CC BY
59
Перейти в содержание Вестника РНЦРР МЗ РФ N14. Текущий раздел: Молекулярная медицина
Анализ экспрессии цитокератина-19 в лимфатических узлах для верификации метастазов рака молочной железы.
Троценко И.Д.1'2, Тащян А.А.1, Запиров Г.М.2, Широких И.М.2,Кудинова Е.А.1, Боженко В.К.1, Солодкий В.А.1
1 ФГБУ Российский Научный Центр Рентгенорадиологии (РНЦРР) Минздрава РФ, 117997, Москва, ГСП-7, ул. Профсоюзная, д. 86, ФГБУ «РНЦРР» МЗ РФ
2 ФГБУ ВПО Российский Университет Дружбы Народов (РУДН), 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6
Полный текст статьи в PDF: http://vestnik.rncrr.ru/vestnik/v14/papers/bozhenko v14.pdf Адрес документа для ссылки: http://vestnik.rncrr.ru/vestnik/v14/papers/bozhenko_v14.htm Статья опубликована 25 декабря 2014 года.
Троценко Иван Дмитриевич* - к.м.н., ассистент кафедры онкологии и рентгенорадиологии РУДН, научный сотрудник лаборатории иммунологии, онкоцитологии и клеточной терапии в онкологии ФГБУ «РНЦРР» Минздрава России; Тащян Агван Александрович - заведующий дневным хирургическим стационаром РНЦРР;
Запиров Мурад Магомедович - к.м.н., доцент кафедры онкологии и рентгенорадиологии РУДН;
Широких Ирина Михайловна - ординатор кафедры онкологии и рентгенорадиологии РУДН;
Кудинова Елена Александровна - к.м.н.,заведующая клинико-диагностической лабораторией ФГБУ «РНЦРР» Минздрава России;
Боженко Владимир Константинович - д.м.н., профессор, руководитель отдела молекулярной биологии и экспериментальной терапии опухолей ФГБУ «РНЦРР» Минздрава России;
Солодкий Владимир Алексеевич - д.м.н., профессор, чл.корр.РАМН, директор ФГБУ «РНЦРР» Минздрава России.
* Контактное лицо: Троценко Иван Дмитриевич, +7 (495) 434 5300, trotsenkoivan@mail.ru
Резюме
Цель исследования: метастатическое поражение (МТС) регионарных лимфатических узлов (ЛУ) при раке молочной железы (РМЖ) является одним из важнейших прогностических признаков. Целью исследования было повышение чувствительности и специфичности обнаружения МТС при РМЖ на основе использования молекулярных маркеров, в частности анализа экспрессии мРНК цитокератина-19 (CK-19) в ткани ЛУ.
Материалы и методы: проведен анализ уровня экспрессии CK-19 в 130 лимфоузлах, полученных от больных РМЖ I-III стадии. В 48% (n=62) лимфатических узлов метастазы были морфологически подтверждены (N+). Для анализа уровня экспрессии мРНК CK-19 использовалась РВ-ПЦР.
Результаты: уровень экспрессии CK-19 в метастатических лимфоузлах значительно превышал таковой в образцах лимфоузлов без метастазов (р=0,00001). Чувствительность и специфичность метода составила 97% и 92%, соответственно.
Заключение: Метод обнаружения мРНК с помощью РВ-ПЦР CK-19 обладает достаточной чувствительностью и специфичностью для верификации метастазов в ЛУ при РМЖ. Ключевые слова: рак молочной железы, цитокератин-19, метастазы, лимфоузлы.
Cytokeratin-19 expression in breast cancer metastatic lymph nodes
12 1 2 2 2 Trotsenko I.D. ' , Tashyan A.A. , Zapirov G.M. , Shirokih M.V. , Kudinova E.A. , Bozhenko
V.K.2, Solodky V.A.2
1 Federal State Budget Establishment Russian Scientific Center of Roentgenoradiology (RSCRR) of Ministry of Health and Social Development of Russian Federation, Moscow
Address: 117997 Moscow, Profsoyuznaya str., 86, Russian Scientific Center of Roentgenoradiology.
2 Peoples' Friendship University of Russia, Moscow Address: 117198, Moscow, Moscow Miklukho-Maklaya str. 6, For correspondence:
Trotsenko I.D. - e-mail: trotsenkoivan@mail.ru
Summary
Abstract: Lymph mode (LN) metastases are one of the most prominent prognostic factors in breast cancer (BC). Expression analysis of specific metastatic molecular markers, in particular cytokeratin-19, makes diagnostic procedure more objective and reproducible in comparison with routine morphological examination.
Materials and methods: we analyzed expression level of cytokeratin-19 mRNA in 130 breast cancer lymph nodes. Metastases (MTS) in LN were morphologically proven in 48% (n=62) of cases. Real-time PCR has been used for CK-19 expression analysis.
Results: CK-19 expression level was significantly higher in metastatic lymph nodes as compared to non-metastatic (p=0,00001). Sensitivity and specificity were 97% and 92%, respectively. Conclusion: Sensitivity and specificity of CK-19 expression is sufficient for lymph nodes metastases verification in clinical practice.
Key words: breast cancer, cytokeratine-19, lymph node metastasesKey words: breast cancer, cytokeratine-19, lymph node metastases.
Оглавление: Введение
Материалы и методы Результаты Обсуждение Список литературы
Введение
Метастатическое поражение регионарных лимфоузлов (ЛУ) при раке молочной железы (РМЖ) является наиболее значимым фактором прогноза (Goldstein, Lori, 2004; Soerjomataram et al., 2008). Поэтому вопрос точной и детальной диагностики регионарных метастазов имеет принципиальное значение. На сегодняшний день морфологическое и иммуногистохимическое исследование позволяет с достаточной точностью диагностировать метастазы в регионарных ЛУ у больных РМЖ, однако подобный комбинированный подход является трудоемким, требует значительного времени, а результат не всегда объективен. Техника выявления метастазов требует высокого профессионализма патоморфолога и усложняет исследование. Многими авторами была продемонстрирована закономерность между количеством исследованных срезов лимфоузла и вероятностью обнаружения метастаза. В таблице 1 приведены результаты некоторых подобных исследований.
Таблица 1. Вероятность обнаружения метастаза в зависимости от объема исследования лимфоузла
Автор, Год Изменение кол-ва срезов Повышение частоты верификаии метастаза (%)
Treseler, 2000 Мультидисциплинарный обзор 9-33
Yared, 2002 Один срез 5-мкм и 10 срезов 5-мкм 10
Ьш, 2000 1 срез и 3 среза (гематоксилин-эозин (ГЭ) и ИГХ) 19
СБегш, 2002 5 срезов по мкм (через каждые 50-100 мкм) и анализ всех срезов ЛУ в пределах 250 мкм 19-28
Раг§аопкаг, 2003 Один срез 5 мкм и 2 ГЭ и 3 ИГХ среза толщиной 5 мкм 8
МоЮшига, 2002 Один срез 5 мкм и 1 срез ГЭ через каждые 2 мм с дополнительным ИГХ исследованием 3-16
Огоеп, 2007 1 срез для половины лимфоузла и 3 среза через каждые 150 мкм половины лимфоузла 12.5
Результаты, представленные в таблице, на наш взгляд, демонстрируют два существенных недостатка морфологического подхода к проблеме верификации метастазов. Во-первых, необходимость анализа большего, чем рутинно, объема ткани с использованием нескольких методик окраски увеличивает продолжительность и стоимость анализа. Во-вторых, у разных авторов повышение специфичности варьирует от 8 до 33%, что может свидетельствовать о значительном влиянии субъективного фактора (профессионализма) на результаты. Вероятно, сочетание этих двух обстоятельств является причиной дискуссий вокруг прогностического значения микрометастазов в лимфатических узлах. В качестве возможного дополнения к патоморфологическому исследованию могут быть использованы молекулярные методы диагностики. Одним из таких подходов является количественное определение мРНК специфических маркеров метастазов в ткани лимфатического узла методом ПРЦ в реальном времени (РВ-ПЦР) (ОШапёеге й а1., 2004; М1кЫ1апап е! а1., 2005, Боженко и др., 2010). К преимуществам метода можно отнести объективность автоматизированной оценки результата и возможность одновременного анализа большого количества образцов. Наиболее перспективным маркером является эпителиальный маркер - цитокератин-19 (СК-19), характеризующийся низким, практически нулевым уровнем экспрессии в лимфоидной ткани и высоким уровнем экспрессии мРНК в эпителиальной ткани и, в частности, в ткани РМЖ. В 1994 году ЗсЬоепГеЫ с коллегами опубликовал первое сообщение, в котором указывал, что СК-19 позволяет с достаточной чувствительностью и специфичностью определять клетки
метастазов рака молочной железы в лимфоузлах (Schoenfeld rt al., 1994). Предложенный авторами алгоритм определения экспрессии CK-19, включавший ОТ-ПЦР с последующей детекцией гель-электрофорезом, превосходил по своей чувствительности ИГХ исследование. Noguchi с коллегами установил, что анализ экспрессии генов CK-19 и MUC-1 методом РВ-ПЦР в экспериментальной модели позволяет определить 10-6 и 10-5 клеток, соответственно (Noguchi et al., 1996). В группе из 56 пациентов экспрессия CK-19 и MUC-1 была определена в 7 морфологически интактных лимфоузлах, в одном метастатическом лимфоузле, по данным гистологического исследования, экспрессия не выявлена. Оба этих исследования, также как и ряд последующих (Mori M., 1995; Bostick P.J., 1998; Min C.J., 1998; Aihara T., 1999; Masuda N., 2000) доказывают, что чувствительность молекулярно-биологического анализа может быть выше, чем чувствительность гистологической оценки.
Однако открытым остается вопрос о чувствительности и специфичности метода и определение пограничного значения уровня экспрессии CK-19 в образце, превышение которого свидетельствует о наличии метастаза. Мы попытались разработать метод для диагностики метастазов РМЖ в лимфатический узел на основе количественного определения экспрессии CK-19 методом РВ-ПЦР и определить его диагностические характеристики.
Материалы и методы
Всего было исследовано 130 лимфоузлов, полученных от больных раком молочной железы I-III стадии. В 48% (n=62) лимфатических узлов метастазы были морфологически подтверждены. В оставшихся 68 ЛУ по результатам морфологического исследования метастазов обнаружено не было.
Для выделения мРНК с каждого блока готовился один срез толщиной 10 мкм. Выделение РНК из приготовленного среза проводили с использованием наборов Qiagen FFPE kit (США, cat.№74404) по протоколу производителя. После выделения мРНК немедленно выполнялась обратная транскрипция (ОТ) или образцы РНК хранились при температуре -70 оС. Для ОТ использовались специфические праймеры и реагенты производства НПО "ДНК-Технология". Для количественной оценки мРНК-транскриптов выполнялась ПЦР в реальном времени (РВ-ПЦР), реакция проводилась также с использованием реагентов, праймеров и зондов производства НПО "ДНК-Технология". Уровень экспрессии CK-19 в образце определялся относительно референсного гена HPRT. Использовали программу с 50 циклами ПЦР, температура отжига составляла 64Со. В таблице 2 представлены последовательности использованных праймеров и зондов.
Таблица 2. Последовательности праймеров и зондов исследуемых генов
Ген Праймер/зонд
Ж-19 Прямой - СТАСАОССАСТАСТАСАСОАС
Обратный - САОАОССТОТТССОТСТСААА
Зонд - САССАТТОАОААСТССАООАТТОТ
HPRT Прямой - ССТООСОТСОТОАТТАОТОАТ
Обратный - АОАСОТТСАОТССТОТССАТАА
Зонд - АССАОТСААСАООООАСАТАА
Статистический анализ проводили с использованием параметрических и непараметрических методов статистики, а также анализа ЯОС-кривой для определения чувствительности и специфичности метода.
Результаты
Из 130 включенных в исследование больных метастазы в регионарных ЛУ были обнаружены в 48% случаях (п=62). В остальных 68 случаях (52%) метастазы в ЛУ обнаружены не были (N0). На рисунке 1 представлена типичная морфологическая картина препарата, полученного из ЛУ без метастаза (А) и ЛУ при метастатическом поражении (Б).
А Б
Рисунок 1. Гистологическая картина лимфоузла:
(А) - гистологическая картина лимфатического узла без метастаза. Окраска гематоксилин-эозином, х80;
(Б) - гистологическая картина метастаза РМЖ в лимфоузел. Окраска гематоксилин-эозином, х200
В таблице 3 представлены основные клинико-морфологические характеристики пациентов, включенных в исследование.
Таблица 3. Клинико-морфологическая характеристика исследованных групп
Признак N0 Р
Средний возраст 52,2±11,8 53,2±10,8 0,66
Размер опухоли (Т)
Т1 15 (22%) 22 (35,4%) 0,32
Т2 51 (75%) 37 (59,6%)
Т3 2 (3%) 1 (2%)
Т4 0 2 (3%)
Гистологический тип
ИПР 45 (65,5%) 39 (63,6%) 0,10
ИДР 17 (25%) 17 (27,4%)
Другие формы 6 (9,5%) 6 (9%)
Степень злокачественности
1 5 (8%) 10 (16%) 0,89
2 48 (70%) 36 (58%)
3 15 (22%) 16 (26%)
Экспрессия рецепторов стероидных гормонов (И ГХ)
РЭ позитивный 52 (76,5%) 44 (70%) 0,46
РЭ негативный 16 (23,5%) 18 (30%)
РП позитивный 51 (75%) 40 (65%) 0,24
РП негативный 17 (25%) 22 (35%)
Экспрессия Her2/neu
1+ 15 (22%) 11 (18%) 0,42
2+ 36 (53%) 36 (58%)
3+/амплификация егЬБ2 17 (25%) 15 (24%)
ИДР - инфильтративный дольковый рак, ИПР - инфильтративный протоковый рак, РЭ - рецепторы эстрогена, РП - рецепторы прогестерона Р - значимость отличий
Согласно результатам, приведенным в таблице, статистически значимых отличий клинико-морфологических характеристик пациентов по критериям размера опухоли (Т), гистологического строения, степени злокачественности (G), уровню экспрессии рецепторов эстрогена (РЭ), прогестерона (РП), Her2/neu в группах N0 и N+ выявлено не было.
Уровень экспрессии CK 19 определялся относительно гена HPRT (Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase), уровень экспрессии которого достаточно стабилен как в ткани лимфатического узла, так и опухоли (Megan A. Luckey, 2014). В качестве основного результата исследования анализировалось соотношение уровня экспрессии CK19/HPRT в относительных единицах (о.е.). В лимфоузлах без морфологических признаков метастазов (N0) средняя величина этого соотношения составила 1,14±0,77 относительных единиц (M±SD), а максимальное и минимальное значение составили 0,5 и 3,9 о.е., соответственно. Наибольшие значения описываемого соотношения наблюдались в группе морфологически подтвержденных метастазов (N+): 4,16±0,82 о.е., минимальное и максимальное значения -2,32 о.е. и 5,12 о.е.
На рисунке 2 представлены средние значения и стандартные отклонения для каждой исследуемой группы.
F(1, 198)=395,40, p=0,00001 Усы диаграммы определяют 0,95 доверительный интервал
Рисунок 2. Соотношение уровней экспрессии CK-19/HPRT в ткани интактного лимфоузла (N0) и при наличии метастаза (К+).
Таким образом, наличие высоко достоверных отличий относительного уровня экспрессии CK-19 в исследованных группах позволяет говорить о перспективности использования этого показателя для дифференциальной диагностики метастазов РМЖ в региональные лимфатические узлы.
Мы также оценили уровни чувствительности и специфичности разработанной диагностической модели. Для этой цели был использован ЯОС-анализ, позволяющий, объективно рассчитать пограничное значение уровня экспрессии CK-19 для групп N0 и №. По результатам анализа площадь под ЯОС-кривой составила 0,975 (р<0,0001), чувствительность 97%, специфичность 92% (рисунок 3).
KRT19/HPRT
<п
с ф
СО
100 80 60 40 20 0
( НИМ ...................
/
+.................... ...........■......:...... ...........■......:..... ......V.....V......;...... 1 1 1
0 20 40 60 80 100 100-Specificity
Рисунок 3. ЯОС-кривая оценки соотношения чувствительности и специфичности для CK-19/HPRT в группах N0 и МТБ
Наиболее оптимальное пограничное значение соотношения CK-19/HPRT для данных значений чувствительности/специфичности было рассчитано на уровне 1,8 о.е. (рисунок 4); основные результаты анализа представлены в таблице 4.
KRT19/HPRT
9P
ooffioo —e-
о oo
>1,7906 Sens: 97,0 Spec: 92,0
N0/MTS
Рисунок 4. Определение пограничного значения соотношения CK-19/HPRT для данных чувствительности/специфичности (0 - N0; 1 - К+)
1
Таблица 4. Результаты оценки чувствительности/специфичности метода
Параметр Значение
Площадь под ROC кривой (AUC) 0,975
Чувствительность 97,00
Специфичность 92,00
Оптимальное пограничное значение >1,7906
Уровень значимости Р (Площадь=0,5) <0,0001
Таким образом, при соблюдении пограничного значения соотношения экспрессии CK-19/HPRT на уровне 1,8 о.е. для верификации метастатического поражения регионарных лимфоузлов, полученные в исследовании значения чувствительности и специфичности метода (97% и 92%, соответственно), определяют возможные перспективы его клинического использования.
Обсуждение
Молекулярно-генетические методы верификации метастазов в ЛУ с использованием специфических мишеней привлекательны благодаря автоматизации методики анализа и объективности получаемого результата. Цитокератин, как маркер метастатического поражения ЛУ изучается достаточно давно. В 1994 году БсИое^еЫ с коллегами
опубликовал первое сообщение, в котором указывал, что молекулярный маркер цитокератин-19 (CK-19) позволяет с достаточной чувствительностью и специфичностью определять клетки метастазов рака молочной железы в ЛУ (Schoenfeld A., 1994, Рожкова
H.И., 2008). Noguchi с коллегами установил, что анализ экспрессии генов CK-19 и MUC-1 методом РВ-ПЦР в экспериментальной модели позволяет определить 10-6 и 10-5 клеток, соответственно (Noguchi S., 1996). Оба этих исследования, также как и ряд последующих (Mori M., 1995; Bostick P.J., 1998; Min C.J., 1998) доказывают, что чувствительность молекулярно-биологического анализа может быть выше гистологической оценки. С другой стороны, высокая чувствительность метода может быть связана с появлением ложноположительных результатов: не исключено, что гены, выбранные для дифференциальной диагностики метастаза, экспрессируются на минимальном уровне и в ткани интактного лимфоузла (Yun K., 1997). Это обстоятельство может, естественно, отрицательно отразиться на специфичности метода. Чувствительность и специфичность верификации метастазов в ЛУ в нашем исследовании оказались достаточно высокими (97% и 92%, соответственно), что открывает методу определенные клинические перспективы.
Список литературы:
I. Боженко В.К., Васкевич Е. Ф., Кудинова Е.А. и др. Возможности оценки экспрессии маммаглобина при различной патологии молочной железы. //Вестник Российского научного центра рентгенорадиологии Минздрава России. 2010. Т. 1. № 10. URL: http://vestnik.rncrr.ru/vestnik/v10/papers/bozhe v10.htm (дата обращения 01.10.2014)
2. Рожкова Н.И., Боженко В.К., Плошница А.И. и др. Содержание мРНК цитокератина 19 в лимфатических узлах как диагностический маркер метастазов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2008. Т. 145. № 1. С. 97-99.
3. Blumencranz P., Deck K.B., Whitworth P.W., et al. Clinical evaluation of a molecular assay for the detection of metastases in breast sentinel lymph nodes // Arch. Pathol. Lab. Med. 2006. V. 130. C. 1362.
4. Bostick P.J. Huynh K.T., Sarantou T., et al. Detection of metastases in sentinel lymph nodes of breast cancer patients by multiple-marker RT-PCR // Int. J. Cancer. 1998. V. 79. P. 645-651.
5. Cserni G., Amendoeira I., Apostolikas N., et al. Pathological work up of sentinel lymph nodes in breast cancer. Review of current data to be considered for the formulation of guidelines // Eur. J. Cancer. 2003. V. 39. P. 1654-1667.
6. Gillanders W.E. Mikhitarian K., Hebert R., et al. Molecular detection of micrometastatic breast cancer in histopathology-negative axillary lymph nodes correlates with traditional predictors of prognosis. An interim analysis of a prospective multi-institutional cohort study // Ann. Surg. 2004. V. 239. P. 828-840.
7. Goldstein M. C., Lori J. Prognostic and Predictive Factors in Early-Stage Breast Cancer // The Oncologist. 2004. V. 5. P. 606-616.
8. GroenR.S., OosterhuisA.W., Boers J.E. Pathologic examination of sentinel lymph nodes in breast cancer by a single haematoxylin-eosin slide versus serial sectioning and immunocytokeratin staining: clinical implications // Breast Cancer Res. Treat. 2007. V. 105. P. 1-5.
9. Soerjomataram I., Louwman M.W., Ribot J.G., et al. An overview of prognostic factors for long-term survivors of breast cancer // Breast Cancer Research and Treatment. 2008. V. 107. P. 309-330.
10. Julian T., Blumencranz P., Deck K., et al. Novel intraoperative molecular test for sentinel lymph node metastasis with patients with early-stage breast cancer // J. Clin. Oncol. 2008. V. 26. P. 3338-3345.
11. Liu L.H., Siziopikou K.P., Gabram S., et al. Evaluation of axillary sentinel lymph node biopsy by immunohistochemistry and multilevel sectioning in patients with breast carcinoma // Arch. Pathol. Lab. Med.. 2000. V. 124. P. 1670-1673.
12. LuckeyM.A, KimuraM.Y, Waickman A.T., et al. The transcription factor ThPOK suppresses Runx3 and imposes CD4+ lineage fate by inducing the SOCS suppressors of cytokine signaling // Nature Immunology. 2014. V. 15. P. 638-645.
13. Mikhitarian K., Martin R.H., MitasM., et al. Molecular analysis improves sensitivity of breast sentinel lymph node biopsy: results of a multi-institutional prospective cohort study // Surgery. 2005. V. 138. P. 474-480.
14. Min C.J., Tafra L., Verbanac K.M. Identification of superior markers for polymerase chain reaction detection of breast cancer metastases in sentinel lymph nodes // Cancer Res. 1998. V. 58. P. 4581-4584.
15. Mori M., Mimori K., Inoue H., et al. Detection of cancer micrometastases in lymph nodes by reverse transcriptase-polymerase chain reaction // Cancer Res. 1995. V. 55. P. 3417-3420.
16. Motomura K., Komoike Y., Inaji H., et al. Multiple sectioning and immunohistochemical staining of sentinel nodes in patients with breast cancer // Br. J. Surg. 2002. V. 89. P. 1032-1034.
17. Noguchi S., Aihara T., Motomura K., et al. Detection of breast cancer micrometastases in axillary lymph nodes by means of reverse transcriptase-polymerase chain reaction // Am. J. Pathol. 1996. V. 148. P. 649-656.
18. Pargaonkar A.S., Beissner R.S., Snyder S., et al. Evaluation of immunohistochemistry and multiple-level sectioning in sentinel lymph nodes from patients with breast cancer // Arch. Pathol. Lab. Med. 2003. V. 127. P. 701-705.
19. SchoenfeldA., Luqmani Y., Smith D., et al. Detection of breast cancer micrometastases in axillary lymph nodes by using polymerase chain reaction. // Cancer Res. 1994. V. 54. P. 29862990.
20. Treseler P.A., Tauchi P.S. Pathologic analysis of the sentinel node // Surg. Clin. North. Am. 2000. V. 8. P. 1695-1719.
21. YaredM.A., Middleton L.P., Smith T.L., et al. Recommendations for sentinel lymph node processing in breast cancer // Am. J. Surg. Pathol. 2002. V. 26. P. 377-382.
ISSN 1999-7264 © Вестник РНЦРР Минздрава России © Российский научный центр рентгенорадиологии Минздрава России
