Анализ В-клеточных эпитопов гемагглютинина вирусов гриппа Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ОБЗОРЫ

УДК 578.74

Анализ В-клеточных эпитопов гемагглютинина вирусов гриппа

Д. Н. Щербинин*, С. В. Алексеева, М. М. Шмаров, Ю. А. Смирнов, Б. С. Народицкий, А. Л.Гинцбург

Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии

им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи Министерства здравоохранения Российской

Федерации, 123098, Москва, ул. Гамалеи, 18

*E-mail: dim284@inbox.ru

Поступила в редакцию 16.08.2015

Принята к печати 09.12.2015

РЕФЕРАТ Вакцинация давно и успешно применяется для профилактики гриппа. Основным антигеном современных гриппозных вакцин является гемагглютинин (НА) вируса гриппа, вызывающий гуморальный иммунный ответ в организме человека и защищающий от гриппа. Однако периодически появляются новые сезонные и пандемические варианты вируса с измененной структурой НА. Это позволяет возбудителю избегать нейтрализации антителами, которые образовались в ответ на ранее проведенную вакцинацию. Разработка вакцины с новыми вариантами НА в качестве антигена занимает продолжительное время, поэтому в период эпидемии важно иметь в качестве профилактики и терапии средства для пассивной иммунизации, которыми могут служить моноклональные или однодоменные антитела с универсальной специфичностью (широкого спектра действия). В качестве универсальных антител рассматривают антитела к консервативным эпитопам антигенов вируса гриппа. Мы попытались охарактеризовать основные В-клеточные эпитопы гемагглютинина и обобщить собственные и опубликованные данные об антителах с широкой нейтрализующей активностью. С использованием различных баз данных проведен компьютерный анализ наиболее известных конформационных эпитопов НА вирусов гриппа. Результаты анализа свидетельствуют, что мишенью поиска и создания антител широкого спектра действия к вирусу гриппа может быть стержневая часть молекулы HA, антитела к которой обладают выраженной гетеросубтипиче-ской активностью.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА вирус гриппа, гемагглютинин, конформационные эпитопы, моноклональные антитела широкого спектра действия, однодоменные антитела широкого спектра действия.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ НА - гемагглютинин вируса гриппа; H1-H18 - подтипы гемагглютинина вируса гриппа.

ВВЕДЕНИЕ

Гемагглютинин (НА) - основной антигенный компонент вирусов гриппа, представляет собой гомотри-мерный поверхностный гликопротеин с грибопо-добной формой, мономер которого состоит из двух фрагментов, связанных дисульфидным мостиком: HA1 (330 аминокислот) - глобулярная часть, дис-тальная от вирусной мембраны, и HA2 (220 аминокислот) - стержневая часть, закрепленная в вирусной мембране. В природе найдено 18 подтипов НА вирусов гриппа А [1].

Вируснейтрализующие антитела, индуцированные HA, составляют основу гуморального иммунитета, защищающего организм человека от гриппозной инфекции [2]. Антигенная структура HA постоянно изменяется в результате селективного давления иммунной системы организма-хозяина,

что приводит к появлению и селекции новых вариантов вируса, способных избегать нейтрализующего эффекта существующих антител и преодолевать специфическую иммунную защиту человека. Этот механизм - антигенный дрейф - снижает эффект противогриппозной вакцинации [3]. При появлении пандемических штаммов вируса гриппа А, когда вирус с новым антигенным подтипом НА попадает в человеческую популяцию (антигенный шифт) [2, 4], существующие вакцины оказываются неэффективными. Эти обстоятельства объясняют необходимость поиска новых подходов к созданию противогриппозных препаратов с широким спектром активности [5]. Один из таких подходов - поиск и характеристика консервативных антигенных детерминант в молекуле НА вируса гриппа, получение нейтрализующих антител широкого спектра действия. Такие антите-

ла могут использоваться для экстренной пассивной иммунизации или терапии при проведении противоэпидемических мероприятий.

Молекулярные исследования антигенной структуры НА показали, что участки, взаимодействующие с антителами, расположены главным образом в глобулярном домене субъединицы НА1 [6]. Аминокислотные последовательности данных сайтов чрезвычайно вариабельны и различаются не только у разных подтипов HA, но и внутри одного подтипа. В субъединице HA2 обнаружены консервативные детерминанты [7-10]. Эти данные позволили предположить, что консервативные антигенные сайты в молекуле НА могут индуцировать образование антител с широкой перекрестно нейтрализующей активностью. Это предположение подтверждено Y. Okuno и соавт. [11], которые впервые получили и охарактеризовали моноклональное антитело к НА подтипа Н2, обладающее нейтрализующей активностью в отношении штаммов вирусов гриппа A с НА Н2 и H1. Это моноклональное антитело (С179) распознает конфор-мационный эпитоп в стержневом регионе молекулы НА, консервативный у вирусов гриппа А подтипов Н2 и H1. Известно, что вирусы гриппа птиц подтипов Н5 и Н6 филогенетически близки к штаммам подтипов H1 и Н2 [12, 13]. Широкий спектр действия мышиного антитела С179 выявлен в НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского и показано, что это антитело реагирует с вирусами подтипов Н1, Н2 и Н5 (и даже с НА подтипа Н6 в его не вполне зрелой форме) [14, 15].

В качестве многообещающего средства пассивной иммунизации против гриппа рассматривают одно-доменные антитела. Однодоменные антитела малы, стабильны и просты в производстве. Показано, что интраназальное введение полученных от ламы одноцепочечных фрагментов вариабельных доменов иммуноглобулинов, обладающих нейтрализующей активностью in vitro против вирусов гриппа H5N1, могут контролировать репликацию вируса, а также снижать заболеваемость и смертность мышей, зараженных вирусом гриппа H5N1. Хотя исследование было сосредоточено на однодоменных антителах, которые распознают эпитоп около домена связывания с рецептором, подчеркивается принципиальная возможность отбора молекул антител широкого спектра действия, которые связываются с другими эпитопа-ми НА, в том числе консервативными [16].

В другой работе получено однодоменное антитело к НА вируса гриппа А и сконструирован рекомби-нантный аденовирус, экспрессирующий данное антитело. Введение такого рекомбинантного аденовируса в интервале от 48 ч до 14 дней до заражения способно полностью защищать мышей от вируса гриппа А [17].

Таким образом, совершенно очевидна необходимость поиска средств пассивной иммунизации с универсальной специфичностью, которые позволяют преодолеть антигенную изменчивость вируса гриппа [18].

Возможно, что направление поиска путей пассивной иммунизации, обеспечивающей защиту от широкого спектра вирусов гриппа, начатое совместно японскими и российскими учеными и продолжаемое сейчас в ряде лабораторий, окажется наиболее перспективным.

АНТИТЕЛА К ГЛОБУЛЯРНОЙ ЧАСТИ МОЛЕКУЛЫ НА

Наибольшее количество вируснейтрализующих антител, вырабатываемых естественным или искусственным путем, связывается с глобулярной частью НА, что приводит к блокированию прикрепления вирионов к клеткам. Однако вследствие того, что ген HA быстро мутирует, возникают аминокислотные замены, которые приводят к формированию новых сайтов гликозилирования, что, в свою очередь, вызывает изменения поверхностной структуры белка. Следовательно, эти антигенные сайты высоковариабельны и антитела к ним штаммоспе-цифичны. Отчасти это объясняет, почему иммунитет после натурального заражения или вакцинации в основном ограничивается циркулирующим штаммом. Например, антитела 2D1, связывающие Sa-антигенный сайт, расположенный в глобулярной части молекулы НА, распознают только пандемические вирусы НШ1 1918 и 2009 годов, эпитопы которых являются антигенно подобными, хотя их разделяет почти столетие [19]. Другие штаммы подтипа Н1, например PR8, такие антитела не способны распознавать (табл. 1, рисунок).

Однако за последнее время были описаны и охарактеризованы несколько антител, специфичных к глобулярной части НА и обладающих при этом вируснейтрализующей активностью против нескольких штаммов вируса гриппа в пределах одного подтипа. Эти эпитопы консервативны у различных штаммов вирусов и, следовательно, распознаются одним и тем же антителом. Примечательно, что эпи-топы таких антител могут располагаться в различных антигенных сайтах. Например, антитела Н5М9 взаимодействуют с консервативным эпитопом НА подтипа Н5, который локализуется в рудиментарном эстеразном субдомене поблизости от рецепторсвязы-вающего сайта и частично перекрывает антигенный сайт СЬ [20]. Антитела Н5М9 эффективно защищают мышей от летальных доз различных штаммов подтипа Н5. Антитела НС45 и ВН151 также взаимодействуют с подобным антигенным сайтом (рисунок), однако их способность взаимодействовать с раз-

Таблица 1. Известные антитела к В-клеточным эпитопам НА вирусов гриппа А и В

Антигенный сайт Антитело PDB ID Источник антител Подтип антител Источник антигена Ссылка

Р.с.к. CH65, CH67 3SM5 H. s. IgG1 A/Solomon Islands/3/2006(H1N1) [27, 33]

Р.с.к. CH65 3SM5 H. s. IgG1 A/Solomon Islands/3/2006(H1N1) [27]

Р.с.к. CH67 4HKX H. s. IgG1 A/Solomon Islands/3/2006(H1N1) [33]

Sa-сайт 2D1 3LZF H. s. ? A/South Carolina/1/1918(H1N1) [19]

Р.с.к. 1F1 4GXU H. s. ? A/South Carolina/1/1918(H1N1) [28]

GC0757 4F15 M. m. ? A/California/04/2009(H1N1) [45]

GC0587 4LVH M. m. ? A/California/04/2009(H1N1) [23]

Р.с.к. 5J8 4M5Z H. s. ? A/California/07/2009(H1N1) [26]

Р.э.с. H5M9 4MHH M. m. IgG1 A/Viet Nam/1203/2004 (H5N1) [20]

H5M9 4MHJ A/goose/Guangdong/1/1996(H5N1) [20]

Р.с.к. 8F8 4HF5 H. s. ? A/Japan/305+/1957(H2N2) [29]

Р.с.к. 8M2 4HFU H. s. ? A/Japan/305+/1957(H2N2) [29]

Р.с.к. 2G1 4HG4 H. s. ? A/Japan/305+/1957(H2N2) [29]

Р.э.с. BH151 1EO8 M. m. IgG1 A/X-31(H3N2) [22]

Р.э.с. HC45 1QFU M. m. IgG1 A/X-31(H3N2) [21]

Р.с.к. C05 4FP8 4FQR H. s. ? A/Hong Kong/1/1968(H3N2) [30]

Р.с.к. S139/1 4GMS M. m. IgG2a A/Victoria/3/1975(H3N2) [31]

Р.с.к. F045-092 4O58 H. s. ? A/Victoria/3/1975(H3N2) [32]

Р.с.к. F045-092 4O5I H. s. ? A/Singapore/H2011.447/2011(H3N2) [32]

Р.с.к. HC63 1KEN M. m. ? A/X-31(H3N2) [46]

Р.с.к. HC19 2VIR 2VIS 2VIT M. m. IgG1 A/X-31(H3N2) [47]

IIB4 M. m. ? A/Philippines/2/1982(H3N2) [48]

Fab 26/9 1FRG M. m. IgG2a A/Victoria/3/1975(H3N2) [49]

CR8071 4FQJ H. s. IgG1 B/Florida/4/2006 [44]

CR8059 4FQK H. s. IgG1 B/Brisbane/60/2008 [44]

С.т. FI6v3 3ZTJ H. s. ? A/Aichi/2/1968(H3N2) [42]

FI6v3 3ZTN H. s. ? A/California/04/2009(H1N1) [42]

MAb 3.1 4PY8 H. s. IgG1 A/South Carolina/1/1918(H1N1) [39]

CR6261 3GBN M. m. IgG1 A/Brevig Mission/1/1918(H1N1) [37, 50]

CR6261 3GBM M. m. IgG1 A/Viet Nam/1203/2004(H5N1) [37]

CR8020 3SDY H. s. ? A/Hong Kong/1/1968(H3N2) [40]

F10 3FKU H. s. IgG1 A/Viet Nam/1203/2004(H5N1) [38]

C179 4HLZ M. m. IgG2a A/Japan/305/1957(H2N2) [11, 15, 36]

CR8043 4NM8 H. s. IgG1 A/Hong Kong/1/1968(H3N2) [41]

CR9114 4FQI H. s. IgG1 A/Viet Nam/1203/2004(H5N1) [44]

CR9114 4FQV -//-//- -//-//- A/Netherlands/219/2003(H7N7) [44]

CR9114 4FQY -//-//- A/Hong Kong/1/1968(H3N2) [44]

Fab 39.29 4KVN H. s. ? A/Perth/16/2009(H3N2) [43]

Примечания. Информация о наиболее известных конформационных В-клеточных эпитопах НА вирусов гриппа получена из базы данных иммунологических эпитопов (IEDB - Immune Epitope DataBase and analysis resource; www.iedb.org), а также из базы данных белков (PDB - Protein Data Bank; www.rcsb.org). Синим выделена Hi-подгруппа вирусов гриппа (Hi, H5 и H2), зеленым - Н3-подгруппа, красным - антитела к стержневой части HA различных вирусов гриппа. С.т. - стержневая часть, Р.с.к. - рецепторсвязывающий карман, Р.э.с. - сайт, локализованный в рудиментарном эстеразном субдомене, H. s. - Homo sapiens, M. m. - Mus musculus.

2G1-4HG4

1F1-4GXU

2D1-3LZF

5J8-4M5Z

8F8-4HF5

8M2-4HFU

CH65-3SM5

CH67-4HKX

GC0587-4LVH

GC0757-4F15

H5M9-4MHH

H5M9-4MHJ

C05-4FP8

F045-092-4058

S139/1-4GMS

F045-092-4051

HC19-2VIR

HC63-1KEN

BH151-1EO8 HC45-1QFU

Ml I ■

I I К

И I I

I II I Ml I N1

I «I

I«

•I—p-•I Ml

I— ««■— N —t

1— -и m- W —1

II III

I 11

M

HA

37

87

137

184

234

284

333

■

IHM I-1

»M

379

429

479 ■ ' ■

565

Ш

CR9114-4FQI

CR9114-4FQV

CR9114-4FQY

F10-3FKU

C179-4HLZ

MAb 3.1-4PY8

FI6v3-3ZTN

CR6261-3GBM

Fab 39.29-4KVN

FI6v3-3ZTJ

CR6261-3GBN

CR8043-4NM8

CR8020-3SDY

» I I

I-

I-1-

I-1

• •

I «MM -•—МММ i—HIM

I—HIM

• mm

I mm

-I—mm

•—mm*

I—IWH

I mm

NIM

HI

Схематичное расположение В-клеточных эпитопов на аминокислотной последовательности гемагглютинина НА. Рисунок получен с использованием программного обеспечения Geneious 9.0.2 следующим образом: аминокислотные последовательности гемагглютининов вирусов гриппа, распознающиеся соответствующими антителами (табл. 1), выровнены друг относительно друга, на каждой последовательности картирован эпитоп, распознающийся соответствующим антителом. Информация о В-клеточных эпитопах НА получена из базы данных иммунологических эпитопов. В центре представлен НА с расположенными на нем элементами. Снизу вверх представлены цепи HA1 и HA2 (зеленые), а-спирали (розовые), антигенные сайты - Cb (желтые), Ca1 (фиолетовые), Ca2 (голубые), Sa (серые), Sb (зеленые). Над и под HA показана локализация В-клеточных эпитопов НА вирусов гриппа А (см. табл. 1): сверху эпитопы к глобулярной части HA, подгруппы H1 (темно-синие), подгруппы H3 (темно-зеленые); снизу эпитопы к стержневой части HA (темно-красные). Антигенные сайты картированы согласно A.J. Caton [51]

личными штаммами не определена [21, 22]. Такие антитела, как GC0757 и GC0587, взаимодействуют с одним и тем же эпитопом, расположенным в глобулярной части НА, и распознают различные штаммы подтипа Н1 [23]. Эти антитела взаимодействуют с неизвестным ранее эпитопом, который не располагается в известных антигенных сайтах [23].

Группа других антител, взаимодействующих с несколькими штаммами вируса гриппа, распознает ре-

цепторсвязывающий сайт в глобулярной части НА. Поскольку рецепторсвязывающийся сайт функционально консервативен, его аминокислотное разнообразие ограничено, и он рассматривается в качестве привлекательной мишени для антител широкого спектра действия [24].

Рецепторсвязывающий сайт представляет собой широкий, неглубокий карман, локализованный в верхней части глобулярного домена. Границы ре-

цепторсвязывающего сайта формируют петли 130, 150, 220 и а-спираль 190, которые обозначают позиции в аминокислотной последовательности НА [25]. Структурная характеристика нескольких антител, связанных с рецепторсвязывающим сайтом, показала, что все антитела встраивают вариабельную петлю в рецепторсвязывающий сайт и таким образом прямо блокируют взаимодействие НА с клеточными сиаловыми кислотами [26-32]. Однако из-за компактности этого сайта большинство антител встраиваются только с помощью одной петли, и лишь некоторые антитела взаимодействуют двумя петлями. Поскольку сайт связывания с рецептором находится в глобулярной части НА, это не создает стерических преград для формирования антител к этому антигенному сайту.

Антитела получены от людей, перенесших пандемию гриппа 1918 года. Эти антитела способны ингибировать некоторые штаммы вируса гриппа А подтипа Н1: изоляты 1918, 1943, 1947 и 1977 годов [28]. Изучение кристаллической структуры этих антител в комплексе с НА вируса гриппа 1918 года показало, что они взаимодействуют с аминокислотными остатками, принадлежащими к антигенным сайтам Sa, Sb и Са2. Тяжелая цепь антитела №1 также контактирует с рецепторсвязывающим сайтом, взаимодействуя с аминокислотными остатками, принимающими участие в связывании сиаловых кислот.

Антитела СН65 и СН67 связывают и нейтрализуют вирусы гриппа подтипа Н1, которые циркулируют в человеческой популяции начиная с 1986 года [27, 33]. Однако эти антитела не обладают активностью против пандемического вируса гриппа Н1 2009 года. Антитела 5J8 активны против НА подтипов Н1 как пандемических вирусов гриппа 1918 и 2009 годов, так и против сезонных вирусов гриппа А. Исследование кристаллической структуры антител СН65, СН67 и 5J8 в комплексе с НА обнаружило, что все они распознают эпитопы возле рецептор-связывающего сайта и встраивают их HCDR3-петлю в рецепторсвязывающий карман.

Вирусы подтипа ^N2 циркулировали в человеческой популяции в течение 11 лет, с 1957 по 1968 год. Вследствие длительного отсутствия этих вирусов иммунитет у населения значительно снизился, а у лиц, родившихся после 1968 года, полностью отсутствует, поэтому вероятность возвращения вирусов этого подтипа очень высока, что, несомненно, вызывает беспокойство. С помощью гибридомной технологии от доноров были получены антитела к подтипу ^N2 - 8F8, 8М2 и 2G1, которые распознают и нейтрализуют все подтипы НА Н2, начиная с 1957 до 1968 года [29]. Анализ кристаллической структуры этих антител в комплексе с НА показал,

что они распознают рецепторсвязывающий карман. Антитела 8F8 встраивают их HCDR3-петлю в рецеп-торсвязывающий карман, тогда как антитела 8М2 и 2G1 - в HCDR2-петлю [29].

Описанные антитела к рецепторсвязывающему карману НА свидетельствуют о том, что этот участок глобулярной части НА более консервативен, чем такие антигенные сайты, как Sa или Sb, однако антитела к этому участку не способны распознавать НА различных подтипов. Тем не менее найдены антитела, распознающие рецепторсвязывающий карман и способные к гетеросубтипическому распознаванию НА.

Антитела С05 и S139/1 обладают гетеросубти-пической активностью и могут связываться со множеством подтипов вируса гриппа, включая Н1, Н2 и Н3 [30, 31]. Антитела S139/1 получены от мышей, иммунизированных вирусом ^N2. Это первые ге-теросубтипические антитела, которые распознают рецепторсвязывающий карман, взаимодействуя с НА подтипов Н1, Н2, Н3, Н5, Н9 и Н13 [34]. В результате анализа кристаллической структуры этих антител в комплексе с НА установлено, что они взаимодействуют с рецепторсвязывающим пакетом при помощи петли HCDR2 [31]. Изучение связывания и нейтрализации вируса подтвердило, что антитела S139/1 действительно имеют гетеросубтипическую активность, хотя и с узкой специфичностью в пределах одного подтипа. Тем не менее эти результаты позволяют предположить, что разные штаммы разных подтипов вируса гриппа А могут содержать похожий эпитоп в рецепторсвязывающем сайте.

Другие антитела - С05 - найдены при помощи фаговой библиотеки, полученной на основе клеток, выделенных от лиц, зараженных сезонным вирусом гриппа [30]. С05 оказывают нейтрализующее действие в отношении вирусов Н1, Н2, Н3 и Н9 и имеют большую широту распознавания внутри этих подтипов по сравнению с S139/1-антителами. В отличие от других описанных ранее антител, распознающих рецепторсвязывающий карман, С05 связывают НА исключительно при помощи тяжелой цепи. Основное взаимодействие опосредуется только длинной HCDR3-петлей, которая проникает в рецепторсвя-зывающий карман. Эпитоп к этим антителам на поверхности НА является очень компактным.

Еще одни антитела с широким гетеросубтипиче-ским распознаванием - F045-092, также получены с помощью фаговой библиотеки на основе клеток, выделенных от доноров. Они способны распознавать и нейтрализовать различные штаммы вируса гриппа подтипов Н1, Н2, Н3 и Н5 [35]. Анализ кристаллической структуры антител F045-092 в комплексе с НА показал, что они встраивают HCDR3-петлю в рецеп-

Таблица 2. Взаимодействие моноклональных антител, специфичных к стержневой части НА, с различными подтипами вирусов гриппа А

Групповая классификация вирусов гриппа

Моноклональное антитело

С179

Е10

CR6261

МАЬ 3.1 CR8020 CR8043

ЕаЬ 39.29

FI6v3*

CR9114**

Н9

Н8

Н12

Н6

Н1

Н2

Н5

Н11

Н13

Н16

Н3

Н4

Н14

Н10

Н7

Н15

Примечания. «+» - нейтрализация вируса гриппа, «-» - не выявлено взаимодействие с НА, «н.т.» - не тестировали. Красным показана группа Н1 вирусов гриппа, зеленым - группа Н3.

*Антитела FI6v3 взаимодействуют с другими подтипами НА, но нейтрализация вируса не исследована. **CR9114 взаимодействуют с вирусом гриппа В, но не нейтрализуют его.

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

торсвязывающий карман, причем карбоксильная группа аспартата на верхушке распознающей петли мимикрирует карбоксильную группу сиаловых кислот [32]. Вероятно, благодаря рецепторной мимикрии достигается большая широта распознавания различных подтипов вируса гриппа А.

АНТИТЕЛА К СТЕРЖНЕВОЙ ЧАСТИ МОЛЕКУЛЫ HA

Первоначально описанные антигенные сайты располагались только на глобулярном домене НА, и какое-то время была распространена точка зрения, согласно которой стержневой регион считался недоступным для гуморального иммунного ответа. Однако уже в 1993 году были описаны антитела С179, полученные в мышах, иммунизированных вирусом гриппа Н2^, и способные нейтрализовать НА подтипов Н1, Н2 и Н5 [11, 14]. В отличие от антител к глобулярной части, эти антитела блокировали конформа-ционные перестройки НА при низком значении рН, подавляя таким образом его функции. Спустя 20 лет после открытия антител С179 установили их кристаллическую структуру в комплексе с НА подтипа Н5. Анализ этого комплекса показал, что антитела взаимодействуют с НА при помощи как тяжелых, так и легких цепей [36].

Спустя 15 лет после открытия антител С179 были описаны еще несколько антител к стержневой части НА. Изучение структуры двух таких антител человека - СИ6261 [37] и П0 [38] - в комплексе с НА показало, что они взаимодействуют с высококонсервативным эпитопом в стержневой части, общим среди НА первой группы (табл. 2). Оба антитела взаимодействуют с НА только с помощью тяжелых цепей, вставляя петлю HCDR2 в гидрофобный карман.

Другие моноклональные гетеросубтипические антитела (МАЬ 3.1) были получены от доноров с использованием фаговой библиотеки. Антитела МАЬ 3.1 способны нейтрализовать вирусы гриппа подгруппы Н1а (Н1, Н2, Н5 и Н6), но имеют слабую нейтрализующую активность против подгруппы Н1Ь (Н13, Н16 и Н11) [39]. Подобно другим гетеросубтипическим антигриппозным антителам CR6261 и П0, МАЬ 3.1 контактируют со стержневой частью НА, используя только тяжелую цепь, однако у МАЬ 3.1 в отличие от них во взаимодействии участвуют петли HCDR1 и HCDR3.

Найдены также антитела, которые взаимодействуют исключительно со второй группой НА. Так, например, антитела CR8020, выделенные от здорового донора, связывают высококонсервативный эпи-топ стержневой части НА и проявляют нейтрализу-

ющую активность против вирусов H3, H7 и H10 [39]. Позднее были получены другие антитела, CR8043, которые, в отличие от CR8020, кодируются другими генными сегментами [40]. В опытах in vitro CR8043 проявляли нейтрализующую активность против подтипов H3 и H10 вируса гриппа и защищали мышей от летальной дозы вирусов H3N2 и H7N7 [41]. Антитела CR8020 и CR8043 связывают схожие эпи-топы, но с HA взаимодействуют по-разному. Оба антитела взаимодействуют как с легкими, так и с тяжелыми цепями HA. Подобно антителам, связывающим первую группу HA, антитела CR8020 и CR8043 также взаимодействуют со стержневой частью молекулы HA и предотвращают его конформационные изменения при низких значениях pH. Эти антитела также ингибируют процесс созревания HA, блокируя протеолитическое расщепление незрелого предшественника HA0 на субъединицы HA1 и HA2. Таким образом, обнаруженные и структурно охарактеризованные эпитопы к этим антителам представляют собой второе уязвимое место на стержневой части молекулы HA.

Описаны моноклональные антитела, обладающие гетеросубтипической активностью как против первой (H1), так и против второй (H3) группы вирусов гриппа А. В 2011 году впервые охарактеризовали подобные пангетеросубтипические антитела FI6v3, выделенные из библиотеки, состоящей из 104 000 плазматических клеток, полученных от восьми доноров, при помощи метода культивирования единичных клеток [42]. Антитела FI6v3 обладали вируснейтра-лизующей активностью против вирусов обеих групп и ингибировали формирование синцития в культуре клеток. Подобные им Fab-фрагменты моноклональ-ных антител Fab 39.29 получены с помощью метода «in vitro активирования и обогащения антигенспеци-фическим способом» 840 плазмобластов вакцинированных индивидов [43].

Еще одни пангетеросубтипические антитела CR9114 связывают консервативный эпитоп на стержневой части HA и в тестах нейтрализации проявляют активность против всех проверяемых штаммов вируса гриппа А [44]. Более того, эти антитела способны взаимодействовать с вирусом гриппа В, однако в опытах in vitro нейтрализация вируса гриппа В не была выявлена, по крайней мере в тестируемых концентрациях. Таким образом, в настоящее время антитела CR9114 являются антителами с самой широкой специфичностью из всех изученных монокло-нальных антител к HA вирусов гриппа А.

Найдены также гетеросубтипические антитела к вирусам гриппа В. В частности, антитела CR8059 и CR8071 способны нейтрализовать вирусы гриппа В обеих линий [44].

Возможность получения однодоменных антител с перекрестной нейтрализующей активностью впервые показана в отношении подтипов H1, H2, H5, H9 вируса гриппа. Четыре перекрестно нейтрализующих антитела (R2b-E8, R2b-D9, R1a-A5 и R1a-B6) связывались с HA полной длины, но не с доменом НА1, а также утрачивали связь с НА при низком рН. Эти антитела связываются с эпитопами в мембранной проксимальной области стержня НА вдали от сайта связывания рецептора. Подобный механизм перекрестной нейтрализации описан для моноклональных антител F10 человека и CR6261. Одно из антител (R2a-G8) связывается с частью домена НА1, который находится в области стержня НА [18].

На основании сказанного по широте распознавания все антитела можно классифицировать на четыре группы.

1) Антитела к глобулярной части, распознающие один или небольшое количество штаммов в пределах одного подтипа HA (2D1).

2) Антитела к глобулярной части, распознающие большое количество штаммов или все штаммы в пределах одного подтипа HA (H5M9, HC45, BH151, 8F8, 8M2, 2G1 и др.).

3) Антитела к глобулярной части, способные распознавать несколько штаммов различных подтипов HA (C05 и S139/1).

4) Антитела к стержневой части, достигающие выраженной гетеросубтипической активности (C179, F10, CR6261, CR8020, FI6v3, MAb 3.1, CR8043, Fab 39.29, CR9114).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Возникающие время от времени эпидемические вспышки гриппа в вакцинированных популяциях безусловно свидетельствуют о необходимости продолжения поиска средств экстренной профилактики, а также лечения этого заболевания. Особую важность при этом приобретают средства защиты от пандемических штаммов вируса гриппа.

Для экстренной профилактики гриппа, вызываемого вирусом, изменчивым в отношении главного антигена - гемагглютинина, наиболее интересной представляется идея разработки препаратов широкого спектра действия, способных нейтрализовать вирусы гриппа разных подтипов.

В данной работе рассмотрена возможность распознавания различных В-клеточных эпитопов НА нейтрализующими антителами широкого спектра действия, что весьма актуально в связи с эволюцией вирусов гриппа.

В результате компьютерного анализа известных конформационных В-клеточных эпитопов НА виру-

сов гриппа показано, что мишенью при поиске и создании антител широкого спектра действия к вирусу гриппа является стержневая часть молекулы НА, антитела к которой обладают выраженной гетеро-субтипической активностью. Из всех полученных и исследованных к настоящему времени монокло-нальных антител к НА вирусов гриппа А самую широкую перекрестную нейтрализующую активность проявляют антитела CR9114. Найдены также гетеро-

субтипические антитела CR8059 и CR8071 к вирусам гриппа типа В.

Полученные данные свидетельствуют о возможности получения препаратов широкого спектра действия для экстренной профилактики и лечения гриппа с применением моноклональных или одно-доменных антител, нейтрализующих определенные В-клеточные эпитопы в стержневой части НА вируса гриппа.»

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Webster R.G., Govorkova E.A. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2014. V. 1323. P. 115-139.

2. Murphy B.R., Webster R.G. Orthomyxoviruses. Virology. 2nd ed. / Eds Fields B.N., Knipe D.M.. N.Y.: Raven Press, 1990. P. 1091-1152.

3. Kilbourne E.D. Influenza. N.Y.: Plenum Publ. Co., 1987.

4. Webster R.G., Bean W.G., Gorman O.T., Chambers T.M., Kawaoka Y. // Microbiol. Rev. 1992. V. 56. P. 152-179.

5. Kilbourne E.D. // Nat. Medicine. 1999. V. 5. P. 1119-1120.

6. Wiley D.C., Skehel J.J. // Ann. Rev. Biochem. 1987. V. 56. P. 365-394.

7. Graves P.N., Schulman J.L., Yong J.F., Palese P. // Virology. 1983. V. 126. P. 106-116.

8. Laver W.G., Air G.M., Dopheide T. A., Ward C.W. // Nature. 1980. V. 283. P. 454-457.

9. Raymond E.L., Caton A.J., Cox N.J., Kendal A.P., Brownlee G.G. // Virology. 1986. V. 148. P. 275-287.

10. Verhoeyen M., Fang R., Min Jou W., Devos R., Huylebroeek D., Saman E., Fiers W. // Nature. 1980. V. 286. P. 771-776.

11. Okuno Y., Isegawa Y., Sasao F., Ueda S. // J. Virol. 1993. V. 67. № 5. P. 2552-2558.

12. Air G.M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V. 78. P. 76397643.

13. Nobusawa E., Aoyama T., Kato H., Suzuki Y., Tateno Y., Nakajima K. // Virology. 1991. V. 182. P. 475-485.

14. Смирнов Ю.А., Липатов А.С., Окуно И., Гительман А.К. // Вопросы вирусологии. 1999. Т. 44. С. 111-115.

15. Smirnov Y.A., Lipatov A.S., Gitelman A.K., Okuno Y., van Beek R., Osterhaus A.D., Claas E.C. // Acta Virologica. 1999. V. 43. P. 237-244.

16. Ibanez L.I., De Filette M., Hultberg A., Verrips T., Temperton N., Weiss R.A., Vandevelde W., Schepens B., Vanlandschoot P., Saelens X. // J. Infect. Dis. 2011. V. 203. № 8. P. 1063-1072.

17. Tutykhina I.L., Sedova E.S., Gribova I.Y., Ivanova T.I., Vasilev L.A., Rutovskaya M.V., Lysenko A.A., Shmarov M.M., Logunov D.Y., Naroditsky B.S., et al. // Antiviral Res. 2013. V. 97. № 3. P. 318-328.

18. Hufton S.E., Risley P., Ball C.R., Major D., Engelhardt O.G., Poole S. // PLoS One. 2014. V. 9. № 8. P. e103294.

19. Xu R., Ekiert D.C., Krause J.C., Hai R., Crowe J.E.Jr., Wilson I.A. // Science. 2010. V. 328. № 5976. P. 357-360.

20. Zhu X., Guo Y.H., Jiang T., Wang Y.D., Chan K.H., Li X.F., Yu W., McBride R., Paulson J.C., Yuen K.Y., et al. // J. Virol. 2013. V. 87. № 23. P. 12619-12635.

21. Fleury D., Barrere B., Bizebard T., Daniels R.S., Skehel J.J., Knossow M. // Nat. Struct. Biol. 1999. V. 6. № 6. P. 530-534.

22. Fleury D., Daniels R.S., Skehel J.J., Knossow M., Bizebard T. // Proteins. 2000. V. 40. № 4. P. 572-578.

23. Cho K.J., Hong K.W., Kim S.H., Seok J.H., Kim S., Lee J.H., Saelens X., Kim K.H. // PLoS One. 2014. V. 9. № 2. P. e89803.

24. Martin J., Wharton S.A., Lin Y.P., Takemoto D.K., Skehel J.J., Wiley D.C., Steinhauer D.A. // Virology. 1998. V. 241. № 1. P. 101-111.

25. Skehel J. J., Wiley D.C. // Annu. Rev. Biochem. 2000. V. 69. P. 531-569.

26. Hong M., Lee P.S., Hoffman R.M., Zhu X., Krause J.C., Laursen N.S., Yoon S.I., Song L., Tussey L., Crowe J.E., et al. // J. Virol. 2013. V. 87. № 22. P. 12471-12480.

27. Whittle J.R., Zhang R., Khurana S., King L.R., Manischewitz J., Golding H., Dormitzer P.R., Haynes B.F., Walter E.B., Moody M.A., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011. V. 108. № 34.

P. 14216-14221.

28. Tsibane T., Ekiert D.C., Krause J.C., Martinez O., Crowe J.E., Wilson I.A., Basler C.F. // PLoS Pathog. 2012. V. 8. № 12. P. e1003067.

29. Xu R., Krause J.C., McBride R., Paulson J.C., Crowe J.E. Jr., Wilson I.A. // Nat. Struct. Mol. Biol. 2013. V. 20. № 3. P. 363-370.

30. Ekiert D.C., Kashyap A.K., Steel J., Rubrum A., Bhabha G., Khayat R., Lee J.H., Dillon M.A., O'Neil R.E., Faynboym A.M., et al. // Nature. 2012. V. 489. № 7417. P. 526-532.

31. Lee P.S., Yoshida R., Ekiert D.C., Sakai N., Suzuki Y., Takada A., Wilson I.A. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012. V. 109. № 42. P. 17040-17045.

32. Lee P.S., Ohshima N., Stanfield R.L., Yu W., Iba Y., Okuno Y., Kurosawa Y., Wilson I.A. // Nat. Commun. 2014. V. 5. P. 3614.

33. Schmidt A.G., Xu H., Khan A.R., O'Donnell T., Khurana S., King L.R., Manischewitz J., Golding H., Suphaphiphat P., Carfi A., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013. V. 110. № 1. P. 264-269.

34. Yoshida R., Igarashi M., Ozaki H., Kishida N., Tomabechi D., Kida H., Ito K., Takada A. // PLoS Pathog. 2009. V. 5. № 3. P. e1000350.

35. Ohshima N., Iba Y., Kubota-Koketsu R., Asano Y., Okuno Y., Kurosawa Y. // J. Virol. 2011. V. 85. № 21. P. 11048-11057.

36. Dreyfus C., Ekiert D.C., Wilson I.A. // J. Virol. 2013. V. 87. № 12. P. 7149-7154.

37. Ekiert D.C., Bhabha G., Elsliger M.A., Friesen R.H., Jongeneelen M., Throsby M., Goudsmit J., Wilson I.A. // Science. 2009. V. 324. № 5924. P. 246-251.

38. Sui J., Hwang W.C., Perez S., Wei G., Aird D., Chen L.M., Santelli E., Stec B., Cadwell G., Ali M., et al. // Nat. Struct. Mol. Biol. 2009. V. 16. № 3. P. 265-273.

39. Wyrzucki A., Dreyfus C., Kohler I., Steck M., Wilson I.A., Hangartner L. // J. Virol. 2014. V. 88. № 12. P. 7083-7092.

40. Ekiert D.C., Friesen R.H., Bhabha G., Kwaks T., Jongeneelen M., Yu W., Ophorst C., Cox F., Korse H.J., Brandenburg B., et al. // Science. 2011. V. 333. № 6044. P. 843-850.

41. Friesen R.H., Lee P.S., Stoop E.J., Hoffman R.M., Ekiert D.C., Bhabha G., Yu W., Juraszek J., Koudstaal W., Jongeneelen M., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2014. V. 111. № 1. P. 445-450.

42. Corti D., Voss J., Gamblin S.J., Codoni G., Macagno A., Jar-rossay D., Vachieri S.G., Pinna D., Minola A., Vanzetta F., et al. // Science. 2011. V. 333. № 6044. P. 850-856.

43. Nakamura G., Chai N., Park S., Chiang N., Lin Z., Chiu H., Fong R., Yan D., Kim J., Zhang J., et al. // Cell Host Microbe. 2013. V. 14. № 1. P. 93-103.

44. Dreyfus C., Laursen N.S., Kwaks T., Zuijdgeest D., Khayat R., Ekiert D.C., Lee J.H., Metlagel Z., Bujny M.V., Jongeneelen M., et al. // Science. 2012. V. 337. № 6100. P. 1343-1348.

45. Cho K.J., Lee J.H., Hong K.W., Kim S.H., Park Y., Lee J.Y., Kang S., Kim S., Yang J.H., Kim E.K., et al. // J. Gen. Virol. 2013. V. 94. P. 1712-1722.

46. Barbey-Martin C., Gigant B., Bizebard T., Calder L.J., Wharton S.A., Skehel J.J., Knossow M. // Virology. 2002. V. 294. № 1. P. 70-74.

47. Fleury D., Wharton S.A., Skehel J.J., Knossow M., Bizebard T. // Nat. Struct. Biol. 1998. V. 5. № 2. P. 119-123.

48. Kostolansky F., Vareckova E., Betakova T., Mucha V., Russ G., Wharton S.A. // J. Gen. Virol. 2000. V. 81. P. 1727-1735.

49. Churchill M.E., Stura E.A., Pinilla C., Appel J.R., Houghten R.A., Kono D.H., Balderas R.S., Fieser G.G., Schulze-Gahmen U., Wilson I.A. // J. Mol. Biol. 1994. V. 241. № 4. P. 534-556.

50. Throsby M., van den Brink E., Jongeneelen M., Poon L.L., Alard P., Cornelissen L., Bakker A., Cox F., van Deventer E., Guan Y., et al. // PLoS One. 2008. V. 3. № 12. P. e3942.

51. Caton A.J., Brownlee G.G., Yewdell J.W., Gerhard W. // Cell. 1982. V. 31. P. 417-427.