CC BY
69
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІ СТАТТІ
УДК 577.152.32
а-АМІЛАЗИ Aspergillus flavus var. oryzae І Bacillus subtilis: CУБСТРАТНА СПЕЦИФІЧНІСТЬ ТА СТІЙКІСТЬ ДО НИЗКИ ХІМІЧНО АКТИВНИХ РЕЧОВИН
К. В. Авдіюк Інститут мікробіології і вірусології НАН України, Київ
Л. Д. Варбанець
Е-mail: varbanets@serv.imv.kiev.ua
Отримано 18.03.2013
Вивчено здатність а-амілаз двох продуцентів — Aspergillus flavus var. oryzae 80428 і Bacillus subti-lis 147 розщеплювати різні вуглеводвмісні субстрати, зокрема мальтозу, сахарозу, трегалозу, декстрин, а- та Р-циклодекстрин, амілозу, амілопектин, глікоген, пулулан, розчинний картопляний, нерозчинний картопляний, кукурудзяний, пшеничний крохмалі, декстран 500. Показано, що досліджені ензими відрізняються за субстратною специфічністю. а-Амілаза A. flavus var. oryzae 80428 найефективніше гідролізує розчинний картопляний і пшеничний крохмалі, тоді як а-амілаза B. subtilis 147 — тільки пшеничний. Ензими обох продуцентів не розщеплюють мальтозу, а-циклодекстрин і декстран 500. Дуже низьку здатність до гідролізу пулулану виявлено в а-амілази A. flavus var. oryzae 80428, тимчасом як а-амілаза B. subtilis 147 взагалі не діє на нього. Найнижчі значення константи Міхаеліса для обох ензимів спостерігаються під час розщеплення глікогену, що свідчить про найвищу афінність саме до цього субстрату. Вивчення впливу хімічно активних речовин на активність досліджених ензимів показало, що а-амілази A. flavus var. oryzae 80428 і B. subtilis 147 є стійкими до сечовини, дезоксихолевої кислоти, Твіну-80, Тритону Х-100 та пероксиду водню, тобто вони є конкурентоспроможними з раніше описаними ензимами. Це уможливлює у майбутньому використання цих ензимів у різних галузях промисловості, передусім у виробництві мийних засобів.
Ключевые слова: Aspergillus flavus var. oryzae, Bacillus subtilis, а-амілаза, субстратна специфічність, константа Міхаеліса, хімічно активні речовини.
З розвитком біотехнології розширилися межі застосування препаратів ензимів у різних галузях промисловості. Перше місце за інтенсивністю використання серед різноманітних позаклітинних ензимів посідають а-амілази (КФ 3.2.1.1, 1,4-а-О-глюкан-глюка-ногідролази) — ензими, які не впорядковано каталізують гідроліз внутрішніх а-(1,4)-глі-козидних зв’язків у полісахаридах, що складаються з трьох чи більше глюкозних одиниць, таких як декстрини, глікоген, крохмаль та ін. [1]. Здатність до синтезу а-амілаз виявлено у мікроорганізмів, у тканинах рослин, комах та тварин [2, 3]. Однак у промисловості перевагу надають саме продуцентам мікробного походження завдяки наявності у них фізико-хімічних властивостей, важливих для промисловості, їхній широкій субстратній специфічності, високій продуктивності та легкості маніпулювання з ними. На сьогодні мікробні а-аміла-зи майже повністю витіснили хімічний
гідроліз у процесах перероблення крохмалю [2-4]. Їх широко застосовують у харчовій, спиртовій, текстильній, паперовій промисловості, пивоварінні та медицині. Так, а-амілази, які активні в кислій ділянці рН, використовують у виробництві глюкозних сиропів, у лужній — як добавки до мийних засобів [2, 3, 5]. Отже, для різних галузей промисловості потрібні ензими з конкретними характеристиками специфічності, стабільності, активності за певних значень рН і температури. Тому пошук нових продуцентів а-амілаз залишається актуальною галуззю досліджень.
Оскільки можливості практичного використання ензимів зумовлені їхньою здатністю гідролізувати різні субстрати, метою роботи було вивчення субстратної специфічності а-амілаз двох продуцентів — Aspergillus flavus var. oryzae і Bacillus subtilis та дослідження стійкості їх до низки хімічно активних речовин.
Матеріали і методи
Об’єктами дослідження були позаклітинні а-амілази A. flavus var. oryzae 80428 і B. subtilis 147, вирощені на рідкому живильному середовищі Чапека з крохмалем такого складу (г/л): NaNO3 — 1 (A. flavus var. oryzae 80428) чи 2 (B. subtilis 147); KH2PO4 — 1; KCl — 0,5; MgSO47H2O — 0,5; FeSO47H2O — 0,015; нерозчинний картопляний крохмаль — 10 (A. flavus var. oryzae 80428) чи 1 (B. subtilis 147); соєва мука — 10 (B. subtilis 147); Н2О — до 1 л; рН 6,0 [6]. Культивування мікроорганізмів на цих середовищах проводили глибинним способом в 0,75 л колбах Ерленмеєра на качалках зі швидкістю обертання 220 об/хв за температури 24 °С (A. flavus var. oryzae 80428) і 42 °С (B. subtilis 147) протягом 5 і 3 діб, відповідно. Біомасу відділяли фільтруванням через чотири шари марлі (A. flavus var. ory-zae 80428) або центрифугуванням при 5 000 g протягом 30 хв (B. subtilis 147). У суперна-танті культуральної рідини визначали вміст протеїну й амілолітичну активність. Методи виділення й очищення а-амілаз описано раніше [6]. Вони включали гель-фільтрацію на нейтральному TSK-гелі — Toyopearl HW-50 (Toyo Soda, Японія), іонообмінну хроматографію на гелі DEAE-Toyopearl 650 M (Toyo Soda, Японія) під час очищення а-амілази
A. flavus var. oryzae 80428, а також було використано метод афінної сорбції на крохмалі у разі а-амілази B. subtilis 147.
Амілолітичну активність визначали ДСК-методом, що ґрунтується на виявленні вільних альдегідних груп у молекулах моно-і олігосахаридів, які при окисненні до карбоксильної групи в лужних умовах здатні відновлювати 3,5-динітросаліцилову кислоту (ДСК) до 3-аміно-5-нітросаліцилової кислоти, спричинюючи зміну жовтогарячого забарвлення на червоне. Метод з ДСК, який уперше запропонував Miller, використовували з деякими модифікаціями згідно з Кубрак [7]. Суміш для визначення активності, яка містила 0,25 мл 1%-го розчину крохмалю та 1/15 М фосфатний буфер (рН 6,0), нагрівали за температури 40 °С протягом 5 хв. Для побудови калібрувального графіка паралельно з дослідними пробами як стандарт готували 10 проб з різною кількістю 1% -го розчину перекристалізованої глюкози. У попередньо нагріті дослідні проби вносили розчин препарату ензиму в такій кількості, щоб його загальний об’єм з буфером становив 0,25 мл, та інкубували за температури 40 °С упродовж 30 хв. Після цього в усі проби додавали 0,75 мл ДСК-реагенту
(1% -й розчин 3,5-динітросаліцилової кислоти в 1%-му розчині гідроксиду натрію). Проби інкубували протягом 5 хв на киплячій водяній бані (100 °С). Забарвлення утвореної 3-аміно-5-нітросаліцилової кислоти додатково стабілізували внесенням 0,25 мл 40%-го розчину калію-натрію тартрату. Проби охолоджували протягом 3 хв у льодяній бані й визначали їхню оптичну густину на СФ-26 за довжини хвилі 575 нм. Концентрацію редукуючих моносахаридів у дослідних пробах визначали за рівнянням регресії, яке відображало лінійну залежність між значеннями оптичної густини всіх точок калібрувального графіка і концентрацією глюкози (як стандарту редукуючих цукрів) у дослідних пробах. Активність а-амілази обчислювали за формулою:
«-^-[протеїн]'
де СРц — концентрація редукуючих цукрів у пробах згідно з калібрувальним графіком, мкг;
Vпр — загальний об’єм проби, мл (1,5 мл); t — час реакції гідролізу крохмалю, хв (30 хв); Vпреп — об’єм ензимного препарату, мл; [протеїн] — концентрація загального протеїну в ензимному препараті, мг/мл.
За одиницю активності а-амілази, визначену цим методом, приймали кількість редукуючих цукрів (мкг), утворених за 1 хв за даних умов. Питому активність виражали у перерахунку на 1 мг загального протеїну (Од/мг протеїну).
Субстратну специфічність а-амілаз визначали, використовуючи такі субстрати: мальтозу, сахарозу, трегалозу, декстрин, а-і Р-циклодекстрин, амілозу, амілопектин, глікоген, пулулан, розчинний і нерозчинний картопляний крохмаль, пшеничний і кукурудзяний крохмаль, декстрин 500. Розчини субстратів готували в концентрації 1% з додаванням 10 мл 1/15 М фосфатного буфера (рН 6,0). Активність а-амілази оцінювали ДСК-методом за стандартних умов, як зазначено вище. Відносну активність виражали у %, за 100% приймали активність а-амілази під час розщеплення як субстрату розчинного картопляного крохмалю.
Кінетичні параметри а-амілаз — уявну константу Міхаеліса (Km, мг/мл) та максимальну швидкість реакції ^шах, мкг-1-хв-мг), визначали за графіками Лайнуївера-Берка на розчинному картопляному крохмалі, декстрині та глікогені за температури 40 °С
і рН 6,0. При цьому інкубаційне середовище в усіх експериментах містило однакову кількість а-амілази A. flavus var. oryzae 80428 і B. subtilis 147 (3,3 Од/мг протеїну і 5,1 Од/мг протеїну, відповідно).
Вплив різних хімічно активних речовин аналізували в процесі інкубації препаратів а-амілази протягом 30 хв за кімнатної температури в 1/15 М фосфатному буфері (рН 4,7 і 6,0) у присутності таких реагентів: 1) аніонних детергентів — додецилсульфату натрію в концентрації 0,001 М, 0,005 М, 0,01 М, 0,05 М, 0,1 М та дезоксихолевої кислоти в концентрації 0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,5%, 1,0%; 2) неіоногенних детергентів — Тритону Х-100 і Твін-80 у концентрації 0,1%, 0,5%, 1,0%, 5,0%, 10,0% (об’єм/об’єм); 3) денатуранту — сечовини в концентрації 0,005 М, 0,01 М, 0,05 М, 0,1 М, 0,5 М, 1,0 М, 2,0 М, 4,0 М, 8,0 М; в) окисника — пероксиду водню в концентрації 0,001 М, 0,005 М, 0,01 М, 0,05 М, 0,1 М, 0,5 М. Амілолітичну активність визначали йодометричним методом відповідно до ГОСТу 20264.4-89 [8].
Усі досліди проводили у 5-8 повторах. Аналіз одержаних результатів здійснювали шляхом статистичної обробки методами варіаційної і кореляційної статистики з використанням t-критерію Стьюдента [8]. У роботі вираховували середні значення величин
і стандартні похибки (М ± m). Як достовірні розглядали значення Р < 0,05. Результати, що подані графічно, отримували за допомогою програми Microsoft Ехсеї 2003.
Результати та обговорення
Важливим питанням, необхідним для розуміння можливості практичного застосування ензимів, є вивчення їхньої субстратної специфічності та кінетичних параметрів дії.
Вивчення субстратної специфічності а-амі-лаз A. flavus var. oryzae 80428 та B. subtilis 147 до 15 субстратів показало (рис. 1, 2), що ці ензими здатні розщеплювати всі види крохмалю, причому а-амілаза A. flavus var. oryzae 80428 найефективніше розщеплює розчинний картопляний і пшеничний крохмаль, а а-амі-лаза B. subtilis 147 — пшеничний крохмаль.
За ефективністю гідролізу а-амілазою
A. flavus var. oryzae 80428 досліджені субстрати можна розташувати у такій послідовності: розчинний картопляний крохмаль (100%) ® пшеничний крохмаль (97,5%) ® нерозчинний картопляний крохмаль (90%) ® кукурудзяний крохмаль (85%) ® амілопектин (48,5%) ® глікоген (45,4%) ® амілоза (43%) ® декстрин (40%) ® Р-циклодекстрин
(28%) ® сахароза (9%) ® пулулан (3,6%). Цей ензим взагалі не гідролізує а-циклодекстрин, мальтозу, трегалозу, декстран 500.
Дещо інша картина спостерігається за розщеплення вищезазначених субстратів а-амілазою В. suЪtШs 147: найефективніше вона гідролізує пшеничний крохмаль (162%) ® кукурудзяний крохмаль (111%) ® амілозу (110%) ® розчинний картопляний крохмаль (100%) ® нерозчинний картопляний крохмаль, глікоген (98%) ® декстрин (72%) ® амілопектин (23%) ® трегалозу (19%) ® Р-циклодекстрин (13%). а-Амілаза В. suЪti-
и
ffl
к
Ен
К
<
З
it
З -I J 4 ГЕР
Субстрати
V> II II IF N IJ
Рис. 1. Субстратна специфічність а-амілази ^. flavus vaг. oryzae 80428:
1 — розчинний картопляний крохмаль (контроль);
2 — декстрин; 3 — а-циклодекстрин; 4 — Р-цик-лодекстрин; 5 — нерозчинний картопляний крохмаль; 6 — кукурудзяний крохмаль; 7 — пшеничний крохмаль; 8 — глікоген; 9 — пулулан; 10 — мальтоза; 11 — трегалоза; 12 — амілоза; 13 — амілопектин; 14 — сахароза; 15 — декстран 500
* Достовірно відмінне від контрольного значення за Р < 0,05
и
я
Б
И
1 і
т . і . j.
1.
Іг
11
і> +
і 1 1
] ]
It Ll її 11 1+ U
Субстрати
Рис. 2. Субстратна специфічність а-амілази B. suЫШs 147:
1 — розчинний картопляний крохмаль (контроль);
2 — декстрин; 3 — а-циклодекстрин; 4 — Р-цик-лодекстрин; 5 — нерозчинний картопляний крохмаль; 6 — кукурудзяний крохмаль; 7 — пшеничний крохмаль; 8 — глікоген; 9 — пулулан; 10 — мальтоза; 11 — трегалоза; 12 — амілоза; 13 — амілопектин; 14 — сахароза; 15 — декстран 500
* Достовірно відмінне від контрольного значення за Р < 0,05
lis 147 не розщеплює а-циклодекстрин, пулу-лан, мальтозу, декстран 500.
Аналогічні дані отримали й інші дослідники [2], які показали, що а-амілаза Penicillium citrinum HBF62 також ефективно розщеплювала розчинний картопляний крохмаль (100%), пшеничний крохмаль (111%), кукурудзяний крохмаль (80%) та глікоген (99%), трохи гірше — амілозу (56%). а-Аміла-за Geobacillus thermoleovorans здатна активно діяти на різні види крохмалю: розчинний картопляний (100%), рисовий (98%), кукурудзяний (81%), пшеничний (87%), гірше — на амілопектин (66%) та пулулан (41%), але не здатна розщепити Р-циклодекстрин [9]. а-Амілази B. mojavensis A21 та B. amyloli-quefaciens, як і досліджувана нами а-аміла-за B. subtilis 147, ефективно гідролізували амілозу (117% і 120% відповідно) та картопляний крохмаль (100% і 95% відповідно) [10, 11]. а-Амілаза Trichoderma harzianum, навпаки, найкраще розщеплювала амілопектин (450%) і глікоген (274%), однак, як і досліджені нами а-амілази A. flavus var. ory-zae 80428 та B. subtilis 147, не здатна до гідролізу а-циклодекстрину [12].
Отже, а-амілази A. flavus var. oryzae 80428 та B. subtilis 147 виявляють широку субстратну специфічність, демонструючи здатність ефективно гідролізувати як розгалужені (крохмаль, глікоген, амілопектин), так і лінійні (амілоза) глюкани. Однак а-амілази обох продуцентів не здатні розщеплювати або незначною мірою розщеплюють циклічні глюкани (а- і Р-циклодекстрин відповідно). Крім того, а-амілаза B. subtilis 147 удвічі швидше гідролізує амілозу та глікоген, ніж а-амілаза A. flavus var. oryzae 80428.
Вивчення кінетичних параметрів а-амі-лаз A. flavus var. oryzae 80428 та B. subtilis 147 здійснювали згідно з кінетикою Міхае-ліса-Ментен [13]. Уявну константу Міхаелі-са (Km, мг/мл), яка відображає ступінь спорідненості ензиму до субстрату, та максимальну швидкість реакції (Vmax) а-амілаз
A. flavus var. oryzae 80428 (рис. 3-5) та
B. subtilis 147 (рис. 6-8) визначали за графіками Лайнуївера-Берка на розчинному картопляному крохмалі, декстрині та глікогені. Вибір цих субстратів пов’язаний з їхньою здатністю розчинятись у воді.
Km і Vmax за розщеплення розчинного картопляного крохмалю а-амілазою A. fla-vus var. oryzae становили 4,17 мг/мл і 6,67 мкг-1-хв-мг, декстрину — 1,0 мг/мл і 2,86 мкг-1-хв-мг, глікогену — 0,43 мг/мл і 1,0 мкг-1-хв-мг, відповідно (рис. 3-5).
Схожі значення Km під час розщеплення розчинного крохмалю спостерігали в а-амі-лаз Thermoactinomyces thalpophilus KSV 17 (5,20 мг/мл) [14], Bacillus sp. GRE1 (4,98 мг/мл) [15], Geobacillus thermodenitri-ficans (3,05 мг/мл) [16].
Вивчення кінетичних параметрів а-амі-лази B. subtilis 147 показало, що Km і Vmax під час розщеплення нею розчинного картопляного крохмалю становили 0,40 мг/мл
Рис. 3. Залежність оберненої швидкості гідролізу розчинного картопляного крохмалю а-амілазою Л. flavus vaг. огугае 80428 від його оберненої концентрації
' 1 /V, мкг -1-хв-мг
1/S, мг 1
Рис. 4. Графік Лайнуївера—Берка гідролізу декстрину а-амілазою А. flavus vaг. огугае 80428 залежно від його концентрації
1/V, мкг 1-хв-мг
р
3
Iff
1/S, мг -1
. . . .
Ч ь 1 1 1 1 1 І- Ч
Рис. 5. Залежність оберненої швидкості гідролізу глікогену а-амілазою Л. flavus vaг. огугае 80428 від його оберненої концентрації
і 5,26 мкг^хв^мг, декстрину — 0,63 мг/мл і 1,25 мкг^хв^мг, глікогену — 0,26 мг/мл і 10,60 мкг-1-хв-мг (рис. 6-8). Подібні значення константи Міхаеліса за розщеплення розчинного крохмалю були характерними для а-амілаз РепїсШшт сатетЬеШ PL21 — 0,92 мг/мл [17], Thermobi da fusca — 0,88 мг/мл [18], В. subtШs КСХ 006 — 0,29 мг/мл
[19], В. соЫи ТО147 — 0,70 мг/мл [20].
" 1/У, мкг-1-хв-мг
и у
і' .ґ
-и.
\ \ 1/S, мг -1
■ • ■. 1 : ■ л
X ■ 4:
Рис. 6. Графік Лайнуївера—Берка гідролізу
розчинного картопляного крохмалю
а-амілазою В. subtШs 147
залежно від його концентрації
т 1/У, мкг-1-хв-мг
1
ж -
*■
л4 1^, мг -1
.
.. л J л. , ■ і ■ .і а ■
]
Рис. 7. Залежність оберненої швидкості гідролізу декстрину а-амілазою В. subtШs 147 від його оберненої концентрації
її ЬЕ и 1/У, мкг 1*хв*мг 1/S, мг -1
, і і ї ї 41 3 1 ! 1 1
Рис. 8. Графік Лайнуївера—Берка гідролізу глікогену а-амілазою В. subtШs 147 залежно від його концентрації
Максимальну швидкість реакції 6,67 мкг-1-хв-мг спостерігали за розщеплення а-амілазою А. ^аь^ уаг. oryzae 80428 розчинного картопляного крохмалю, тимча-сом як у випадку а-амілази В. subШis 147 максимальна швидкість реакції 10,60 мкг^-хв-мг відзначалася за гідролізу глікогену.
Отже, вивчення кінетичних параметрів а-амілаз А. р,аош уаг. oryzae 80428 та В. subtШs 147 на різних субстратах показало, що обидва ензими виявляють найвищу аффінність до глікогену, оскільки саме на цьому субстраті спостерігаються найнижчі значення Кт. а-Амілаза Т. harzianum також виявляла більшу спорідненість до глікогену, ніж до розчинного картопляного крохмалю, однак її Кт за розщеплення глікогену становила 4,50 мг/мл, а розчинного крохмалю — 6,53 мг/мл [12].
Деякі дослідники вважають, що різниця в значеннях Кт і Ушах різних ензимів зумовлена структурою субстрату та умовами реакції [21]. Крім того, на швидкість гідролізу субстратів може впливати розмір молекул субстрату, а також кількісний вміст різних типів глікозидних зв’язків: а-1,4 і а-1,6. Встановлено [2], що субстрати з переважним вмістом а-1,4-глікозидних зв’язків розщеплюватимуться набагато швидше, ніж ті, що містять більше а-1,6-глікозидних зв’язків.
Окрім субстратної специфічності, важливою властивістю а-амілаз, яка визначає використання їх у різних галузях промисловості, є стійкість до агресивних речовин, таких як детергенти, сурфактанти, окисники, що часто входять до складу екологічно безпечних мийних засобів. Тому вважали за доцільне перевірити вплив деяких із них на активність а-амілаз.
Вплив додецилсульфату натрію (ДСН) на активність а-амілаз
ДСН — це аніонна поверхнево-активна речовина (ПАР), що використовується у виробництві мийних засобів, шампунів, зубних паст, косметики для утворення піни, а також за електрофорезу для денатурації молекул протеїнів. Існують дані щодо здатності амінокислот протеїнів утворювати комплекси з аніонними, катіонними та неіоногенни-ми ПАР [22]. Так, ДСН здатен утворювати асоціати з лізином [22].
За даними літератури, ДСН є активним інгібітором а-амілаз, оскільки пригнічує їхню активність навіть у дуже низьких концентраціях. Так, у концентрації 0,1% ДСН спричинює зниження активності а-амілази G. thermoleovorans на 30% [9]. а-Амілаза
P. citrinum HBF62 після 30 хв інкубування з 5 мМ ДСН зберігала 38% , а з 10 мМ — 35% активності [2]. а-Амілаза B. amyloliquefaci-ens виявилася чутливою до ДСН, оскільки втрачала 70% вихідної активності у присутності 5 мМ ДСН та 88% за концентрації ДСН 10 мМ [11]. Існує думка, що термостабільні ензими є резистентними до дії органічних розчинників та детергентів [9, 23]. Прикладом цього може бути а-амілаза Bacillus sp. BKL20, яка виявилася повністю стабільною у присутності ДСН в концентрації до 10 мМ та зберігала 64% активності у присутності 100 мМ ДСН після 30 хв інкубації [7], а а-амілаза Bacillus sp. А3-15 після 30 хв інкубування з 1% ДСН втрачала лише 18% своєї активності [23]. Однак цьому твердженню суперечать отримані нами дані щодо майже повної втрати активності термостабільною а-амілазою B. subtilis 147 навіть у присутності 1 мМ ДСН (рис. 9). Подібні дані було одержано в разі додавання 2-10 мМ ДСН до а-амілази B. aquimaris VITP4, коли ензим виявився взагалі нестійким до дії ДСН [24].
Вивчення впливу ДСН на активність а-амілази A. flavus var. oryzae 80428 показало, що цей ензим зберігав 69% своєї активності у присутності 1 мМ розчину даного детергенту та 19% — 5 мМ розчину після 30 хв інкубації (рис. 9). а-Амілаза P. citrinum HBF62 після 30 хв інкубування з 1 мМ ДСН зберігала 89% активності [2] , а-амілаза
B. mojavensis А21 через 1 год інкубування з 1% ДСН (» 3 мМ) — 71% своєї активності [10], а-амілаза B. cohnii US147 у присутності 1 мМ ДСН через 15 хв інкубування зберігала 85% вихідної активності [20], а а-амі-лаза Wangia sp. C52 з додаванням 5 мМ ДСН втрачала 41% своєї активності через 10 хв інкубування [25]. Отже, а-амілаза A. flavus var. oryzae 80428 є досить конкурентоздатною
Рис. 9. Вплив додецилсульфату натрію на активність а-амілаз А. flavus vaг. огугае 80428 та В. subtШs 147.
* Достовірно відмінне від контрольного значення за Р < 0,05
щодо чутливості до ДСН порівняно з вищеописаними ензимами.
Вплив сечовини на активність а-амілаз
Відомо, що більшість а-амілаз є досить чутливими до дії сечовини [26].
Дослідження а-амілаз A. flavus var. oryzae 80428 та B. subtilis 147 свідчать про їхню високу стійкість до сечовини, оскільки з додаванням 8 М розчину цієї сполуки вони зберігали 86,5% та 97% своєї активності, відповідно, навіть після 30 хв інкубування (рис. 10). Крім того, а-амілаза A. flavus var. oryzae 80428 виявилася повністю стабільною у присутності 5 мМ — 4 М сечовини, як і а-амілаза B. subtilis 147 за концентрації сечовини 5 мМ. У разі додавання 10 мМ — 2 М сечовини а-амілаза B. subtilis 147 зберігає 75-87,5% своєї активності та є повністю стійкою за додавання 4 М і 8 М денатуранту. За низьких концентрацій невеликі полярні молекули сечовини можуть вбудовуватися між пептидними ланцюгами, розриваючи водневі зв’язки, що призводить до зменшення стабільності молекули ензиму. Водночас за високих концентрацій молекули сечовини не здатні проникати в молекули ензиму, а містяться лише на її поверхні, змінюючи гідрофобність.
Більш високу стабільність а-амілази
B. subtilis 147 за високих концентрацій сечовини (від 4 до 8 М) можна пояснити тим, що невеликі полярні молекули не спроможні регулювати її здатність впливати на гідрофобність усієї молекули ензиму, тимчасом як, на відміну від досліджених нами ензимів, а-амілаза Bacillus sp. DM-15 через 30 хв інкубування у присутності 8 М сечовини зберігала 67% своєї активності [27], а-амілаза Bacillus sp. BKL20 — 42% [7], а-амілаза Bacillus sp. А3-15 — лише 20% [23] , а а-амілази
1 ' A. flavus var. oryzae
B. subtilis
1ІИ
IW
И
a
<
№ 4-
£ /
Концентрація сечовини, М
Рис. 10. Вплив сечовини на активність а-амілаз
А. flavus vaг. огугае 80428 та В. subtШs 147.
* Достовірно відмінне від контрольного значення за Р < 0,05
4l
з алкалофільних штамів Bacillus — повністю втрачали свою активність [28]. Окрім того, сечовина навіть у низькій концентрації — 5 і 1О мМ — спричинювала зниження активності a-амілази B. amyloliquefaciens на 42% і 84%, відповідно [11], тоді як a-амілаза P. citrinum HBF62 була повністю стійкою у присутності 1-1О мМ сечовини, яка сприяє навіть незначному (1О-12%) стимулюванню активності ензиму [2].
Вплив дезоксихолевої кислоти на активність a-амілаз
Вивчення впливу іншого аніонного детергенту — дезоксихолевої кислоти показало, що вона не впливала на активність a-амілази B. subtilis 147 у концентрації О,О5%-О,5%, а підвищення її концентрації до рівня 1% зумовлювало незначне (15%) зниження активності ензиму. a-Амілаза A. flavus vаr. oryzae 8О428 повністю зберігала активність у присутності О,О5-1% дезоксихолевої кислоти після ЗО хв інкубування навіть з незначним підвищенням її на 1З% за концентрації поверхнево-активної речовини О,О5% і О,1% (рис. 11). Подібні результати було отримано для a-амілази G. thermo-leovorans, у якої 1%-на холінова кислота викликала підвищення активності на 2О% [9]. Одержані нами результати збігаються з даними Кубрак [7], яка показала, що a-амілаза Bacillus sp. ВКІ,2О зберігала 79% активності у присутності 5О мМ дезоксихо-левої кислоти та 72,5% з додаванням 1ОО мМ детергенту після ЗО хв інкубування.
Таким чином, a-амілази A. flavus vаr. oryzae 8О428 і B. subtilis 147 виявилися дуже стійкими до дії дезоксихолевої кислоти.
Рис. 11. Вплив дезоксихолевої кислоти на активність а-амілаз А. flavus vaг. огугае 80428 та В. subtШs 147.
* Достовірно відмінне від контрольного значення за Р < 0,05
Вплив Тритону X-1GG та Tвіну-80 на активність a-амілаз
Тритон Х-1ОО і Твін-8О належать до неіо-ногенних детергентів, які входять до складу деяких мийних та косметичних засобів. Відомо, що вони здатні по-різному впливати на активність одних і тих самих ензимів, виділених з подібних мікроорганізмів [29].
Вивчення впливу неіоногенних сурфак-тантів (об’єм/об’єм) на активність a-амілаз
A. flavus vаr. oryzae 8О428 та B. subtilis 147 показало (рис. 12, 1З), що ці ензими виявляли високу стійкість до вищезазначених сполук. Тритон Х-1ОО не справляв інгібуючого впливу на активність a-амілаз A. flavus vаr. oryzae 8О428 та B. subtilis 147, спостерігалася навіть їх активація на 12% та 1ОО% , відповідно, у присутності 1О%-го розчину Тритону Х-1ОО після ЗО хв інкубування (рис. 12). Подібні результати були одержані Кубрак для a-амілази Bacillus sp. BKL20 [7], Вапо та ін. [ЗО] для a-амілази B. subtilis KIBGE-HAS, де ступінь активації Тритоном Х-1ОО (5%) становив 85%. Стійкою до дії цього сурфактанта була й a-амілаза A. acido-caldarius [26]. Однак у випадку a-амілази G. thermoleovorans спостерігалося пригнічення активності ензиму на 2О% та 4О%,
A. flavus var. oryzae
B. subtilis
, I II 111111
Концентрація Тритону Х-100, %
Рис. 12. Вплив Тритону Х-100 на активність а-амілаз А. flavus vaг. огугае 80428 та В. subtШs 147.
* Достовірно відмінне від контрольного значення за Р < 0,05
" A. flavus var. oryzae 311--------------і-----------------
B. subtilis
їй
<
Концентрація Твіну-80, %
Рис. 13. Вплив Твіну-80 на активність а-амілаз А. flavus vaг. огугае 80428 та В. subtШs 147.
* Достовірно відмінне від контрольного значення за Р < 0,05
відповідно, у присутності 0,1% і 0,2% Тритону Х-100 після 1 год інкубування [9]. Інгібуючий вплив цього детергента спостерігався і в разі а-амілази В. mojavensis А21, активність якої знижувалася на 17% з додаванням 5% Тритону Х-100 після 1 год інкубування [10]. а-Амілаза Rhizobium sp. ШРА R-926 у присутності 1%- та 2%-х його розчинів зберігала 86% своєї активності [29].
Дещо інші результати одержали під впливом Твіну-80. а-Амілаза А. ^аьш уаг. oryzae 80428 виявилася більш чутливою до дії цього детергента, ніж а-амілаза В. subШis 147, оскільки за концентрації 0,1% зберігала 60% активності, а від 0,5% до 10% Твіну-80 — лише половину активності. Водночас активність а-амілази В. subШis 147 підвищувалася на 6% — 34% за цієї самої концентрації детергента, і лише 10% -й Твін-80 спричинював зниження активності на 31% (рис. 13). Однак це пригнічення активності було нижчим, ніж у випадку а-амілази
В. subtШs KIBGE-HAS, яка втрачала 29% і 49% своєї активності у присутності 5% та 10% Твіну-80, відповідно [30]. а-Амілази Rhizobium sp. ШРА R-926 та Bradyrhizobium sp. ШРА R-991 також повністю зберігали свою активність у присутності 1%- та 2%-х розчинів цього детергенту, навіть спостерігалося незначне підвищення їхньої активності [29]. Як й у випадку а-амілази В. subtШs 147, активність G. thermoleovorans підвищувалась у присутності 0,1% і 0,2% Твіну-80 [9].
Зниження активності а-амілаз під дією Твіну-80 пов’язують з переважним вмістом у його складі олеїнової кислоти. Крім того, інгібування може бути результатом спільної дії таких чинників, як зниження гідрофобної взаємодії, що відіграє ключову роль у підтриманні третинної структури протеїну, та пряма взаємодія з його молекулою [30].
Вплив пероксиду водню на активність а-амілаз
Пероксид водню — дуже сильний хімічний окисник, який додають до складу мийних засобів. Тому потенційною умовою використання ензимів у процесі виготовлення екологічно безпечних мийних засобів є їхня стійкість до хімічного окиснення.
а-Амілази А. ^аь^ уаг. oryzae 80428 та
В. subШis 147 є стійкими до хімічного окис-нення пероксидом водню (рис. 14). Так, а-амілаза А. ^аьш уаг. oryzae 80428 повністю зберігала свою активність у присутності
0,001 — 0,05 М пероксиду водню, зі зростанням концентрації окисника до 0,1 М і 0,5 М спостерігалося дуже незначне зниження
і A. flavus var. oryzae ■ B. subtilis
l:ito :ki tf\ 41 -n,:
Концентрація пероксиду водню, М
Рис. 14. Вплив пероксиду водню на активність a-амілаз A. flavus va^ oryzae 8G428 та B. subtilis 147.
* Достовірно відмінне від контрольного значення за Р < 0,05
рівня активності — на 6% і 7% відповідно. a-Aмілаза B. subtilis 147 також виявилася достатньо стійкою до дії пероксиду водню і зберігала 89% — 74% активності за його концентрації 0,005 М — 0,1 М, зростання ж концентрації цієї речовини до О,5 М зумовлювало зниження активності ензиму на 61%. Подібні результати були отримані для a-амілази Bacillus sp. BKL20, яка у разі додавання 0,5 М пероксиду водню після ЗО хв інкубування зберігала 24% своєї активності, а в присутності 1-10 мМ окисника була повністю стабільною [7]. На противагу отриманим даним, a-амілаза Bacillus sp. PN5 втрачала З0% своєї активності у присутності лише 5 мМ пероксиду водню після 1 год інкубування [З1]. A a-амілаза
B. cohnii US147 з додаванням 1 мМ окисника після 15 хв інкубування зберігала 77% активності [20]. Є дані щодо a-амілази Bacillus К8М-КЗ8, яка зберігає активність у присутності 1,8 М пероксиду водню, однак цей ензим є менш термостабільним порівняно з a-амілазою B. subtilis 147 [З2].
Таким чином, здатність a-амілаз A. flavus vаr. oryzae 80428 та B. subtilis 147 ефективно розщеплювати як розгалужені, так і лінійні крохмалевмісні субстрати й витримувати високі концентрації неіоногенних та аніонних детергентів, денатуранту (сечовини) та окисника (пероксиду водню), уможливить у майбутньому використання цих ензимів у різних галузях промисловості, де переробляють крохмалевмісну сировину, передусім у виробництві мийних засобів.
Висловлюємо подяку співробітникам відділів антибіотиків (к. б. н. Сафроновій Л. A.) і фізіології та систематики мікроміцетів (д. б. н. ЖдановійН. М., к. б. н. КурченкоІ. М., к б. н. Харкевич О. С.) за надані для дослідження штами мікроорганізмів.
ЛІТЕРАТУРА
1. Anto H., Trivedi U., Patel K. Alpha amylase production by Bacillus cereus MTCC 1305 using solid-state fermentation // Food Technol. Biotech-nol. — 2006. — V. 44, N 2. — P. 241-245.
2. Metin K., Koc Ц., Ateslier Z.B.B., Biyik H. H. Purification and characterization of a-amyla-se produced by Penicillium citrinum HBF62 // Afr. J. Biotechnol. — 2010. — V. 9, N 45. — P.7692-7701.
3. Mojsov K. Microbial alpha-amylases and their industrial applications: a review / / Int. J. Manag. IT Engin. — 2012. — V. 2, N 10. — P. 583-609.
4. Talekar S., Patil J. Production and characterization of thermostable alpha amylase by Bacillus stearothermophillus NCIM 2922 // J. Cell Tissue Res. — 2012. — V. 12, N 1. — P. 3037-3042.
5. Das S., Singh S., Sharma V., Soni M. L. Biotechnological applications of industrially important amylase enzyme // Int. J. Pharm. Sci. — 2011. — V. 2, Is. 1. — P. 486-496.
6. Авдиюк Е. В., Варбанец Л. Д., Сафронова Л. А., Харкевич Е. С. Очистка a-амилаз Aspergillus fla-vus var. oryzae и Bacillus subtilis и их свойства / / Біотехнологія. — 2012. — Т. 5, № 5. — С. 91-99.
7. Kubrak O. I., Storey J. M., Storey K. В., Lushchak V. I. Production and properties of a-amylase from Bacillus sp. BKL20 // Can. J. Microbiol. 2010. V. 56, N 4. P. 279 288.
8. Варбанець Л. Д., Борзова Н. В. Глікозидази мікроорганізмів і методи їх дослідження / / К.: Наук. думка, 2010. — 440 с.
9. Uma Maheswar Rao J. L., Satyanarayana T. Purification and characterization of a hyperthermostable and high maltogenic a-amylase of an extreme thermophile Geobacillus ther-moleovorans // Appl. Biochem. Biotechnol. —
2007. — V. 142, N 2. — P. 179-193.
10. Hmidet N., Maalej H., Haddar A., Nasri M. A novel a-amylase from Bacillus mojavensis A21: purification and biochemical characterization // Appl. Biochem. Biotechnol. —
2010. — V. 162, Is. 4. — P. 1018-1030.
11. Gangadharan D., Nampoothiri K. M., Sivara-makrishnan S., PandeyA. Biochemical characterization of raw-starch-digesting alpha amylase purified from Bacillus amyloliquefaciens // Ibid. — 2008. — V. 158, Is. 3. — P. 653-662.
12. Mohamed S. A, Azhar E.I., Ba-Akdah M. M. et al. Production, purification and characterization of a-amylase from Trichoderma har-zianum grown on mandarin peel // AJMR. —
2011. — V. 5, N 9. — P. 1018-1028.
13. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты (том 1). — М.: Мир, 1982. — 195 с.
14. Sreenivasa Rao K., Ellaiah P., Karnakumar Biradar V. Purification and characterization of thermostable amylase from a strain of Thermoactinomyces thalpophilus KSV 17 // RGUHS J. Pharm. Sci. — 2012. — V. 2, Is. 1. — P. 83-89.
15. Gulelat Haki D., Alfredo Anceno J., Sudip Rakshit K. Atypical Ca2+-independent, raw-starch hydrolyzing a-amylase from Bacillus sp. GRE1: characterization and gene isola-
tion // World J. Microbiol. Biotechnol. —
2008. — V. 24, N 11. — P. 2517-2524.
16. Ezeji T. C., Bahl H. Purification, characterization, and synergistic action of phytate-resistant a-amylase and a-glucosidase from Geobacillus thermodenitrificans HRO10 // J. Biotechnol. — 2006. — V. 125, N 1. — P. 27-38.
17. Nouadri T., Meraihi Z, Shahrazed D.-D., Leila B. Purification and characterization of the a-amylase isolated from Penicillium camemberti PL21 // Afr. J. Biotechnol. Resear. — 2010. — V. 4, N 6. — P. 155-162.
18. Yang C.-H, Liu W.-H. Puri cation and properties of a maltotriose-producing a-amylase from Thermobi da fusca // Enz. Microb. Technol. — 2004. — V. 35, N 2-3. — P. 254-260.
19. Amutha K., Jaya Priya K. Effect of pH, temperature and metal ions on amylase activity from Bacillus subtilis KCX 006 // Int. J. Pharm. Bio Sci. — 2011. — V. 2, Is. 2. — P. 407-413.
20. Ghorbel R. E., Maktouf S., Massoud E. B. et al. New thermostable amylase from Bacillus cohnii US147 with a broad pH applicability // Appl. Biochem. Biotechnol. — 2008. — V. 157, N 1. — P. 50-60.
21. Ikram-ul-Haq, Javed M. M., Hameed U., Adnan F. Kinetics and thermodynamic studies of alpha amylase from Bacillus licheniformis mutant // Pak. J. Bot. — 2010. — V. 42, N 5. — P. 3507-3516.
22. Гермашева И. И., Глухарёва Н. А., Прохорова Г. В. Взаимодействие L-лизина с доде-цилсульфатом натрия // Научн. вед. БелГУ. — 2011. — Т. 14, № 3. — С. 174-178.
23. Arikan B. Highly thermostable, thermophilic, alkaline, SDS and chelator resistant amylase from thermophilic Bacillus sp. isolate A3-15 // Bioresour. Technol. — 2008. — V. 99, N 8. — P. 3071-3076.
24. Anupama A., Jayaraman G. Detergent stable, halotolerant a-amylase from Bacillus aqui-maris VITP4 exhibits reversible unfolding // Int. J. Appl. Biol. Pharm. Technol. — 2011. — V. 2, Is. 2. — P. 366-376.
25. Liu J., Zhang Z., Dang H. et al. Isolation and characterization of a cold-active amylase from marine Wangia sp. C52 // Afr. J. Microbiol. Res. — 2011. — V. 5, N10. — P. 1156-1162.
26. Satheesh Kumar G., Subhosh Chandra M, Mallaiah K. V. et al. Purification and characterization of highly thermostable a-amylase from thermophilic Alicyclobacillus acidocal-darius // Biotechnol. Bioproc. Eng. — 2010. — V. 15, N 3. — P. 435-440.
27. Ozean B. D., Baylan M, Ozean N, Tekdal D. Characterization of thermostable a-amylase from thermophilic and alkaliphilic Bacillus sp. isolate DM-15 // Res. J. Biol. Sci. — 2010. — V. 5, N 1. — P. 118-124.
28. Koki H. Alkaliphiles: some applications of their products for biotechnology // Microbiol. Mol. Biol. Rev. — 1999. — V. 63, N 4. — P. 735-750.
29. Oliveira A. N., Oliveira LA, Andrade J. S. Partial characterization of amylases of two indigenous central amazonian rhizobia stra-
ins // Braz. Arch. Biol. Technol. — 2010. — V. 53, N 1. — P. 35-45.
30. Bano S., Qader S. A. U., Aman A., Azhar A. Partial purification and some properties of a-amylase from Bacillus subtilis KIBGE-HAS // Ind. J. Biochem. Biophys. — 2009. — V. 46, N 5. — P. 401-404.
31. Saxena R. K, Dutt K, Agarwal L, Nayyar P. A highly thermostable and alkaline amylase from
a Bacillus sp. PN5 // Bioresour. Technol. — 2007. — V. 98, N 2. — P. 260-265.
32. Hagihara H., Igarashi K., Hayashi Y. et al. Novel a-amylase that is highly resistant to chelating reagents and chemical oxidants from the alkaliphilic Bacillus isolate KSM-K38 // Appl. Environ. Microbiol. — 2001. — V. 67, N 4. — P. 1744-1750.
a-АМИЛАЗЫ Aspergillus flavus var. oryzae И Bacillus subtilis: СУБСТРАТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ И УСТОЙЧИВОСТЬ К РЯДУ ХИМИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
Е. В. Авдиюк, Л. Д. Варбанец
Институт микробиологии и вирусологии НАН Украины, Киев
E-mail: varbanets@serv.imv.kiev.ua
Изучена способность a-амилаз двух продуцентов — Aspergillus flavus var. oryzae 80428 и Bacillus subtilis 147 расщеплять разные углеводсодержащие субстраты, такие как мальтоза, сахароза, трегалоза, декстрин, a- и Р-циклодекс-трин, амилоза, амилопектин, гликоген, пуллу-лан, растворимый картофельный, нерастворимый картофельный, кукурузный, пшеничный крахмалы, декстран 500. Показано, что исследованные энзимы отличаются по субстратной специфичности. a-Амилаза A. flavus var. oryzae 80428 эффективнее гидролизует растворимый картофельный и пшеничный крахмалы, в то время как a-амилаза B. subtilis 147 — только пшеничный. Энзимы обоих продуцентов не расщепляют мальтозу, a-циклодекстрин и декстран 500. Очень низкая способность гидролизовать пуллулан обнаружена у a-амилазы A. flavus var. oryzae 80428, а a-амилаза B. subtilis 147 вообще не действует на него. Самые низкие значения константы Михаэлиса для обоих энзимов получены при раодеплении гликогена, что свидетельствует о наибольшей аффинности именно к этому субстрату. Изучение влияния химически активных веществ на активность исследуемых энзимов показало, что a-амилазы A. flavus var. oryzae 80428 и B. subtilis 147 устойчивы к мочевине, дезоксихолевой кислоте, Твину-80, Тритону Х-100 и пероксида водорода, т. е. они являются конкурентоспособными с ранее описанными энзимами. Это даст возможность в будущем использовать данные энзимы в разных отраслях промышленности, прежде всего при изготовлении моющих средств.
Ключевые слова: Aspergillus flavus var. oryzae, Bacillus subtilis, a-амилаза, субстратная специфичность, константа Михаэлиса.
a-AMYLASES OF Aspergillus flavus var. oryzae AND Bacillus subtilis: THE SUBSTRATE SPECIFICITY AND RESISTANCE TO A NUMBER OF CHEMICALLY ACTIVE SUBSTANCES
K. V. Avdiyuk, L. D. Varbanets
Institute of Microbiology and Virology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kiyv
E-mail: varbanets@serv.imv.kiev.ua
The ability of Aspergillus flavus var. oryzae 80428 and Bacillus subtilis 147 a-amylases to split different carbohydrate-containing substrates, such as maltose, sucrose, trehalose, dextrin, a-and P-cyclodextrin, amylose, amylopectin, glycogen, pullulan, soluble starch, insoluble starch, corn starch, wheat starch, dextran 500 has been studied. It was shown that investigated enzymes differ by substrate specificity. a-Amylase of A. flavus var. oryzae 80428 rapidly hydrolysed soluble potato and wheat starch, while the a-amylase of B. subtilis 147 did only wheat starch. Both enzymes don’t cleave maltose, a-cyclodex-trin and dextran 500. A. flavus var. oryzae 80428 a-amylase display very small ability to hydrolyze pullulan, while a-amylase of B. subtilis 147 it does not act in general. The lowest values of Michaelis constant for both enzymes at splitting of glycogen have been obtained, indicating that enzymes have the greatest affinity to this substrate. The studies of influence of chemically active substances on activity of A. flavus var. oryzae 80428 and B. subtilis 147 a-amylases show there are resistant to urea, deoxycholic acid, Tween-80, Triton X-100 and hydrogen peroxide. It’s indicate the enzymes tested may be competitive in compare with earlier described in literature enzymes. The obtained results give a possibility to propose in future usage these enzymes in different fields of industry, foremost in detergent industry.
Key words: Aspergillus flavus var. oryzae, Bacillus subtilis, a-amylase, substrate specificity, Michaelis constant.
