CC BY
347
УДК 577.2.08
АЛЛЕЛЬ-СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СИСТЕМЫ СБЛИЖЕННЫХ ПРАЙМЕРОВ
© А. А. Галимова*, Р. Р. Гарафутдинов, А. Р. Сахабутдинова, А. В. Чемерис
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН Россия, Республика Башкортостан, 450054 г. Уфа, пр. Октября, 71.
Тел./факс: +7 (347) 235 60 88.
Email: aiz.galimova@yandex.ru
Совершенствование методической базы молекулярно-биологического эксперимента существенно расширило спектр объектов исследований, пополнив его такими, например, «сложными» для анализа как разрушенная ДНК, выделенная из ископаемых останков. До последнего времени изучению подобных объектов уделялось недостаточное внимание в силу большей трудоемкости и отчасти второстепенности данной задачи по сравнению с исследованием «традиционных» объектов. Однако возросший интерес к «древней» ДНК стимулирует появление новых методов выделения и анализа нуклеиновых кислот. В данной работе изучена возможность использования метода аллель-специфической полимеразной цепной реакции для SNP-типирования фрагментированной ДНК. Сконструирована модельная система, на примере которой продемонстрирована возможность SNP-типирования коротких фрагментов ДНК. Оказалось, что для успешного протекания реакции необходимо удаление прямого и обратного праймеров друг от друга на расстояние 15-20 нт. Обнаружено, что возможно сокращение общего времени реакции за счет уменьшения времени этапов денатурации, отжига и элонгации с сохранением ее эффективности и специфичности.
Ключевые слова: полимеразная цепная реакция, аллель-специфическая ПЦР, SNP, амплификация, праймеры, специфичность.
Введение
Полимеразная цепная реакция (ПЦР), предложенная более четверти века назад [1, 2], в настоящее время применяется в биологии и медицине для решения широкого круга научных и практических задач, что обусловлено значительными возможностями при относительной простоте метода, высокой чувствительности, надежности и небольшой себестоимости. Практически сразу же после появления ПЦР стали предлагаться различные варианты и разновидности данной реакции, что было обусловлено необходимостью решения конкретных задач, для которых использование классической ПЦР не приводило к желаемому результату.
Одной из активно применяемых на практике разновидностей ПЦР является аллель-специфическая полимеразная цепная реакция (АС-ПЦР), используемая для анализа однонуклеотидных полиморфизмов - снипов (SNP) [3]. На определении полиморфных нуклеотидов в снипах основаны мо-лекулярно-генетические исследования индивидуальной предрасположенности к наследственно обусловленным заболеваниям, устойчивости организма к воздействию окружающей среды и др. Для АС-ПЦР в свою очередь предложен ряд вариаций, позволяющих повысить производительность и скорость анализа [4-9] и обеспечить количественное определение искомой ДНК-мишени [10, 11].
Как правило, для проведения АС-ПЦР используются ДНК-матрицы хорошего качества, поскольку они выделяются из свежих биоматериалов и в достаточном количестве. При работе со «сложными» объектами, такими как низкокопийная ДНК (единичные молекулы анализируемой ДНК), разрушенная ДНК (ДНК из старых/древних биоматериалов или подвергшихся химическому и/или фи-
зическому воздействию), смесь ДНК (искомая + фоновая) SNP-анализ становится нетривиальной задачей, требующей методических отклонений от традиционных подходов. Для таких случаев использование АС-ПЦР в литературе не описано, несмотря на доступность данного диагностического метода. Целью работы стали оценка возможности использования и особенности протекания АС-ПЦР с системой сближенных праймеров (прямого и обратного) при анализе однонуклеотидных полиморфизмов (SNP-типировании).
Экспериментальная часть
В работе использовались следующие реактивы: 5-(этилтио)-Ш-тетразол, амидофосфиты (dA-CE, dC-CE, dG-CE, dT-CE), носители для синтеза олиго-нуклеотидов (dA-CPG, dC-CPG, dG-CPG, dT-CPG) (Glen Research); сухие ацетонитрил и тетрагидрофу-ран квалификации «для синтеза ДНК» (Panreac); акриламид, М,№-метилен-бис-акриламид (Amresco); М,М,№,№-тетраметилэтилендиамин (Lancaster); Taq ДНК полимераза (Fermentas), дезоксинуклеозидтри-фосфаты (СибЭнзим). Для приготовления всех растворов использовали воду высшей категории качества (>18 МOм) (Millipore). В качестве ДНК-матрицы служила тотальная ДНК пчелы медоносной (Apis mellifera), выделенная с помощью коммерческого набора «ДНК-Экстран-2» (Синтол).
Олигонуклеотидные праймеры подбирали с использованием online-утилит OligoAnalyzer компании Integrated DNA Technologies [12] и Nucleotide BLAST ресурса PubMed [13]. Синтез праймеров осуществлен на автоматическом ДНК-синтезаторе ASM-800 (Биоссет) амидофосфитным способом, их очистку проводили методом гель-электрофореза в 15%-ом полиакриламидном геле. Концентрацию всех нуклеиновых кислот определяли по оптиче-
ISSN 1998-4812
Вестник Башкирского университета. 2014. Т. 19. №4
1197
скои плотности водного раствора, найденной при 260 нм, на спектрофотометре BioSpec-Mini ^Ы-madzu). Последовательности использованных в работе праймеров представлены в табл.
Использованные в работе праймеры
Таблица
№ Название
Последовательность*, 5' ^ 3'
1 AM jF-A CGTTCCAAAGCGAGAGCCAA
2 AM jF-C CGTTCCAAAGCGAGAGCCAC
3 AM jF-G CGTTCCAAAGCGAGAGCCAG
4 AM jF-T CGTTCCAAAGCGAGAGCCAT
5 AM jR CGGTGGTTACGGGAACGC
6 AM jR-1 GCGGTGGTTACGGGAACG
7 AM jR-2 GGCGGTGGTTACGGGAAC
8 AM jR-3 CGGCGGTGGTTACGGGAA
9 AM R GGGCACCTGTGCATCGG
* Жирным шрифтом выделены дискриминирующие нуклеотиды, курсивом и подчеркиванием - дополнительные вариабельные нуклеотиды.
Аллель-специфическую полимеразную цепную реакцию проводили в ДНК-амплификаторе Т100 (BioRad Laboratories). Реакционные смеси имели объем 10 мкл и содержали 5 нг ДНК, 0.5 мкл каждого из праймеров с концентрацией 2.0 ОЕ/мл, 0.5 мкл Taq ДНК полимеразы, 1.0 мкл смеси дезоксинуклеозидтрифосфатов с концентрацией 2.5 мМ, 1 мкл буфера для Taq ДНК полимеразы (67 мМ Трис-HCl (pH 8.8), 2.5 мМ MgCh, 0.001% Твин-20). Амплификацию вели по стандартному протоколу: начальная денатурация (3 мин при 95 °С), далее 30-35 циклов - денатурация (15 с при 95 °С), отжиг (30 с при 59 или б3 °С), элонгация (20 с при 72 °С), достраивание цепей (2 мин при 72 °С). Анализ результатов АС-ПЦР осуществляли по конечной точке методом электрофореза в 15%-ных полиакриламидных гелях в камере вертикального типа VE-10 (Хеликон) при напряжении 100 В с их последующим окрашиванием в растворе бромистого этидия и визуализацией в приборе Gel Camera system (UVP Inc.).
Результаты и обсуждение
В классической ПЦР для целей диагностики амплифицируют, как правило, фрагменты размером 150-400 п.о., что соответствует расстоянию между праймерами около 100-350 нт. Использование сближенных прямого и обратного праймеров может позволить амплифицировать более короткие фрагменты нуклеиновых кислот, что актуально, например, для ДНК, выделенной из старых биоматериалов, в которых генетический материал разрушен. SNP-типирование подобных образцов методом АС-ПЦР теоретически возможно, однако до сих пор в научной литературе нет работ, посвященных исследованию такого варианта ПЦР.
Нами изучена возможность дискриминации полиморфных нуклеотидов в ходе АС-ПЦР с использованием сближенных праймеров. В качестве ДНК-матрицы была взята тотальная ДНК пчелы, прайме-ры подбирали к короткому участку локуса XM006557349, не несущему настоящего SNP. Одно-нуклеотидную замену моделировали искусственно
путем подбора всех четырех возможных аллель-специфических прямых праймеров (ЛИ jF-A, AM jF-C, АМ jF-G, АМ jF-T), которые конструировали согласно принятым правилам [10]: наряду с 3'-концевым дискриминирующим нуклеотидом дополнительно заменяли третий с 3'-конца нуклеотид на некомплементарный ДНК-матрице (табл.). При этом позиция условного в ДНК несет нуклеотид С на прямой цепи. Было подобрано несколько обратных праймеров, разноудаленных от прямого. Праймер АМ jR расположен «встык» по отношению к прямому, праймеры АМ jR-1, АМ jR-2 и АМ jR-3 отстоят на 1, 2 и 3 нуклеотида соответственно, а АМ R - на длину праймера АМ jR (рис. 1).
Рис. 1. Схема расположения использованных в работе праймеров.
Очевидно, что минимальный размер амплико-на обеспечивает пара АМ jF и АМ jR (38 нуклеотидов). В данном случае 3'-концы праймеров максимально сближены, не образуя нуклеотидного промежутка (яар). ПЦР-амплификация, проведенная с данной парой праймеров, показала отсутствие аллель-специфичности (рис. 2).
Рис. 2. Электрофореграмма результатов АС-ПЦР с использованием праймеров «встык». Дорожки: 1 и 2 - аллель А, 3 и 4 - С, 5 и 6 - G, 7 и 8 - Т, М - маркер (каждый аллель дан в двукратной повторности).
Максимальная наработка ампликона наблюдалась для аллеля G (праймер АМ jF-G). Целевой продукт амплификации, соответствующий аллелю С (АМ jF-С), практически не нарабатывался. Мы предположили, что отсутствие специфичности обусловлено расположением праймеров, при котором 3'-концы сближены, что обусловливает термодинамическую предпочтительность протекания реакции амплификации для праймеров АМ jF-G + АМ jR. Для подтверждения данного предположения была проведена АС-ПЦР с обратными праймерами АМ jR-1, АМ jR-2 и АМ jR-3, характеризующимися незначительным отдалением 3'-концов (рис. 3).
Рис. 3. Электрофореграмма результатов АС-ПЦР с использованием обратных праймеров, удаленных от прямого на 1, 2 и 3 нуклеотида. Дорожки: 1-3 - аллель А, 4-6 -С, 7-9 - G, 10-12 - T, M - маркер; 1, 4, 7, 10 - праймер AM jR-1; 2, 5, 8, 11 - AM jR-2; 3, 6, 9, 12 - AM jR-3.
Анализ результатов показал, что, несмотря на образование неспецифических продуктов амплификации для аллеля G, для аллеля С также наблюдается образование целевых ампликонов. Таким образом, введение нуклеотидной бреши размером 1-3 нт существенно изменяет ход АС-ПЦР. Попытка повысить специфичность путем увеличения температуры отжига праймеров, варьирования времен-нбго протокола не оказала какого-либо положительного эффекта (данные не приведены). Полученный результат нельзя считать удовлетворительным, поскольку желаемая специфичность реакции не была достигнута.
Дальнейшее отдаление обратного праймера на 4, 5 и т.д. нуклеотидов посчитали нецелесообразным, поскольку длина ампликона при этом возрастает незначительно, а повышение специфичности не гарантировано. Поэтому был подобран еще один обратный праймер (AM R), отстоящий от прямого на длину целого праймера (AM jR). После оптимизации параметров реакции путем подбора температурного режима и установления минимального времени, необходимого для успешного протекания реакции амплификация в паре AM jF и AM R привела к требуемому результату. Повышение температуры отжига на 4 °С (63 вместо 59 °С) и уменьшение продолжительности этапов денатурации, отжига и элонгации до 1, 5 и 1 секунды соответственно благоприятным образом сказались на эффективности реакции и чистоте полученных продуктов (специфичности амплификации) (рис. 4).
Рис. 4. Электрофореграмма результатов АС-ПЦР с использованием обратного праймера АМ Р. Дорожки: 1, 5 -аллель А, 2, 6 - С, 3, 7 - О, 4, 8 - Т, М - маркер; 1-4 -опыт, 5-8 - отрицательный контроль.
Таким образом, показана принципиальная возможность SNP-типирования коротких фрагментов ДНК (менее 100 п.о.). Оказалось, что для успешного протекания АС-ПЦР необходимо некоторое удале-
ние прямого и обратного праймеров друг от друга: расположение «встык» или с зазором в несколько нуклеотидов не обеспечивает специфичности реакции. В то же время отдаление на 18 нт позволило дискриминировать полиморфный нуклеотид. Помимо возможности анализа фрагментированной ДНК, важным преимуществом использования системы сближенных праймеров является сокращение общего времени реакции (в нашем случае до 25 мин), поскольку амплификация коротких фрагментов не требует установления в приборе больших величин времени денатурации, отжига и элонгации.
Авторы выражают благодарность научному сотруднику ИБГ УНЦ РАН Гайфуллиной Л. Р. за помощь в выделении ДНК. Работа выполнена за счет средств гранта НШ-5923.2014.4 на оборудовании ЦКП "Биомика" (отделение биохимических методов исследований и нанобиотехнологии Регионального ЦКП "Агидель") и УНУ (уникальная научная установка) "КОДИНК".
ЛИТЕРАТУРА
1. Saiki R. K., Scharf S., Faloona F., Mullis K. B., Horn G. T., Erlich H. A., Arnheim N. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia // Science. 1985. V. 230. Pp. 1350-1354.
2. Mullis K., Faloona F. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain reaction // Methods Enzy-mol. 1987. V. 155. Pp. 335-350.
3. Wu D. Y., Ugozzoli L., Pal B. K., Wallace R. B. Allele-specific enzymatic amplification of beta-globin genomic DNA for diagnosis of sickle cell anemia // Proc. Natl. Acad. Sci. 1989. V. 86. No. 8. Pp. 2757-2760.
4. Asari M., Watanabe S., Matsubara K., Shiono H., Shimizu K. Single nucleotide polymorphism genotyping by mini-primer allele-specific amplification with universal reporter primers for identification of degraded DNA // Anal. Biochem. 2009. V. 386. Pp. 85-90.
5. Sasvari-Szekely M., Gerstner A, Ronai Z., Staub M., Guttman A. Rapid genotyping of factor V Leiden mutation using singletube bidirectional allele-specific amplification and automated ultrathin-layer agarose gel electrophoresis // Electrophoresis. 2000. V. 21. No. 4. Pp. 816-821.
6. Wang W., Zhang X., Zhou G. High-throughput genotyping by coupling adapter-ligation mediated allele-specific amplification with microplate array parallel gel electrophoresis // Mol. Biotechnol. 2010. V. 44. No. 1. Pp. 1-7.
7. Cai L., Kong F., Jelfs P., Gilbert G. L., Sintchenko V. Rolling circle amplification and multiplex allele-specific PCR for rapid detection of katg and inha gene mutations in mycobacterium tuberculosis//bit. J. Med. Microbiol. 2009. V. 299. No. 8. Pp. 574-581.
8. Hu Y. J., Li Z. F., Diamond A. M. Enhanced discrimination of single nucleotide polymorphism in genotyping by phos-phorothioate proofreading allele-specific amplification // Anal. Biochem. 2007. V. 369. No. 1. Pp. 54-59.
9. Troncone G., Pettinato G., Palombini L., Rossi G., Sapio M. R., Posca D., Fenzi G., Vitale M. Detection of braf mutation in thyroid papillary carcinomas by mutant allele-specific PCR amplification (MASA) // Eur. J. Endocrinology. 2006. V. 154. No. 2. Pp. 341-348.
10. ПЦР «в реальном времени». М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. 223 с.
11. Szankasi P., Reading N. S., Vaughn C. P., Prchal J. T., Bahler D. W., Kelley T. W. A quantitative allele-specific PCR test for the BRAF V600E mutation using a single heterozygous control plasmid for quantitation: a model for qPCR testing without standard curves // J. Mol. Diagn. 2013. V. 15. Pp. 248-254.
12. http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/
13. http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/
Поступила в редакцию 07.10.2014 г.
ISSN 1998-4812
BeciHHK EamKHpcKoro yHHBepcHTeTa. 2014. T. 19. №4
1199
ALLELE-SPECIFIC POLYMERASE CHAIN REACTION WITH THE USE OF SYSTEM OF CONTIGUOUS PRIMERS
© A. A. Galimova*, R. R. Garafutdinov, A. R. Sakhabutdinova, A. V. Chemeris
Institute of Biochemistry and Genetics Ufa Science Center Russian Academy of Sciences 71 Oktyabrya Ave., 450054 Ufa, Republic of Bashkortostan, Russia.
Phone: +7 (347) 235 60 88. *Email: aiz.galimova@yandex. ru
An improvement of molecular-biological experiment significantly expanded the range of feasible research objects such as degraded DNA from fossils. Until recently the study of degraded DNA was gain a little attention because of its complexity and minor interest in contrast with "traditional" objects. However, the interest to "ancient" DNA stimulates the development of new methods for isolation and analysis of nucleic acids. We have investigated the feasibility of allele-specific polymerase chain reaction for SNP-typing of fragmented DNA. We have designed the experiment model for demonstration the possibility of short DNA fragments SNP-typing. It was found the forward and reverse primers should be located at 15 -20 nucleotides from each other. The decrease of reaction time can be achieved by reducing the times of denaturation, annealing and elongation steps along with efficiency and specificity retention.
Keywords: polymerase chain reaction, allele-specific PCR, SNP, amplification, primers, specificity. Published in Russian. Do not hesitate to contact us at bulletin_bsu@mail.ru if you need translation of the article.
REFERENCES
1. Saiki R. K., Scharf S., Faloona F., Mullis K. B., Horn G. T., Erlich H. A., Arnheim N. Science. 1985. Vol. 230. Pp. 1350-1354.
2. Mullis K., Faloona F. Methods Enzymol. 1987. Vol. 155. Pp. 335-350.
3. Wu D. Y., Ugozzoli L., Pal B. K., Wallace R. B. Proc. Natl. Acad. Sci. 1989. Vol. 86. No. 8. Pp. 2757-2760.
4. Asari M., Watanabe S., Matsubara K., Shiono H., Shimizu K. Anal. Biochem. 2009. Vol. 386. Pp. 85-90.
5. Sasvari-Szekely M. Electrophoresis. 2000. Vol. 21. No. 4. Pp. 816-821.
6. Wang W., Zhang X., Zhou G. Mol. Biotechnol. 2010. Vol. 44. No. 1. Pp. 1-7.
7. Cai L., Kong F., Jelfs P., Gilbert G. L., Sintchenko V. Int. J. Med. Microbiol. 2009. Vol. 299 . No. 8. Pp. 574-581.
8. Hu Y. J., Li Z. F., Diamond A. M. Anal. Biochem. 2007. Vol. 369. No. 1. Pp. 54-59.
9. Troncone G., Pettinato G., Palombini L., Rossi G., Sapio M. R., Posca D., Fenzi G., Vitale M. Eur. J. Endocrinology. 2006. Vol. 154. No. 2. Pp. 341-348.
10. PTsR «v real'nom vremeni» [Polymerase Chain Reaction "in Real Time"]. Moscow: BINOM. Laboratoriya znanii, 2009.
11. Szankasi P., Reading N. S., Vaughn C. P., Prchal J. T., Bahler D. W., Kelley T. W. J. Mol. Diagn. 2013. Vol. 15. Pp. 248-254.
12. http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/
13. http://blast.ncbi.nlm.nih. gov/
Received 07.10.2014.
