CC BY
58
УДК 57.01, 58.08
С. В. Сивцева, Ж. М. Охлопкова
Антибактериальная активность и цитотоксический анализ экстрактов из фитомассы дикорастущих растений Якутии
Северо-Восточный Федеральный университет им. М.К. Аммосова, г. Якутск, Россия
Аннотация. Статья посвящена изучению антибактериальной активности, цитотоксичности и острой токсичности сухих экстрактов из надземной фитомассы Dracocephalum palmatum Stephan (семейство Lamiaceae), Pinus pumila (Pall) Regel (семейство Pinus) и Artemisia yacutica Drob. (семейство Asteracea), произрастающих на территории Якутии. При скрининге экстрактов на микроорганизмах Salmonella entericsubspecies serovar Typhimurium LT2, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Klebsiella pneumoniae ATCC 10031, Escherichia coli BL21, Paenibacillus sx. 2643 CCK 211 и Pseudomonas aeriginosa ATCC 27853 обнаружена антибактериальная активность в следующем порядке (убывания): экстракт из стеблей полыни якутской, произрастающей на территории Южной Якутии > экстракт из стеблей полыни якутской, произрастающей на территории Центральной Якутии > экстракт из хвои кедрового стланика, произрастающего на территории Северо-Восточной Якутии > экстракт из листьев полыни якутской, произрастающей на территории Центральной Якутии > экстракт из змееголовника дланевидного, произрастающего на территории Северо-Восточной Якутии. Уровень цитотоксичности экстрактов к микроорганизмам был видоспецифичным, что, возможно, объясняется различным составом биологически активных веществ и вторичных метаболитов в исследуемых экстрактах. По отношению к грамположитель-ным бактериальным клеткам Paenibacillus sx. и Staphylococcus aureus наиболее значимую активность проявляет экстракт из стеблей полыни якутской, произрастающей в Южной Якутии, при концентрации 0,0935 мг/мл и 0,061 мг/мл. По отношению к грамотрицательным бактериям Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosа, Klebsiella pneumoniae высокая активность наблюдается при концентрации 0,072, 0,075, 0,0765, 0,0725 мг/мл, соответственно, также у экстракта из стеблей полыни якутской, произрастающей в Южной Якутии. При оральном и внутримышечном введении экстрактов лабораторным мышам линии balb/c не обнаружены побочные явления, что соответствует IV классу токсичности. Вычислено LD50 экстрактов, не превышающее 5000 мг/мл.
СИВЦЕВА Сардана Васильевна - м. н. с. учебно-научной лаборатории «Молекулярно-генетичес-кие и клеточные технологии», Институт естественных наук Северо-Восточного Федерального университета им. М.К. Аммосова.
E-mail: S.V.Sivtseva@mail.ru
SIVTSEVA Sardana Vasilyevna - Junior scientific collaborator of the Laboratory «Molecular-genetic and cell technologies», Institute of natural Sciences, M.K. Ammosov North-Eastern Federal University.
ОХЛОПКОВА Жанна Михайловна - к. б. н., доцент, научный руководитель, в. н. с. учебно-научной лаборатории «Молекулярно-генетические и клеточные технологии», Институт естественных наук Северо-Восточного Федерального университета им. М.К. Аммосова.
E-mail: zhm.okhlopkova@s-vfu.ru
OKHLOPKOVA Zhanna Michaylovna - Candidate of Biological Sciences, Associate Professor, Head and Leading Researcher of the Laboratory «Molecular-genetic and cell technologies», Institute of Natural Sciences, M.K. Ammosov North-Eastern Federal University.
Ключевые слова: Якутия, Artemisia yacutica Drob, Dracocephalum palmatum Stephan, Pinus pumila (Pall) Regel, метанольное экстрагирование, антибактериальная активность, микроорганизмы, МТТ, острая токсичность, лабораторные мыши линии balb/c.
DOI 10.25587/SVFU.2018.65.14066
Выполнение работы частично поддержано научным проектом ВТК СВФУ №2.37.4.
Благодарность. Авторы выражают благодарность профессору научно-исследовательской лаборатории отдела микробиологии ВШЕН ПНУ (Республика Корея) Ho Young Kang за консультационную помощь и Yun Jeong Choe за научно-методическую и техническую помощь при выполнении экспериментов.
S. V. Sivtseva, Zh. М. Okhlopkova
Antibacterial Activity and Cytotoxicity Analysis of Wild Plants of Yakutia Phytomass Extracts
M.K. Ammosov North-Eastern Federal University, Yakutsk, Russia
Abstract. In this study, we have investigated antibacterial activity, cytotoxicity and acute toxicity of dry extracts from the overground phytomass of Dracocephalum palmatum Stephan (Lamiaceae family), Pinus pumila (Pall) of Regel (Pinus family) and Artemisia yacutica Drob. (Asteracea family), growing in the territory of Yakutia. Screening plant extracts on different microorganisms, such as of Salmonella enteric subspecies serovar Typhimurium LT2, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Klebsiella pneumoniae ATCC 10031, Escherichia coli BL21, Paenibacillus sx. 2643 CCK 211 and Pseudomonas aeriginosa ATCC 27853 is resulted in an antibacterial activity in following order (decrease): extract from sagebrush Yakut stems, growing on the territory of South Yakutia > extract from sagebrush Yakut stems, growing on the territory of Central Yakutia > extract from cedar stlanik needles growing on the territory of Northeast Yakutia > extract from sagebrush Yakut leaves growing on the territory of Central Yakutia > extract from a dracocephalum, growing on the territory of Northeast Yakutia. Level of cytotoxicity of the studied extracts to microorganisms was species-specific that, perhaps, is explained by various compositions of the biologically active compounds and secondary metabolites. In relation to the grampositive bacteriemic cages of Paenibacillus sx. and Staphylococcus aureus the most significant activity shows extract from stems of a sagebrush Yakut, growing in South Yakutia, at concentration of 0,0935 mg/ml and 0,061 mg/ml. In relation to gram-negative bacteria of Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae the high activity is observed at concentration 0,072, 0,075, 0,0765, 0,0725 mg/ml, respectively, also in extract from stems of sagebrush Yakut, growing in South Yakutia. By-effects are not found when oral and intramuscular introduction of plant extracts to the laboratory mice of the balb/c line that corresponds to the IV class of toxicity. LD50 of extracts which is not exceeding 5000 mg/ml is calculated.
Keywords: Yakutia, Artemisia yacutica Drob, Dracocephalum palmatum Stephan, Pinus pumila (Pall) Regel, methanol infusion, antibacterial activity, microorganisms, MTT, acute toxicity, laboratory mice of the balb/c line.
The research was partially funded by the NEFU multidisciplinary project # №2.37.4.
Acknowledgements. The authors would like to thank Professor Ho Young Kang of PNU Department of Molecular Biology for consulting assistance and to Yun Jeong Choe for methodological and technical support during the experimental stages of the research.
Введение
Расширение спектра внутрибольничных инфекций, изменение их биологических свойств, устойчивость к антибиотикам и высокий уровень заболеваемости населения
делают актуальным выявление альтернативных средств, обладающих широким спектром действия на патогенную или условно-патогенную микрофлору. Одним из таких средств являются биологически активные вещества растительного происхождения [1-4]. Поэтому создание лекарственных средств растительного происхождения, обладающих антибактериальными свойствами, является актуальным. При небольшом видовом разнообразии в народной медицине Якутии издавна применяются более 300 видов растений, которые разрешены Фармакологическим комитетом Министерства здравоохранения [5]. Потенциал этих растений, несмотря на длительный срок его применения в народной и официальной медицине, раскрыт не полностью. По мере исследования новых объектов проявляются оригинальные аспекты как в плане их применения, так и в технологии их получения, использования новых видов сырья.
В течение 2008-2017 гг. нами проводилось изучение антибактериального и фунгистатического действия эфирных масел и экстрактов, выделенных и полученных из дикорастущих видов растений Якутии [6-8], в т. ч. было выявлено возможное использование эфирных масел в качестве эффективного компонента антидепрессантного средства [9]. Фитохимический анализ экстрактов дикоросов Якутии показал наличие таких основных групп БАВ, как флавоноиды, кумарины, дубильные вещества, коричные кислоты, сапонины, алкалоиды и терпеноиды [10]. Обнаруженные БАВ в той или иной степени оказывают влияние на физиологическую активность экстрактов, это указывает на необходимость исследования спектра действия экстрактов определенных дикоросов Якутии. Наши исследования направлены на изучение сухих экстрактов, полученных метанольным экстрагированием из высушенной надземной фитомассы дикорастущих видов растений, произрастающих на территории Центральной (ЦЯ), Северо-Восточной (СВЯ) и Южной Якутии (ЮЯ).
Таким образом, целью данной работы является изучение антибактериальной активности и цитотоксичности экстрактов из Dracocephalum palmatum Stephan, Pinus pumila (Pall) Regel и Artemisia yacutica Drob., произрастающих на территории Якутии. В задачи исследования входили: сбор, фиксация, транспортировка фитомассы объектов исследования и пробоподготовка; получение сухих экстрактов с помощью метанольного экстрагирования; анализ уровня цитотоксичности сухих экстрактов; анализ уровня острой токсичности сухих экстрактов; скрининг антибактериальной активности сухих экстрактов.
Материал и методы исследования
Сбор фитомассы объектов исследования. Объектами исследования являются дикоросы Якутии: Dracocephalum palmatum Stephan (семейство Lamiaceae), Pinus pumila (Pall) Regel (семейство Pinus) и Artemisia yacutica Drob. (семейство Asteracea) (рис. 1). Обширные и стойкие популяции Dracocephalum palmatum Stephan на территории Якутии встречаются на Колымских и Оймяконских нагорьях, сплошные и островные популяции Pinus pumila (Pall) Regel - на территории Оймяконского, Верхоянского, Алданского и Ленского районов Якутии, заросли популяций Artemisia yacutica Drob. на территории Якутии встречаются повсеместно. Надземная фитомасса растений была собрана с соблюдением стандарта государственной фармакопеи в течение периода с июня по август 2014 г. на территории Центральной (60°31'09.0N., 131°26'26.7), Южной (59°28'09"N., 119°17'37"E) и Северо-Восточной (63°27'30.6"N., 142°54'58.0"E) Якутии.
Во время сбора объектов исследования была произведена фиксация в качестве гербаризации по презентативному количеству экземпляров. Определение объектов было подтверждено флористом лаборатории популяционной биологии ИБПК СО РАН, д. б. н. Е. Г. Николиным. Гербарии объектов хранятся в учебно-научной лаборатории «Молекулярно-генетические и клеточные технологии» отделения биологии ИЕН СВФУ.
а) б) в)
Рис. 1. Объекты исследования: а) Dracocephalumpalmatum Stephan.; б) Pinuspumila (Pall) Regel.; в) Artemisiayacutica Drob. (фото автора, 2014, Чакыр II)
Отбор проб фитомассы Pinus pumila (Pall) Regel проводился в соответствии с методикой биометрических расчетов [11] по минимальной выборке, отбирали древесную зелень по ГОСТу 21769-84 (образцы хвои снимали со срубленных побегов).
Для сушки собранная фитомасса объектов исследования укладывалась в мешки из светлого хлопчатобумажного полотна, мешки развешивались под навесом в проветриваемом месте без доступа прямых солнечных лучей.
Для транспортировки (от полевых до лабораторных условий) мешки с фитомассами укладывались в картонные коробки с предварительной подготовкой тары следующим образом: со всех сторон картонной коробки проделываются круговые отверстия диаметром в 3 см на расстоянии друг от друга на 10 см. При таком виде транспортировки выпревание растительного сырья не происходит. После доставки до лаборатории собранный материал раскладывается тонким слоем на ровные поверхности в хорошо вентилируемом помещении и регулярно переворачивается. Сушка материала считается завершенной при содержании в материале 10-15% свободной (гигроскопической) влаги.
Высушенная фитомасса измельчается вначале механическим путем, далее с помощью фарфоровой ступки с пестиком, пропускается через сито №10. Полученный порошок хранится в пакетах из бумаги крафт, вложенных в маркированные зип-пакеты при +4°С до начала анализа.
Получение экстрактов из фитомассы растений. Брали навеску высушенной измельченной надземной фитомассы объектов исследования и добавляли метанол в качестве экстрагента. Экстрагирование проводили в течение 24-48 часов при периодическом перемешивании при комнатной температуре. По истечении времени экстракты фильтровали через фильтр (Qualitative Filter Paper, Advantec 2, 185 mm). Концентрирование экстрактов проводили на роторном испарителе «EyelaCA-111 2 cl» [12] с модификациями в течение 3-4 часов при +40° С. Сушку концентрированных экстрактов проводили на лиофилизаторе «ModulSpin» в течение 3-4 часов. Таким образом, для скрининга брали сухие экстракты из фитомассы объектов исследования.
Анализ уровня цитотоксичности сухих экстрактов. Анализ уровня цитотоксичности полученных извлечений проводили с помощью окраски бромида 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенил-тетразолия (МТТ), растворенного в 1,7мМ фосфатносолевом буфере (PBS) в конечной концентрации 0,5 мг/мл и рН=7,2 с модификацией [13-15]. Бактериальные клетки в концентрации 5х104 клеток/мл засевали в 96-луночные плоскодонные планшеты, добавляли по 10 мкл экстракта, растворенного в 1%-ном диметилсульфоксиде (ДМСО) в соотношении 1:10. Планшеты инкубировали при +37 °С в течение 24 часов в термостате.
В качестве контроля использовали триплет лунок без введения экстракта и триплет лунок с добавлением 20 мкл 1%-го ДМСО. Каждую серию опыта повторяли 3 раза. За 5 часов до завершения времени инкубации в каждую лунку вносили по 5 мкл МТТ. После окончания времени инкубации клетки осаждали центрифугированием планшетов при 1000 об/мин в течение 5 мин. Из планшетов аккуратно удаляли супернатант и в каждую лунку добавляли по 5 мкл ДМСО для растворения образовавшихся кристаллов формазана. Клетки ресуспензировали и инкубировали в течение 15 мин при +37 °С. С помощью спектрофотометра ELISA (ELx800 universal micro platereader, Biotech, USA) определяли оптическую плотность при 530 нм за вычетом измеренного фонового поглощения при 620 нм [16-17].
Бактериальные клетки считали чувствительными к исследуемому экстракту, если количество погибших клеток в культуре составляло не менее 50%.
Статистический анализ результатов проводили с использованием программы Microsoft Excel. При сопоставлении средних величин использовали критерий значимости Стьюдента (различия считали статистически значимыми при р<0,05).
Анализ уровня острой токсичности сухих экстрактов. Уровень острой токсичности экстрактов проверяли согласно методическим указаниям Р. У Хабриева с модификациями [18] на 16 половозрелых белых мышах линии balb/c обоего пола, средний вес которых составлял 38-40 г. Лабораторные животные содержались при контролируемых условиях в виварии лаборатории патогенной микробиологии Пусанского национального университета и прошли карантин в течение 10 дней. Экспериментальные животные были разделены на 2 группы по 8 мышей в каждой.
Первой группе экспериментальных животных введены орально по 100 мкл экстрактов, разбавленных дистиллированной водой, в качестве контроля вводили дистиллированную воду в количестве 100 мкл (рис. 2). Продолжительность эксперимента составила 10 дней, в течение которого животные находились под наблюдением [18-21]. Учет проводили утром и вечером согласно методическим указаниям и требованиям к испытаниям на безопасность новых медицинских продуктов, действующих в пределах Европейского экономического сообщества по условиям содержания, длительности наблюдения, количества животных в группе на каждую дозу системы оценки общетоксикологического действия фармакологических средств [19].
а) б)
Рис. 2. Оральное введение экстрактов лабораторным мышам линии Ьа1Ь/с: а) во время этапа введения; б) лабораторные мыши линии Ьа1Ь/с экспериментальной группы во время первых суток наблюдения (фото автора, 2014)
Второй группе экспериментальных животных экстракты, разбавленные раствором PBS, были введены внутримышечно по 1 мл, в качестве контроля вводили раствор PBS в количестве 1 мл (рис. 3).
Критериями оценки острой токсичности служили: характер двигательной активности, координация движений, наличие судорог и их характер, наличие тремора, рефлекторные реакции на внешние раздражители (звуковые и тактильные), состояние шерстяного покрова и рефлексы положения, количество и консистенция фекальных масс, частота мочеиспускания и окраска мочи, потребление корма и воды, изменение массы тела, гематологический анализ.
Скрининг антибактериальной активности сухих экстрактов. Скрининг полученных экстрактов растений проводили в отношении условно-патогенных грамположительных и грамотрицательных бактерий методом культивирования микроорганизмов на среде, посевом газоном, методом Кирби-Бауэра с модификациями [22]. В качестве среды использовали литическую среду Бретани (LB). В качестве тест-объектов использовали музейные культуры 6 штаммов микроорганизмов: Pseudomonas aeriginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Klebsiella pneumoniae ATCC 10031, Escherichia coli BL21, рекомендованных для исследования препаратов Государственной фармакопеей [12], а также Paenibacillus sx 2643 CCK 211 и Salmonella typhimurium LT2. Данные штаммы хранятся в музейной коллекции в научно-исследовательской лаборатории отдела микробиологии Высшей школы естественных наук Пусанского национального университета (Республика Корея) (ВШЕН ПНУ, РК).
Для приготовления инокулята используют 18-20-часовую агаровую культуру исследуемого микроорганизма. Суспензию из агаровой культуры доводят до мутности стандарта 0.5 McFarland и разводят еще в 10 раз изотоническим раствором хлорида натрия (конечная концентрация 5 х 104 КОЕ/мл).
В стерильных условиях на диски стандартных размеров (диаметром в 6,35 мм, из фильтровальной бумаги) наносится заданный объем растворенного в ДМСО экстракта (по 0,5 мкл), проводится сушка в течение короткого времени. Далее диски с нанесенными экстрактами накладываются на поверхность агаризованной среды, выдерживая расстояние 15 мм от края чашки Петри, и не менее 30 мм между самими дисками. В контрольных вариантах на агаризованные среды накладываются диски, пропитанные соответствующей концентрацией ДМСО. Чашки Петри опытных и контрольных вариантов инкубируются в условиях термостата при температуре +37 °С в течение 3-4 суток в зависимости от штамма. Степень чувствительности тест-объектов к экстрактам растений оценивали, измеряя диаметр зон подавления роста микроорганизмов вокруг дисков в мм. В контрольных вариантах использовали тест-объекты без воздействия экстрактов [22].
Рис. 3. Внутримышечное введение экстрактов и PBS (контроль) экспериментальным животным (фото Yun Jeong Choe, 2014)
Таблица 1
IC50 экстрактов дикоросов Якутии при воздействии на бактериальные клетки (в мг/мл)
№ Тест-объекты Экстракты (название видов, место сбора материала) Контроль (ДМСО)
Dracocephalum palmatum Stephan (СВЯ) Pinus pumila (Pall) Regel (СВЯ) Artemisia yacutica Drob. (ЦЯ, листья) Artemisia yacutica Drob. (ЦЯ, стеблей) Artemisia yacutica Drob. (ЮЯ, стеблей)
1 Ps. aeruginosa ATCC 27853 0,2185±0 0,2365±0 0,207±0 0,1825±0 0,0765±0 0,06±0
2 Kl. pneumoniae ATCC10031 0,3055±0 0,247±0 0,3255±0 0,192±0 0,0725±0 0,046±0
3 Paenibacillus sx 2643 CCK 211 0,386±0 0,3975±0 0,758±0 0,1995±0 0,0935±0 0,0965±0
4 St. aureus ATCC25923 0,54±0 0,2165±0 0,202±0 0,202±0 0,061±0 0,054±0
5 S. typhimurium LT2 0,4715±0 0,167±0 0,319±0 0,203±0 0,072±0 0,053±0
6 E. coli BL21 0,1735±0 0,217±0 0,4395±0 0,215±0 0,075±0 0,055±0
Все варианты (опытные и контрольные) выполнены в 3-х повторностях. Статистическую обработку результатов и их достоверность определяли с помощью программы MS Exsel Microsoft Office и проводили через критерий Стьюдента для уровня вероятности не менее 95% [23-24].
Все работы, связанные с определением антибактериальной активности и уровня цитотоксичности экстрактов, были выполнены в научно-исследовательских лабораториях отдела микробиологии ВШЕН ПНУ, РК.
Результаты и их обсуждение
Определение уровня цитотоксичности экстрактов. При анализе активности экстрактов в отношении бактериальных клеток Salmonella typhimurium LT2, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Klebsiella pneumoniae ATCC 10031, Escherichia coli BL21, Paenibacillus sx 2643 CCK 211 и Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 выявили некоторую гибель клеток по типу апоптоза, которые позволили определить концентрации экстрактов, вызывающие 50%-ое ингибирование клеток (IC50) (табл. 1).
Было установлено, что экстракт из стеблей полыни якутской, произрастающей в ЮЯ, обладает наибольшей активностью против использованных тест-объектов, данный экстракт вызывает 50%-ое подавление роста бактерий, начиная с концентрации 0,061 мг/ мл, в следующем ранжированном ряду (в порядке убывания воздействия): Staphylococcus aureus - Salmonella typhimurium - Klebsiella pneumoniae - Escherichia coli - Pseudomonas aeruginosa - Paenibacillus sх.
Экстракт из стеблей полыни якутской, произрастающей в ЦЯ, обладает средней активностью против использованных тест-объектов, данный экстракт вызывает 50%-ое подавление роста бактерий, начиная с концентрации 0,1825 мг/мл, в следующем ранжированном ряду (в порядке убывания воздействия): Pseudomonas aeruginosa -
Klebsiella pneumoniae - Paenibacillus sх - Staphylococcus aureus - Salmonella typhimurium
- Escherichia coli. А экстракт, выделенный из листьев данного растения, обладает низкой антибактериальной активностью, где 50%-ое подавление роста бактерий начинается с концентрации 0,202 мг/мл в следующем ранжированном ряду: Staphylococcus aureus -Pseudomonas aeruginosa - Salmonella typhimurium - Klebsiella pneumoniae - Escherichia coli
- Paenibacillus.
К примеру, по исследованиям других авторов, этанольный экстракт, полученный из листьев A. nilagirica, произрастающей на территории Индии, подавляет рост Mycobacterium при концентрации 300 мг/мл [25]. Эфирное масло, извлеченное из листьев A. absinthium, произрастающей на территории Северо-Западного Ирана, проявляет цитотоксическую активность в отношении опухолевых клеток человека при концентрации 48,59 мг/мл [26].
Экстракт из хвои кедрового стланика, произрастающей в СВЯ, обладает средней активностью против использованных бактериальных клеток, данный экстракт вызывает 50%-ое подавление роста бактерий, начиная с концентрации 0,167 мг/мл, в следующем ранжированном ряду (в порядке убывания воздействия): Salmonella typhimurium -Staphylococcus aureusт - Escherichia coli - Pseudomonas aeruginosa - Klebsiella pneumoniae
- Paenibacillus.
К примеру, ЛД50 экстракта и эфирного масла, выделенных из хвои кедрового стланика, произрастающего на территории Китая, для апробированных лабораторных животных (мышей) составляет 0,577 мг/мл [27].
Экстракт из змееголовника дланевидного, произрастающего в СВЯ, обладает низкой активностью против использованных тест-объектов, данный экстракт вызывает 50%-ое подавление роста бактерий, начиная с концентрации 0,1735 мг/мл, в следующем ранжированном ряду: Escherichia coli - Pseudomonas aeruginosa - Klebsiella pneumoniae -Paenibacillus - Salmonella typhimurium - Staphylococcus aureus.
Экстракт Dracocephalum argunense, произрастающего на Дальнем Востоке, не является токсичным при концентрациях 2,5 мг/мл и 5,0 мг/мл, а при концентрации 10,0 мг/мл оказывает слабое токсическое действие в отношении A. salina [28]. Экстракт из листьев Dracocephalum kotschyii, произрастающего на территории Ирана, при концентрации 16,3 мг/мл и 26,9 мг/мл оказывает токсическое действие на клеточные линии HL60 и K562, соответственно [29].
Также полученные нами данные указывают на то, что Paenibacillus sx. оказалась наиболее устойчивой к воздействию экстракта, полученного из листьев полыни якутской, произрастающей на территории ЦЯ. Кроме того, к экстракту из змееголовника дланевидного устойчивость проявила культура золотистого стафилококка.
По отношению к грамположительным бактериальным клеткам Paenibacillus sx. и Staphylococcus aureus наиболее значимую активность проявил экстракт из стеблей полыни якутской, произрастающей в ЮЯ, при концентрации 0,0935 мг/мл и 0,061 мг/мл.
По отношению к грамотрицательным бактериям Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae высокая активность наблюдается при концентрации 0,072, 0,075, 0,0765, 0,0725 мг/мл, соответственно, также у экстракта из стеблей полыни якутской, произрастающей в ЮЯ.
Определение острой токсичности экстрактов растений. Оральное введение экстрактов. Далее было необходимо провести оценку острой токсичности исследуемых экстрактов, полученных из трех разных видов дикорастущих растений Якутии: из змееголовника дланевидного, кедрового стланика, полыни якутской.
Оценка общего состояния животных при осмотре на руках, в условиях клетки, а также на открытой площадке показала, что в течение первых суток в опытной и контрольной группах характер и координация двигательной активности не меняется, судороги отсутствуют, реакция на внешние раздражители (звуковые и тактильные) сохраняется
а) б) в) г)
Рис. 4. Получение крови для гематологического анализа: а) проведение наркоза животным; б) вид капиллярных трубок для забора образцов крови; в) забор образцов крови из глазного орбитального синуса; г) кровь, взятая для гематологического анализа (фото автора, 2014)
в норме, а частота и глубина дыхательных движений увеличивается в течение первых 15 минут, также увеличивается ритм сердечных сокращений, хвост находится в свободном положении. У животных наблюдается нормальная слизистая оболочка, последовательность фекальных масс и их окраска идет без изменений, частота мочеиспускания и цвет мочи не изменяются (темно-желтый). Вес тела животных в течение суток до и после кормления не меняется (рис. 2).
В последующие 2-10-е сутки наблюдения общее состояние животных сохраняется в норме, потребление пищи и воды также в норме, любые другие признаки отклонения отсутствуют.
К концу эксперимента, после десяти суток, среди наблюдаемых животных в опытной и контрольной группах не было отмечено летальных случаев.
Гематологический анализ крови мышей линии Ьа1Ь/с по истечению эксперимента не выявил сильной разницы или отклонений по показателям эритроцитов и лейкоцитов в сравнении с контрольной группой (рис. 4, табл. 2). В течение периода эксперимента гибель животных от введенной дозы экстрактов и контроля (LD50) не наблюдалась.
Таблица 2
Определение цитотоксичности экстрактов дикоросов Якутии на клетках крови экспериментальных мышей линии balb/c
№ Пластины с кровью экспериментальных животных Абсолютное число эритроцитов (1012/л)
1 Контроль (вода) 16±4
2 Пластина c экстрактом из Dracocephalum palmatum Stephan 12±3
3 Пластина с экстрактом из Pinus pumila (Pall) Regel 13±3,25
4 Пластина с экстрактом из Artemisia yacutica Drob. (ЦЯ) 13±3,25
№ Пластины с кровью экспериментальных животных Абсолютное число лейкоцитов (109/л)
1 Контроль (вода) 1±0,25
2 Пластина с экстрактом из Dracocephalum palmatum Stephan 1±0,25
3 Пластина с экстрактом из Pinus pumila (Pall) Regel 3±0,75
4 Пластина с экстрактом из Artemisia yacutica Drob. (ЦЯ) 2±0,5
Таблица 3
Определение цитотоксичности на клетках крови экспериментальных мышей линии balb/c
№ Пластины с кровью экспериментальных животных Абсолютное число эритроцитов (1012/л)
1 Контроль (PBS) 15±3,75
2 Пластина с экстрактом из Dracocephalum palmatum Stephan 25±6,25
3 Пластина с экстрактом из Pinuspumila (Pall) Regel 21±5,25
4 Пластина с экстрактом из Artemisiayacutica Drob. (ЦЯ) 19±4,75
№ Пластины с кровью экспериментальных животных Абсолютное число лейкоцитов (109/л)
1 Контроль (PBS) 2±0,5
2 Пластина с экстрактом из Dracocephalum palmatum Stephan 2±0,5
3 Пластина с экстрактом из Pinus pumila (Pall) Regel 3±0,75
4 Пластина с экстрактом из Artemisia yacutica Drob. (ЦЯ) 3±0,75
Рис. 5. Образец крови экспериментальных мышей линии Ьа1Ь/с (biomed, 40х, окраска по Романовскому-Гимзе) (фото автора, 2015)
Внутримышечное введение экстрактов. Оценка общего состояния животных при осмотре на руках, в условиях клетки и на открытой площадке показала отсутствие изменения по вышеуказанным характеристикам как в течение первых суток, так и во время всего остального периода наблюдения. К концу эксперимента, после десяти суток, не было летальных случаев в опытной и контрольной группах животных. После введения раствора сравнения в виде PBS наблюдается угнетение двигательной активности в течение первых 30-40 минут, других изменений по вышеуказанным характеристикам также не было выявлено в течение первых суток и во время всего периода наблюдения (рис. 3). К концу эксперимента также не было отмечено летального случая во всех группах животных.
Гематологический анализ экспериментальных мышей линии balb/c по истечению эксперимента показал отсутствие разницы между опытной и контрольной группами (рис. 5). Введение технической дозы 4000 мг/мл не привело к гибели ни одного экспериментального животного в течение периода эксперимента, было получено значение для LD50<5000 мг/мл, что доказывает отсутствие токсичности апробированных экстрактов (табл. 3).
Анализ антибактериальной активности экстрактов растений. По полученным результатам в отношении к Staphylococcus aureus ATCC 25923 подавляющую активность
проявили экстракт, полученный из хвои кедрового стланика северо-восточных популяций, а также экстракт, полученный из фитомассы полыни якутской, произрастающей на территории ЮЯ и ЦЯ.
К примеру, экстракты из коры кедрового стланика, произрастающего на территории Китая, обладают антибактериальной активностью против роста и развития Staphylococcus aureus. Эти извлечения являются цитотоксичными против мышей линии hepatoma при концентрации 0,5771 мг/мл [30]. Экстракт из Artemisia dubia, произрастающий на территории Пакистана, обладает антибактериальной активностью против роста и развития S. aureus и Bacillus subtilis и не обладает высокой цитотоксичностью. А настои, полученные из A. laciniata и A. macrantha, имеют антибактериальную активность в отношении роста и развития Staphylococcus aureus [31].
При сравнении антибактериальной активности полыни якутской, произрастающей на территориях ЦЯ и ЮЯ, а также полыни теневой, произрастающей на территории Пакистана, в отношении Staphylococcus aureus наибольшую активность (с подавлением роста бактерии на 12,05 мм) имеет экстракт из стеблей полыни якутской южно-якутской популяции при концентрации 10 мг/мл. А кедровый стланик, произрастающий на территории СВЯ, обладает малой токсичностью (0,056 мг/мл) при сравнении с таковым показателем у экстракта, полученного из кедрового стланика, произрастающего на территории Китая.
По отношению к Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 активен экстракт из листьев полыни якутской центрально-якутской популяции. К примеру, экстракт из листьев Artemisia nilagirica, произрастающей на территории Индии, обладает антибактериальной активностью против роста и развития Pseudomonas aeruginosa [32]. Различные экстракты из Artemisia dracunculus, произрастающей на территории Турции, обладают антибактериальной активностью против роста и развития Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 [33].
Экстракт из листьев полыни якутской, произрастающей на территории Центральной Якутии, при концентрации 60 мг/мл на 12,3 мм подавляет рост Pseudomonas aeruginosa, а экстракт, полученный из листьев Artemisia nilagirica, произрастающей на территории Турции, при концентрации 50 мг/мл на 12 мм подавляет рост того же тест-объекта. Метанольный экстракт из Artemisia dracunculus, произрастающей на территории Турции, при концентрации 10 мг/мл на 10 мм подавляет рост Pseudomonas aeruginosa, а экстракт, полученный из листьев полыни якутской, произрастающей на территории ЦЯ, такую же активность имеет при концентрации 60 мг/мл.
Мы предполагаем, что антибактериальная активность экстрактов некоторых дикоросов Якутии зависит от наличия соответствующих биологически активных веществ. В различных экстрактах, полученных из фитомассы некоторых дикоросов Якутии, были найдены флавоноиды, кумарины, дубильные вещества, коричные кислоты, сапонины, алкалоиды и терпеноиды [18].
Таблица 4
Антибактериальная активность экстрактов дикорастущих растений Якутии
№ Тест-объект S typhimurium LT2 St. Aureus ATCC 25923 Kl. pneumoniae ATCC 10031 E. coli BL21 Paenibacillus sx. 2643 CCK 211 Ps. aeriginosa ATCC 27853
Экстракт Зона подавления (в мм)
1 Dracocephalum Palmatum Stephan 12±3 10±3 13±2 12±2 10±3 11±3
2 Pinus pumila (Pall) Regel 10±2 12±2 10±1 13±2 11±1 11±2
3 Artemisia yacutica Drob. (CY leaf) 9±1 9±1 11±2 8±1 10±2 12±2
4 Artemisia yacutica Drob. (CY steem) 11±1 11±1 13±2 9±1 12±2 12±2
5 Artemisia yacutica Drob. (SY steem) 11±2 12±2 10±1 11±2 12±2 10±2
Контроль Зона подавления (в мм)
1 ДМСО 7±2 5±1 7±1 7±2 8±2 6±2
Как видно из таблицы 4, изучаемые экстракты растений обладают соответствующей антибактериальной активностью по отношению к росту и развитию использованных тест-объектов, и можно представить следующий ранжированный ряд (по убыванию антибактериальной активности): экстракт из стеблей полыни якутской, произрастающей на территории ЮЯ > экстракт из стеблей полыни якутской, произрастающей на территории ЦЯ > экстракт из хвои кедрового стланика, произрастающего на территории СВЯ > экстракт из листьев полыни якутской, произрастающей на территории ЦЯ > экстракт из змееголовника дланевидного, произрастающего на территории СВЯ.
Заключение
В результате проведенных исследований установлено:
1) Полученные и апробированные экстракты из дикоросов Якутии обладают различной цитотоксичностью для тест-объектов, и реакция видоспецифична, что можно объяснить различным составом БАВ и вторичных метаболитов в объектах исследования.
2) Введение максимально допустимых доз апробированных экстрактов из дикоросов Якутии не вызывает гибель лабораторных животных (мышей). Получено значение LD50 экстрактов, не превышающее 5000 мг/мл, что согласно ГОСТу 12.1.007-76 относится к IV классу опасности (малоопасные вещества).
3) Экстракт из хвои кедрового стланика северо-восточных популяций, экстракт из фитомассы полыни якутской, произрастающей на территории ЮЯ и ЦЯ, обладают антибактериальной активностью по отношению к росту и развитию Staphylococcus aureus ATCC 25923 при концентрации 12,1 и 12,05 мг/мл, соответственно. По отношению к Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 активен экстракт из листьев полыни якутской центрально-якутской популяции при концентрации 12,3 мг/мл.
В современной фармакологии большинство средств - это БАВ растительного происхождения или синтезированные химическим путем их аналоги. В настоящее время, несмотря на успехи синтетической химии, из растений получают более трети лекарственных препаратов [34]. Препараты на основе лекарственных растений в настоящее время занимают активные позиции в фармацевтике, биомедицине, биотехнологии растений. Их преимуществом является малая токсичность, что также показали апробированные нами экстракты. В связи с этим несомненный научно-практический интерес представляют изученные нами дикоросы Якутии как источники БАВ.
Полученные результаты показывают перспективы использования экстрактов кедрового стланика, произрастающего в СВЯ, и полыни якутской, произрастающей в ЦЯ и ЮЯ, в качестве источников БАВ антибактериального действия.
Л и т е р а т у р а
1. Шестакова Т. С. Фитохимическое изучение и стандартизация препаратов на основе
экстрактов растений /Автореферат на соискание канд. дисс. по 15.00.02 фармацевтической химии и фармакогнозии. - Пермь, 2007. - 179 с.
2. Joshi A. Phytochemical analysis and cytotoxsity studies of Tylophora indica leaves in BNK 21 cells. International Journal of traditional and Herbal Medicine. - 2013. - 1 (3): 54-58.
3. Покровский В. И. Внутрибольничные инфекции: проблемы и пути решения / В. И. Покровский, Н. А. Семина // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2000. - № 5. - С. 12-14 . - ISSN 1560-9529.
4. Bardossy A. C. Preventing Hospital-acquired Infections in Low-income and Middle-income Countries: Impact, Gaps, and Opportunities / A. C. Bardossy, J. Zervos, M. Zervos //. Infect. Dis. Clin. North. Am. - 2016.
- V. 30, N. 3. - P. 805-818.
5. Макаров А. А. (1979) Лекарственные растения Якутии. - Якутск, Кн. изд-во, 1979. - 224 с.
6. Сивцева С. В., Охлопкова Ж. М., Васильева И. В., Ядрихинская В. К. Разработка биологически активных веществ из растений Якутии с антибактериальной активностью. Сб. мат. симп. «Экология. Природные ресурсы. Рациональное природопользование». - М.: Бюллетень МОИП. Отд. Биол. - 2009.
- Т. 114, Вып. 3. - Прил. 1, Ч. 2. -174-176.
7. Сивцева С.В. Исследование антибактериальной активности экстрактов Artemisia yacutica Drob. Центральной и Северо-Восточной Якутии. Материалы 52-й Международной научной студенческой конференции МНСК: Биология. 2014а. - 220 с.
8. Сивцева С. В. (2014б) Антибактериальная активность кедрового стланика Северо-Востока Якутии // Физиология растений - теоретическая основа инновационных агро- и фитобиотехнологий: международная научная конференция и школа молодых ученых. Часть 1, 2014б. - С. 330-332.
9. Sivtseva S. V., Poskachina E. R., Khandy M. T., Okhlopkova Zh. M. Designing Bioactive Substances with Antidepressant Potency Based on Wild Plants from North-East of Yakutia. Proc.Of the Mosc. Int. Congress. - Part 1. - M.: JSC "Expo-biochem-technologies", 2011. - 89-90 p.
10. Sivtseva S. V., Okhlopkova Zh. М. Phytochemical analysis of extracts of wild plants growing in Yakutia for the content of basic groups of BAS. Der Pharma Chemica, - 2015. - 11:334-343.
11. Плохинский Н. А. Биометрия. - М., 1970. - 367 с.
12. Государственная фармакопея СССР. 11-е изд., доп. Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье. - М.: Медицина, 1990. - 400 с.
13. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular grow and survival: application to proliferation and cytotoxcity assays. Journal of Immunological Methods. - 1983. - 65:55-63.
14. Qulntero A., Pelcastre A. and Solano J.D. Antimicrobial activity of new pyrimidine derivatives of sesquiterpene lactones. Journal of Pharmaceutical Sciences. - 1999. - 2:108-112.
15. Kawase M., Motohashi N., Satoh K., Sakagami H., Nakashima H., Tani S., Shirataki Y., Kurihara T., Spengler G., Wolfard K. and Molnar J. Biological activity of Persimmon (Diospyros kaki) peel extracts. PhototherapyResearch. - 2003. - 17:495-500.
16. Егоров А. М., Осипов А. П., Дзантиев Б. Б., Гаврилова Е. М. Теория и практика иммуноферментного анализа. - М.: Высшая школа, 1991. - 32 с.
17. Tijssen P. Practice and theory of enzyme immunoassays. Amsterdam; New York: Elsevier, New York, USA : Sole distributors for the USA and Canada, Elsevier Science, 1985. - р. 502.
18. Хабриев Р. У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - Москва, Медицина, 2005. - С. 41-54.
19. Irwin S. Animal and clinical Pharmacologic Techniques in drug evolution, Chicago, 1964.
20. Irwin S. Comprehensive observational assessment: In: A systematic, quantitative procedure for assessing the behavioural and physiologic state of the mouse. Psychopharmacological. Berlin, 1968. - 13:222-257.
212. Griffin L. P. Referring to the paper by Zbinden and Flury-Roversi. Significance of the LD50 test for toxicological evaluation of chemical substances. Arch. Toxicol., 1981. - 49(1):99-103.
22. Bauer A.W., Kirby W. M. M., Sherris J. C., Turck M. Am. J. Clin. Path, 1966. - 45:493-496.
23. Лакин Г. Ф. Биометрия: Учебное пособие для биол. спец. вузов - 4-еизд., перераб. идоп. - М.: Высш. шк., 1990. - 352 с.
24. Гланц С. (1998) Медико-биологическая статистика. Пер. с англ. - М.: практика, 1998. - 459 с.
25. Naik S. K, Mohanty S., Padhi A., Pati R., Sonawane A. Evaluation of antibacterial and cytotoxic
activity of Artemisia nilagirica and Murraya koenigii leaf extracts against mycobacteria and macrophages. BMC Complement Altern Med, 2014. - 14(87).
26. Mahboubeh T. In Vitro Cytotoxic Activity of the Essential Oil Extracted from Artemisia absinthium. Iranian Journal of Toxicology, 2014. -8(26): 1152-1156.
27. Li W, Chen Y, Wang X, Qu S., Valimaa A.L, Honkalampi-Hamalainen U, Pietarinen S, Willfor S, Holmbom B. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi Pharmacological studies on the volatile oil isolated from the leaves of Pinus pumila (Pall.) Regel. Chinese, 1991. - 16(3):172-176.
28. Ишмуратова М. Ю., CYлеймен Е. М., Дудкин Р. В., Горовой П. Г. Анатомическое строение Dracocephalum argunense Fisch. ex Link и Scutellaria regeliana Nakai из Дальнего Востока. Труды XVIII Международной научно-практической конференции «Естественные и математические науки в современном мире». - Новосибирск, 2014. - С. 110-114.
29. Fereshteh J., Soltan Ahmed E., Nahid R., Massoud M. Xanthomicrol is the main cytotoxic component of Dracocephalum kotschyii and a potential anti-cancer agent. Phytochemistry. - 2005. - 66:1581-159.
30. Ефремова Н. А. Лекарственные растения Камчатки и Командорских островов. - Петропавловск-Камчатский, 1967. - 185 с.
31. Haq A. Mannan, I. Ahmed, Hussain I., Jamil M., Miza B. Antibacterial activity and brine shrimp toxicity of Artemisia dubia extract. Pak. J. Bot., - 2012. - 44(4): 1487-1490.
32. Ahameethunisa R., Hopper W. Antibacterial activity of Artemisia nilagirica leaf extracts against clinical and phytopathogenic bacteria. BMC Complement Altern Med., 2010. - 10(6):1-9.
33. Benli M., Kaya I., Yigit N. Screening antimicrobial activity of various extracts of Artemisia dracunculus L. Cell Biochem Funct, 2007. - 25(6):681-687.
34. Машковский М. Д. Лекарственные средства. - М.: Новая Волна, 2012. - 1216 с.
R e f e r e n c e s
1. Shestakova T. S. Fitohimicheskoe izuchenie i standartizaciya preparatov na osnove ehkstraktov rastenij /Avtoreferat na soiskanie kand. diss. po 15.00.02 farmacevticheskoj himii i farmakognozii. - Perm', 2007. - 179 s.
2. Joshi A. Phytochemical analysis and cytotoxsity studies of Tylophora indica leaves in BNK 21 cells. International Journal of traditional and Herbal Medicine. - 2013. - 1 (3): 54-58.
3. Pokrovskij V. I. Vnutribol'nichnye infekcii: problemy i puti resheniya / V. I. Pokrovskij, N. A. Semina // EHpidemiologiya i infekcionnye bolezni. - 2000. - № 5. - S. 12-14 . - ISSN 1560-9529.
4. Bardossy A. C. Preventing Hospital-acquired Infections in Low-income and Middle-income Countries: Impact, Gaps, and Opportunities / A. C. Bardossy, J. Zervos, M. Zervos //. Infect. Dis. Clin. North. Am. - 2016. - V. 30, N. 3. - P. 805-818.
5. Makarov A. A. (1979) Lekarstvennye rasteniya YAkutii. - YAkutsk, Kn. izd-vo, 1979. - 224 s.
6. Sivceva S. V., Ohlopkova ZH. M., Vasil'eva I. V., YAdrihinskaya V. K. Razrabotka biologicheski aktivnyh veshchestv iz rastenij YAkutii s antibakterial'noj aktivnost'yu. Sb. mat. simp. «EHkologiya. Prirodnye resursy. Racional'noe prirodopol'zovanie». - M.: Byulleten' MOIP. Otd. Biol. - 2009. - T. 114, Vyp. 3. - Pril. 1, CH. 2. -174-176.
7. Sivceva S.V. Issledovanie antibakterial'noj aktivnosti ehkstraktov Artemisia yacutica Drob. Central'noj i Severo-Vostochnoj YAkutii. Materialy 52-j Mezhdunarodnoj nauchnoj studencheskoj konferencii MNSK: Biologiya. 2014a. - 220 s.
8. Sivceva S. V. (2014b) Antibakterial'naya aktivnost' kedrovogo stlanika Severo-Vostoka YAkutii // Fiziologiya rastenij - teoreticheskaya osnova innovacionnyh agro- i fitobiotekhnologij: mezhdunarodnaya nauchnaya konferenciya i shkola molodyh uchenyh. CHast' 1, 2014b. - S. 330-332.
9. Sivtseva S. V., Poskachina E. R., Khandy M. T., Okhlopkova Zh. M. Designing Bioactive Substances with Antidepressant Potency Based on Wild Plants from North-East of Yakutia. Proc.Of the Mosc. Int. Congress. - Part 1. - M.: JSC "Expo-biochem-technologies", 2011. - 89-90 p.
10. Sivtseva S. V., Okhlopkova Zh. M. Phytochemical analysis of extracts of wild plants growing in Yakutia for the content of basic groups of BAS. Der Pharma Chemica, - 2015. - 11:334-343.
11. Plohinskij N. A. Biometriya. - M., 1970. - 367 s.
12. Gosudarstvennaya farmakopeya SSSR. 11-e izd., dop. Vyp. 2. Obshchie metody analiza. Lekarstvennoe rastitel'noe syr'e. - M.: Medicina, 1990. - 400 s.
13. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular grow and survival: application to proliferation and cytotoxcity assays. Journal of Immunological Methods. - 1983. - 65:55-63.
14. Qulntero A., Pelcastre A. and Solano J.D. Antimicrobial activity of new pyrimidine derivatives of sesquiterpene lactones. Journal of Pharmaceutical Sciences. - 1999. - 2:108-112.
15. Kawase M., Motohashi N., Satoh K., Sakagami H., Nakashima H., Tani S., Shirataki Y., Kurihara T., Spengler G., Wolfard K. and Molnar J. Biological activity of Persimmon (Diospyros kaki) peel extracts. PhototherapyResearch. - 2003. - 17:495-500.
16. Egorov A. M., Osipov A. P., Dzantiev B. B., Gavrilova E. M. Teoriya i praktika immunofermentnogo analiza. - M.: Vysshaya shkola, 1991. - 32 s.
17. Tijssen P. Practice and theory of enzyme immunoassays. Amsterdam; New York: Elsevier, New York, USA : Sole distributors for the USA and Canada, Elsevier Science, 1985. - r. 502.
18. Habriev R. U. Rukovodstvo po ehksperimental'nomu (doklinicheskomu) izucheniyu novyh farmakologicheskih veshchestv. - Moskva, Medicina, 2005. - S. 41-54.
19. Irwin S. Animal and clinical Pharmacologic Techniques in drug evolution, Chicago, 1964.
20. Irwin S. Comprehensive observational assessment: In: A systematic, quantitative procedure for assessing the behavioural and physiologic state of the mouse. Psychopharmacological. Berlin, 1968. - 13:222-257.
212. Griffin L. P. Referring to the paper by Zbinden and Flury-Roversi. Significance of the LD50 test for toxicological evaluation of chemical substances. Arch. Toxicol., 1981. - 49(1):99-103.
22. Bauer A.W., Kirby W. M. M., Sherris J. C., Turck M. Am. J. Clin. Path, 1966. - 45:493-496.
23. Lakin G. F. Biometriya: Uchebnoe posobie dlya biol. spec. vuzov - 4-eizd., pererab. idop. - M.: Vyssh. shk., 1990. - 352 s.
24. Glanc S. (1998) Mediko-biologicheskaya statistika. Per. s angl. - M.: praktika, 1998. - 459 s.
25. Naik S. K, Mohanty S., Padhi A., Pati R., Sonawane A. Evaluation of antibacterial and cytotoxic activity of Artemisia nilagirica and Murraya koenigii leaf extracts against mycobacteria and macrophages. BMC Complement Altern Med, 2014. - 14(87).
26. Mahboubeh T. In Vitro Cytotoxic Activity of the Essential Oil Extracted from Artemisia absinthium. Iranian Journal of Toxicology, 2014. -8(26): 1152-1156.
27. Li W, Chen Y, Wang X, Qu S., Valimaa A.L, Honkalampi-Hamalainen U, Pietarinen S, Willfor S, Holmbom B. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi Pharmacological studies on the volatile oil isolated from the leaves of Pinus pumila (Pall.) Regel. Chinese, 1991. - 16(3):172-176.
28. Ishmuratova M. YU., CYlejmen E. M., Dudkin R. V., Gorovoj P. G. Anatomicheskoe stroenie Dracocephalum argunense Fisch. ex Link i Scutellaria regeliana Nakai iz Dal'nego Vostoka. Trudy XVIII Mezhdunarodnoj nauchno-prakticheskoj konferencii «Estestvennye i matematicheskie nauki v sovremennom mire». - Novosibirsk, 2014. - S. 110-114.
29. Fereshteh J., Soltan Ahmed E., Nahid R., Massoud M. Xanthomicrol is the main cytotoxic component of Dracocephalum kotschyii and a potential anti-cancer agent. Phytochemistry. - 2005. - 66:1581-159.
30. Efremova N. A. Lekarstvennye rasteniya Kamchatki i Komandorskih ostrovov. - Petropavlovsk-Kamchatski], 1967. - 185 s.
31. Haq A. Mannan, I. Ahmed, Hussain I., Jamil M., Miza B. Antibacterial activity and brine shrimp toxicity of Artemisia dubia extract. Pak. J. Bot., - 2012. - 44(4): 1487-1490.
32. Ahameethunisa R., Hopper W. Antibacterial activity of Artemisia nilagirica leaf extracts against clinical and phytopathogenic bacteria. BMC Complement Altern Med., 2010. - 10(6):1-9.
33. Benli M., Kaya I., Yigit N. Screening antimicrobial activity of various extracts of Artemisia dracunculus L. Cell Biochem Funct, 2007. - 25(6):681-687.
34. Mashkovskij M. D. Lekarstvennye sredstva. - M.: Novaya Volna, 2012. - 1216 s.
