CC BY
44
Антимикробная активность тромбодефенсинов разных видов животных
М.В. Сычёва, к.биол.н, завлабораторией, Е.В. Шейда, аспирантка, О.Л. Карташова, д.биол.н., профессор, А.П. Жуков, д.биол.н., профессор, Оренбургский ГАУ
Катионные антимикробные пептиды (КАМП) и белки являются составляющей молекулярного механизма врождённого иммунитета животных [1]. Обладая антимикробной активностью, эти соединения характеризуются относительно низкой токсичностью по отношению к собственным клеткам макроорганизма, что в перспективе делает их альтернативой конвенциальным (общепринятым) антибиотикам микробного происхождения, к которым у бактерий очень быстро формируется резистентность.
В настоящее время описано более 900 индивидуальных антимикробных пептидов и белков, принадлежащих к разным гомологическим семействам [2]. Относящиеся к дефенсинам антимикробные пептиды, выделенные из тромбоцитов животных и человека, обладают не только выраженной антимикробной, но и иммуномодулирующей и цитолитической активностями [3, 4]. Они способны влиять на течение фагоцитарного и воспалительных процессов [5]. Вместе с тем имеются лишь единичные, порой противоречивые сведения о наличии тромбодефенсинов у сельскохозяйственных животных.
Всё вышеописанное и предопределило цель настоящего исследования: выделение катионных белков из тромбоцитов разных видов сельскохозяйственных животных и изучение их антимикробной активности.
Материалы и методы. Тромбоциты мы получали из цитратной крови клинически здоровых
кур-несушек, лошадей, свиней, коз и собак. Обогащенную тромбоцитами плазму отделяли центрифугированием при 250 g в течение 30 минут. Супернатант снова центрифугировали при 1000 g 30 минут. Осаждённые тромбоциты отмывали трижды средой 199 (с добавлением 3,8%-ного цитрата натрия в соотношении 1:10). Тромбоцитарную массу ресуспендировали в 10%-ной уксусной кислоте в соотношении 1:10 и инкубировали при -15°С в течение 24 часов. После дефростации полученный экстракт центрифугировали при 1000 g в течение 40 минут. Супернатант использовали для определения антимикробной активности.
Антимикробные свойства кислоторастворимых белков тромбоцитов оценивали in vitro в отношении грамположительного микроорганизма Bacillus subtilis. Суточную агаровую культуру В. subtilis смывали физиологическим раствором, содержащим 0,1%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина, и готовили микробную взвесь с оптической плотностью 0,270 при длине волны 650 нм. Суспензию В. subtilis разбавляли в соотношении 1:1000 физиологическим раствором с альбумином. Перед работой рН кислотного экстракта тромбоцитов доводили 0,1%-ным раствором аммиака до 5,5—5,8.
Стерильно в изотоническом растворе хлорида натрия готовили разведения тромбоцитарного катионного белка (ТКБ): 0; 1/2; 1/4; 1/8; 1/16; 1/ 32. К 0,1 мл взвеси тестируемого штамма микроорганизма добавляли 0,9 мл разведения антимикробного препарата (в контрольные пробы вместо исследуемого препарата добавляли 0,9 мл изотонического раствора хлорида натрия). По-
Антимикробное действие ТКБ сельскохозяйственных животных
т
ч
лученную смесь инкубировали при 37 °С в течение 1 часа, после чего высевали по 0,2 мл на питательный агар и инкубировали 24 часа при
37 °С.
После инкубации подсчитывали количество выросших колоний на опытных и контрольных чашках. За минимальную бактерицидную концентрацию антимикробного препарата принимали концентрацию, подавляющую рост 50% колоний бактерий по сравнению с контролем.
Полученные результаты. Получив тромбо-цитарный катионный белок у разных видов животных, мы предприняли попытку изучить в эксперименте антимикробное действие этого вещества в отношении В. .ъыЬИШ как наиболее чувствительной культуры. Результаты оценки влияния ТКБ, выделенного из тромбоцитов разных видов животных, на рост В. .ъыЬИШ представлены в таблице.
Нативный препарат тромбоцитарного катионного белка, полученный от кур, полностью подавлял рост В. .ъыЬИШ, от лошадей — 99,2% КОЕ, от коз — 74,1% КОЕ, от свиньи — 99,7% КОЕ, полученный от собак — 83% КОЕ. Количество выживших микроорганизмов при обработке кислотным экстрактом тромбоцитов, полученным от разных видов животных, изменялось в широких пределах — от 1 КОЕ у свиньи до 141 КОЕ у коз. При разведении ТКБ 1/2 зафиксирован рост 33 КОЕ В. зыЫШ.? после инкубации с белком, выделенным у кур, 59 КОЕ — у лошадей, 208 КОЕ — у коз, 14 КОЕ — у свиньи и 195 КОЕ у собак.
Следует отметить, что при разведении препарата 1/4 антимикробное действие белка, выделенного из тромбоцитов кур и лошадей, было значительно выше, чем активность ТКБ коз (99,
38 и 225 КОЕ соответственно), но меньше, чем активность белка у свиньи, — 20 КОЕ. При разведении ТКБ собак 1/4 зафиксирован рост КОЕ (311±23,71), что почти на 50% меньше, чем в контроле (р<0,05). Следовательно, активность тромбоцитарного катионного белка собак составила 4 единицы.
ТКБ лошадей в разведении 1/8 задерживал рост 77,7% В. .ъыЬИШ, тогда как кур — 58,6%; коз — 56,9%. Тромбодефенсины собак в этом же разведении задерживали рост 45% В. .ъиЬИШ(р<0,01), а свиней — 89,5% бацилл. Разведение ТКБ 1/16 у птиц и лошадей оказалось минимальной бак-
терицидной концентрацией, подавляющей рост 50% В. subtШs. В разведении нативного препарата 1:32 отмечался рост 380 КОЕ у кур; количество колоний в пробах с ТКБ лошадей и коз практически не отличалось от контрольных значений (количество КОЕ В. зиЬНШ в контроле составило 509—546).
В разведении 1/16 кислотный экстракт из тромбоцитов свиньи подавлял рост 82% бацилл, количество выживших микроорганизмов составило 53 КОЕ. Разведение ТКБ свиней 1:32 оказалось минимальной бактерицидной концентрацией, ингибирующей рост 50% В. зиЬНШ.
Таким образом, нами установлено наличие пептидов, обладающих антимикробной активностью, в тромбоцитах кур, лошадей, коз, свиньи и собаки. В сравнительном аспекте наиболее выраженным антимикробным действием обладает смесь пептидов из тромбоцитов свиньи — 32 единицы активности (рис. 1). Показатели активности тромбодефенсинов коз (8 единиц) занимали промежуточное положение между значениями активности тромбодефенсинов курицы и лошади, с одной стороны, собаки — с другой.
Планируемое в перспективе получение и структурно-функциональное изучение чистого препарата, а также определение минимальной бактерицидной и подавляющей концентрации очищенного КАМП относительно разнообразных представителей кокковых, а также палочковидных грамположительных и грамотрицатель-ных форм бактерий, позволит отобрать наиболее эффективный с точки зрения антимикробной активности ТКБ и создаст предпосылки для разработки и производства химически или биологи-
■
■
'
и
]
■
:
о
Курица Лошадь Коза Свинья Собака
х
Рис. 1 - Антимикробная активность тромбодефенсинов разных видов животных
чески синтезированных гомологов этих соединений. Последние могли бы найти применение в медицине и ветеринарии не только в качестве антимикробных средств, но и в качестве иммуномодулирующих и даже химиотерапевтических препаратов.
Литература
1. Jenssen, Н. Peptide antimicrobial agents / Н. Jenssen, P. Harnill, R.E.W. Hancock // Clinical Microbiology Reviews. 2006. Vol. 19. No 3. P. 491-511.
2. Кокряков, В.Н. Очерки о врождённом иммунитете / В.Н. Ко-кряков. СПб.: Наука, 2006. 261 с.
3. Бухарин, О.В. Антимикробный белок тромбоцитов / О.В. Бухарин, В.А. Черешнев, К.Г. Сулейманов. Екатеринбург, 2000. 200 с.
4. Effects of chicken intestinal antimicrobial peptides on humoral immunity of chickens and antibody titres after vaccination with infectious bursal disease virus vaccine in chicken / Yurong Y., Yibao J., Ruiping S. et al. // Z. Arch. Anim. Nutr. 2006. No. 60(5). P. 427-435.
5. Бухарин, О.В. Природа и биологическая роль тромбоци-тарного катионного белка / О.В. Бухарин, К.Г. Сулейманов // Успехи современной биологии. 1997. № 3. С. 10—15.
