2
чае необходимости непосредственно перед измерением АОА проводили корректировку рН исследуемых растворов, добиваясь установления рН реакционной смеси на уровне 3,6 единиц.
После проведения фотометрической реакции измеряли оптическую плотность образовавшегося фенан-тролината железа (II), прямо пропорциональную суммарному содержанию антиоксидантов (антоцианов). Зависимость величины АОА исследуемых растворов антоцианов от рН представлена на рис. 2 (кривая 1). Видно, что в интервале рН от 3,0 до 6,0 АОА антоцианов практически не меняется, поскольку доминирующие в этих условиях структуры антоцианов являются равновесными, т. е. независимо от значения рН исследуемого раствора в ходе измерения АОА антоцианы находились в формах, характерных для рН 3,6. Однако в тех случаях, когда препарат антоцианов заранее выдерживали в течение 1 ч при рН 9-10, измеренная при рН 3,6 активность достоверно снижалась. Вероятной причиной обнаруженного эффекта являются необратимые изменения молекул антоцианов, которые происходят в щелочной среде и инициируются ионизацией фенольных гидроксилов [11].
Аналогичная зависимость АОА от рН наблюдалась и для проб исходного виноматериала, которые некоторое время выдерживали при разных значениях рН (рис. 2, кривая 2). Однотипность изменения АОА при изменении рН виноматериала и препарата антоцианов подтверждает ранее установленный с помощью хроматических характеристик факт отсутствия побочных реакций, меняющих состав смесей антоцианов в ходе их сорбционного выделения на тальке и десорбции вод-но-этанольным раствором.
Как видно из рис. 2, при естественной кислотности красных сухих вин (рН 3,2—3,8) АОА антоцианов не зависит от рН, что соответствует данным [9]. Сопоставление величин АОА виноматериала и препарата антоцианов при одном и том же значении рН 3,6 позволило оценить вклад антоцианов в суммарный показатель АОА исследуемого виноматериала. По нашим данным, этот вклад составляет (34 ± 5)%.
ВЫВОДЫ
1. Модифицированная методика сорбционного извлечения суммы антоцианов из виноматериалов с помощью талька пригодна для количественного опреде-
ления суммарного содержания антоцианов и может быть рекомендована для практического применения в исследовательских и контрольно-аналитических лабораториях. Сорбционное выделение не приводит к побочным процессам, меняющим кислотно-основные или антиоксидантные свойства антоцианов.
2. В интервале значений рН, характерных для красных сухих вин, АОА антоцианов практически не зависит от величины рН.
3. Вклад антоцианов в суммарную АОА сухого виноматериала из винограда сорта Каберне составляет около 34%. Разработанная методика оценки вклада ан-тоцианов может быть использована и для других вино-материалов.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ-юг, проект 09-03-96529.
ЛИТЕРАТУРА
1. Кишковский З.Н. Химия вина. - М.: Пищевая пром-сть, 1976. - 311 с.
2. Валуйко Г.Г. Биохимия и технология красных вин. -М.: Пищевая пром-сть, 1973. - 296 с.
3. Сборник международных методов анализа и оценки вин и сусел / Под ред. Н.А. Мехузла. - М.: Пищевая пром-сть, 1993. -326 с.
4. Определение антиоксидантной активности ряда пищевых продуктов с использованием индикаторной системы Ре(Ш)/Ре(П)-органический реагент / З.А. Темердашев, Т.Г. Цюпко, О.Б. Воронова и др. // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. - 2006. - 72. - № 11. - С. 15-19.
5. pH-dependent forms of red wine anthocyanins as
antioxidants / T. Lapidot, S. Harel, B. Akiri et al. // J. Agric. Food Chem. -1999. - Vol. 47. - P. 67-70.
6. Ghiselli A., Nardini M., Baldi A., Scaccini C. Antioxidant activity of different phenolic fractions separated from an Italian red wine // J. Agric. Food Chem. - 1998. - Vol. 46, № 2. - P. 361-367.
7. Stancovic S., Jovic S., Zivkovic J. Bentonite and gelatine impact on the yong red wine coloured matter // Food Tecnol. Biotechnol. - 2004. - V. 42 (3). - P. 183-188.
8. Brenneman C.A., Ebeler S.E. Chromatographic
separations using solid-phase extraction cartridges: separation of wine phenolics // Jour. of Chemical Education. - 1999. - Vol. 76. - № 12. -P. 1710-1711.
9. Бежуашвили М.Г., Чхартишвили Э.Р., Бостогана-
швили М.В., Малания М.А. Антиоксидантная активность антоцианов виноматериала «Саперави»: влияние рН на нее в опытах in vitro // Виноделие и виноградарство. - 2005. - № 4. - С. 20-21.
10. Определение суммарного содержания антиоксидантов методом FRAP / Т.Г. Цюпко, И.С. Петракова, Н.С. Бриленок и др. // Аналитика и контроль. - 2011. - 15. - № 3. - C. 1-12.
11. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений. Т. 2. - М.: Мир, 1986. - 250 с.
Поступила 11.08.11 г.
ANTIOXIDANT ACTIVITY OF ANTHOCYANINS ISOLATED FROM GRAPE WINE
T.G. TSYUPKO, N.A. NIKOLAEVA, O.B. VORONOVA, D.A. CHUPRININA
Kuban State University,
149, Stavropolskaya st., Krasnodar, 350040; fax: (861) 219-95-71, e-mail: tsypko@kubsu.ru
The procedure of sorption isolation of anthocianins from wines is modified. pH-dependent changes of chromatic characteristics and antioxidant activity (AOA) of isolated fraction are investigated. The contribution of anthocianins to the total AOA of red dry Cabernet wine (for natural pH value) is determined, it is about 34%.
Key words: anthocyanins, antioxidant activity, wine.
663.241
ДИНАМИКА ИЗМЕНЕНИЯ ОТНОШЕНИЙ КОНЦЕНТРАЦИЙ ХАРАКТЕРИСТИЧЕСКИХ ЛЕГКОЛЕТУЧИХ КОМПОНЕНТОВ КОНЬЯЧНОЙ ПРОДУКЦИИ
И.В. ОСЕЛЕДЦЕВА1, Т.И. ГУГУЧКИНА2, Е.В. КУШНЕРЕВА2
1 Кубанский государственный технологический университет,
350072, г. Краснодар, ул. Московская, 2; факс: (861) 255-79-97, электронная почта: sam@kubstu.ru 2 Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский институт садоводства и виноградарства Россельхозакадемии, 350901, г. Краснодар, ул. 40 Лет Победы, 39; факс: (861) 257-57-04, электронная почта: guguchkina@mail.ru
Установлена степень взаимосвязей между концентрациями отдельных характеристических легколетучих компонентов коньячной продукции. Представлены типичные интервалы и динамика изменения значений отношений этилаце-тат/изоамилацетат и изоамилол/изобутанол в коньячных дистиллятах, этилацетат/метилацетат, изоамилол/изобутанол и изобутанол/1-бутанол в коньяках российских производителей в зависимости от возраста (категории) и хозяйства-изготовителя. Полученные данные могут использоваться для идентификации коньячной продукции.
Ключевые слова: легколетучие компоненты, коньяк, коньячный дистиллят, отношения концентраций компонентов, идентификация коньяка.
Проведенные комплексные исследования по уста- нологическим циклом, позволили сформировать обновлению химического состава коньячных спиртов и ширный банк датьк. В ртзупьгаге стагасттетеот °б-
коньяков разных сроков выдержки и категорий, выра- работки полученных данных были установлены основ-
батываемых в различных хозяйствах РФ с полным тех- ные критериальные легколетучие и экстрактивные
