CC BY
366
ТЕХНОЛОГИЯ И АППАРАТЫ ПИЩЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ
УДК 678.675; УДК 577.15
В. С. Гамаюрова, М. Е. Зиновьева, К. Л. Васина
АКТИВАЦИЯ И СТАБИЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ НЕОРГАНИЧЕСКИМИ СОЕДИНЕНИЯМИ
Ключевые слова: амилазы, липазы, активность, термостабильность, неорганические соли. amylases, lipases, activity, thermostability, nonorganic compounds.
Проведены исследования по изучению влияния ряда неорганических солей на активность и термостабильность амилолитических ферментных препаратов и панкреатической липазы. Установлено, что в зависимости от вида металла и его концентрации можно достичь увеличения каталитической активности до 85 %. Кратковременная тепловая обработка позволяет повысить каталитическую активность на 20-37%. Термостабильность ферментных препаратов существенно увеличивается при совместном воздействии солей металлов и тепловой обработки.
Influence of nonorganic compounds on activity and thermostability of amylo-litic enzyme preparations and enzyme preparation of pancreatic lipase has been study. It was demonstrated, it is possible to reach increases of catalytic activity to 85 % depends on a kind of metal and it concentration. Short-term thermal treatment allows to raise catalytic activity on 20-37 %. Combined influence of salts of metals and thermal treatment allows to raise thermostability of enzyme preparations.
Гидролитические ферменты используются преимущественно в начальной, наиболее трудоемкой стадии переработки органического сырья, когда необходимо расщепить структурные или запасные полимеры. Такие задачи решаются в технологии продуктов брожения, при получении сахаристых продуктов из крахмала, различных видов кормов и пищевого белка, а также при переработке жиров, инверсии сахарного сиропа, гидролизе лактозы.
Проблема снижения расхода ферментных препаратов как отечественного, так и импортного производства стоит довольно остро. Снижение расхода ферментных препаратов можно достигнуть путем повышения каталитической активности и термостабильности препарата.
Методы активации амилолитических ферментов, применяемых в пищевой промышленности, можно разделить на две группы:
1) физические методы, включающие воздействие геле-неонового лазера, электромагнитного излучения диапазона КВЧ, кратковременной тепловой обработки;
2) химические методы, связанные с воздействием на ферменты различных химических агентов, органической и неорганической природы [1-4].
Известно, что большинство ферментов выполняют свои функции в присутствии ко-ферментов и кофакторов. В качестве кофакторов обычно выступают ионы металлов. Последние могут активировать, ингибировать и стабилизировать каталитическую активность ферментов. Действие ионов металла связано с их влиянием на конформацию фермента. В частности многие а-амилазы, которые используют для разжижения крахмала на первой стадии осахаривания, являются кальцийзависимыми ферментами. Эти амилазы содержат от 1 до 30 грамм-атомов кальция на моль белка. Кальций обеспечивает их стабильность,
устойчивость к денатурации и способствует повышению каталитической активности. Согласно литературным данным [1,3], кальций играет большую роль в создании третичной структуры молекулы фермента; он связывает функциональные группы расположенные на отдельных участках полипептидной цепи молекулы фермента и образует внутримолекулярную поперечную связь в молекуле а-амилазы.
В настоящее время проблема активации и стабилизации ферментных препаратов, используемых в спиртовой и жировой промышленности, изучена недостаточно. Ассортимент ферментных препаратов быстро увеличивается и значительное их количество, особенно новых препаратов, не охвачены этими исследованиями. Нами были установлены виды активаторов ферментных препаратов амилолитического и липолитического ряда и определены их оптимальные концентрации. Вещества, используемые в качестве активаторов, имеют невысокую стоимость, а их применение позволяет снизить расход ферментных препаратов.
Экспериментальная часть
Подбор условий активации в присутствии ряда соединений осуществлялся в лабораторных условиях с использованием стандартных методик определения ферментативной активности:
Активность ферментного препарата панкреатической липазы определяли модифицированным методом Ота, Ямада [5]. Эмульгирование осуществляли пищевым диспергатором «Cameron CBL-1210» при разных скоростях вращения мешалки.
Амилазная активность определялась колориметрическим методом на ФЭК в диапазоне волн 630-670 нм (ГОСТ 20254.4 - 89) [6].
Характеристики ферментных препаратов, используемых в работе, указаны в таблице 1.
Таблица 1 - Характеристики ферментных препаратов, используемых в работе
Наименование ферментного препарата Активность Продуцент
Амилосубтилин ГЗх Ликвамил l200 Амилаза НТ-4000 Глюкозим Л-400С Lipase from porcine pancreas, Type II Не менее lOOO ед/г Не менее 2500 ед/см3 450-б00 ед/см3 Не менее б000 ед/см3 l00-400 ед/г Bacillus subtilis 103 Bacillus subtilis origin Bacillus stearothermophilus Aspergillus niger Из поджелудочной железы свиньи
Результаты и их обсуждение
Были исследованы ферментные препараты, наиболее часто применяемые в спиртовой промышленности для разжижения и осахаривания крахмала. Из отечественных препаратов наиболее часто применяется амилолитический ферментный препарат Амилосубти-лин Г3х. Поэтому именно этот препарат использовался для первоначальных исследований и в качестве модельного. Активация прочих препаратов проводилась с учетом результатов полученных с Амилосубтилином Г3х.
Влияние на активность и термостабильность препарата Амилосубтилин Г3х соединений различной природы
Проведены исследования влияния на активность ферментного препарата Амилосуб-тилин Г3х следующих соединений: N440!, (NN4)2804, МпС!2, Ре804, ZnCІ2, РеС!3, КІ,
Са^, MgC!2. Проведенные исследования показали, что добавление (NH4)2S04, MnC!2, Fe804, РеСІз, КІ оказывает слабое активирующее воздействие (прирост активности не превышал 15 %) или не оказывает влияния на каталитическую активность ферментного препарата, а СаСІ2, МдСІ2, ZnCІ2, NN40! в определенных концентрациях значительно увеличивают активность ферментного препарата. Данные представлены в таблице 2 .
Таблица 2 - Влияние неорганических соединений на активность ферментного препарата Амилосубтилин Г3х
Активатор Интервал концентраций (оптимальная концентрация) Прирост активности при оптимальной концентрации активатора, %
Са^2 10-7-1 М/л (10-1 М/л) 25-30
Мд804 10-7 -10-2 М/л (10-2 М/л) 12
Мд^2 10-7 -10-1 М/л (10-2 М/л) 35-40
ZnCІ2 10-6 -10-2 М/л (10-5 М/л) 45
NN4^ 10-6-10-1 М/л (10-2 М/л) 40
(NN4)2804 10-5 -10-1 М/л (10-1М/л) 5
МП^2 10-6 -10-2 М/л (10-3 М/л) 12
FeClз 10-6 -10-2 М/л (10-5 М/л) 6-7
FeS04 10-7 -10-2 М/л (10-5 М/л) 10
КІ 10-6 -10-1 М/л (10-1М/л) 5 і 2 о
MgCІ2+ Са^ 10-6 -10-2 М/л + 10-1 М/л 39
MgCІ2+ Са^ 10-6 -10-2 М/л + 10-2 М/л 39
Большое значение для ферментных препаратов, используемых в производстве, помимо активности имеет термостабильность. Поэтому было рассмотрено изменение термостабильности ферментного препарата «Амилосубтилин Г3х» в присутствии неорганических добавок в оптимальных концентрациях. Изучено изменение активности фермента в разбавленных растворах при температурах 60 °С и 70 °С в течение 1 часа. Данные представлены на рисунках 1-2.
Как видно из представленных данных, наибольшее улучшение термостабильности ферментного препарата наблюдается при добавлении ионов кальция. Хлористый аммоний повышает термостабильность амилосубтилина несколько меньше. Однако через 1 час эффекты повышения термостабильности нивелируются. Остальные металлы практически не оказывают положительного влияния на сохранение активности амилазы в растворах.
Время, мин
■2 * 3 -г
Рис. 1 - Изменение активности Амило-субтилина Г3х при тепловой обработке в присутствии неорганических соединений (температура 60 °С):
1 - исходный раствор Амилосубтилина Г3х без добавок;
2 - раствор Амилосубтилина Г3х, содержащий СаС12 в концентрации 10"1 М/л;
3 - раствор Амилосубтилина Г3х, содержащий МдС12 в концентрации 10"2 М/л;
4 - раствор Амилосубтилина Г3х, содержащий ЕпС!2 в концентрации 10"4 М/л;
5 - раствор Амилосубтилина Г3х, содержащий МН4С1 в концентрации 10"2 М/л
Термоактивация Амилосубтилина Г3х
Рис. 2 - Изменение активности Амило-субтилина Г3х при тепловой обработке в присутствии неорганических соединений (температура 70 °С):
1 - исходный раствор Амилосубтили-на Г3х без добавок;
2 - раствор Амилосубтилина Г3х, соде ржащий СаС!2 в концентрации 10"1 М/л;
3 - раствор Амилосубтилина Г3х, содержащий МдС12 в концентрации 10"2 М/л;
4 - раствор Амилосубтилина Г3х, содержащий ЕпС!2 в концентрации 10"4 М/л;
5 - раствор Амилосубтилина Г3х, содержащий МН4С! в концентрации 10"2 М/л
Известно, что тепловая обработка водных растворов ферментных препаратов и добавление к ним ионов некоторых металлов оказывает влияние на их ферментативную активность. При этом ферменты подвергаются, в зависимости от температуры, конформаци-онным изменениям в водном растворе и могут существовать в нескольких конформацион-ных состояниях, переходящих друг в друга при характерных для каждого белка температурах [7,8].
В таблице 3 показано, что добавление ионов металлов эффективно при тепловой обработке Амилосубтилина Г3х. Так, тепловая обработка амилолитического ферментного препарата в присутствии ионов металлов приводит к большому увеличению активности, чем только тепловая обработка.
1
4
5
Таблица 3 - Совместное влияние тепловой обработки и ионов металлов на активность Амилосубтилина Г3х
Воздействующие факторы Концентрация активатора, М/л Оптимальные условия термообработки Прирост активности, %
Т = 40 °С, время обработки -20 мин 34
Термоактивация 0 Т = 40 °С, время обработки -30 мин Т = 50 °С, время обработки -10 мин 37 22
Т = 40 °С, время обработки -20 мин 34
Са^2 +Термоактивация 10-1 Т = 40 °С, время обработки -30 мин Т = 50 °С, время обработки -10 мин 50 28
Т = 40 °С, время обработки -20 мин 43
Мд^2 +Термоактивация 10-2 Т = 40 °С, время обработки -30 мин Т = 50 °С, время обработки -10 мин 40 17
Результаты полученные при изучении термостабильности обработанных раствором Амилосубтилина Г3х представлены на рисунках 3-4.
£
е
и
о
н
а
<
20 40 60 80
Время, мин
1
2
3
4
о
я
&
И
<
Время, час
1
2
3
4
Рис. 3 - Изменение активности термообработанного Амилосубтилина Г3х при тепловой обработке в присутствии неорганических соединений (Т =60 °С):
1 - исходный раствор Амилосубтилина Г3х без добавок предварительно термообработанный при Т = 40 °С в течение 20 мин;
2 - раствор Амилосубтилина Г3х, содержащий СаС12 в концентрации
10"1 М/л и термообработанный при Т = 40 °С в течение 20 мин;
3 - раствор Амилосубтилина Г3х, содержащий МдС12 в концентрации
10"2 М/л и термообработанный при Т = 40 °С в течение 20 мин;
4 - раствор Амилосубтилина Г3х, содержащий СаС12 в концентрации
10'1 М/л, МдС!2 в концентрации 10"2 М/л и термообработанный при Т = 40 °С в течение 20 мин
Рис. 4 - Изменение активности термообработанного Амилосубтилина Г3х при тепловой обработке в присутствии неорганических соединений (Т = 70 °С):
1 - исходный раствор Амилосубтили-на Г3х без добавок предварительно термообработанный при Т = 40 °С в течение 20 мин;
2 - раствор Амилосубтилина Г3х, содержащий СаС12 в концентрации 10"1 М/л и термообработанный при Т = 40 °С в течение 20 мин;
3 - раствор Амилосубтилина Г3х, содержащий МдС12 в концентрации 10"2 М/л и термообработанный при Т = 40 °С в течение 20 мин;
4 - раствор Амилосубтилина Г3х, содержащий СаС12 в концентрации 10'1 М/л, МдС!2 в концентрации 10"2 М/л и термообработанный при Т = 40 °С в течение 20 мин
Результаты исследования показывают, что дополнительная термообработка в присутствии ионов кальция или при сочетании кальция и магния способствует более значительному увеличению термостабильности Амилосубтилина Г3х, чем просто добавление этих ионов.
Активация других амилолитических ферментных препаратов при добавлении неорганических активаторов
В России на многих производствах используются дорогостоящие зарубежные ферментные препараты. Поэтому в дальнейших исследованиях было рассмотрено влияние неорганических солей на активность ферментных препаратов зарубежного производства.
Проведены исследования влияния на активность ферментных препаратов «Ликва-мил 1200» и «Амилаза НТ 4000» следующих соединений: СаС12, ZnCІ2, N4401, ЫН4Н2Р04. Данные представлены в таблице 4.
Таблица 4 - Влияние неорганических солей на активность ферментных препаратов
Препарат Актива- тор Интервал концентраций (оптимальная концентрация) Прирост активности при оптимальной концентрации активатора, %
«Амилаза НТ 4000» CaCI2 10-7 -10-1 М/л (10-3 М/л) 85
«Ликвамил 1200» CaCI2 10-6-10-1 М/л (10-4 М/л) 52
ZnCI2 10-3 -10-7 (10-6 М/л) 22
Как свидетельствуют представленные данные, на активность амилазы в обоих случаях положительное влияние оказывало внесение СаС12. Активность препарата «Ликвамил 1200» также повышается и в присутствии ионов цинка. Аммонийные соли не изменяли активность ферментов. Термостабильность препаратов в присутствии ионов металлов менялась незначительно, слабый положительный эффект оказывали только ионы кальция.
Представленные данные показывают, что некоторые ионы металлов оказывают значительное активирующее воздействие на активность амилаз различного происхождения. В том, что кальций является активатором нет ничего необычного, т.к. известно, что а-амилаза относится к металлоферментам и нуждается в кальции для проявления своей активности. Введение ионов магния скорее всего оказывает эффект подобный ионам кальция. Фермент а-амилаза, получаемый из Bacillus subtilis, с помощью ионов цинка способен образовывать димерные формы, вероятнее всего этим и объясняется столь значительное повышение активности при введение в раствор хлорида цинка. Возможно данный эффект характерен и для амилаз другого происхождения. Повышение термостабильности растворов ферментных препаратов наблюдалось преимущественно в присутствии хлористого кальция и хлорида аммония.
Активация ферментного препарата «Глюкозим L 400» при добавлении активаторов различной природы
Проведены исследования влияния на активность ферментного препарата «Глюкозима L 400» следующих соединений: NH4Cl, MnCl2, ZnCl2, CuCl2, FeCb, KI. Данные представлены в таблице 5.
Таблица 5 - Активаторы «Глюкозима Ь 400»
Активатор Интервал концентраций (оптимальная концентрация) Прирост активности, %
МпС12 0,001-0,00001 М/л (10-4 М/л) 12-18
СиС12 10'4-10'5 М/л 8-15
ЫЩС! 0,25-2 % (0,5 %) 8-12
К1 0,01-0,1 М/л 5-6
Также была изучена стабильность растворов «Глюкозима Ь 400» при термообработке. В качестве активаторов были выбран МпС12, т.к. он вызывают наиболее высокий прирост активности фермента. Как показывают исследования, МпС12 также способствует и улучшению термостабильности препарата. Влияние активатора на термостабильность растворов ферментного препарата «Глюкозим Ь 400» (60 °С) представлено на рисунке 5.
Рис. 5 - Влияние активатора на термостабильность растворов «Глюкозима Ь 400» (60°С): 1 - исходный раствор; 2 - раствор «Глюкозим Ь 400», содержащий МпС12 в концентрации 10-4 М/л
Также в работе было изучено влияние некоторых неорганических солей на активность панкреатической липазы.
Липазы - уникальные биокатализаторы, имеющие распространенную субстратную специфичность и получившие достойное применение в тонком органическом синтезе, нефтехимии, производстве фармацевтических препаратов, медицине, пищевой и бумажной промышленности. В связи с широкими возможностями применения ферментных препаратов липаз одной из важнейших задач является повышение их ферментативной активности. В работе было рассмотрено влияние ряда соединений на активность ферментного препарата панкреатической липазы, тип II. Проведенные исследования позволили установить, что при отсутствии ионов Са2+ ферментный препарат обладает пониженной активностью. В то же время внесение раствора хлористого кальция приводит к значительной его активации. Было показано, что ионы Мд2+ наряду с ионами Са2+ способствуют повышению липазной
активности, но в меньшей степени. Причем хлориды оказывают более выраженный эффект, чем сульфаты. Полученные данные представлены в таблице 6.
Таблица 6 - Влияние некоторых солей на активность ферментного препарата панкреатической липазы
Вещество Грубодисперсная эмульсия Тонкодисперсная эмульсия
Концентрация активатора (оптимальная концентрация), М/л Прирост активности, % Прирост активности, %
CaCh 0,00 - 0,09 (0,05) 96 27
MgCh 0,00 - 0,09 (0,04) 56 14
MgSO4 0,00 - 0,09 (0,03) 25 -
Как показывают результаты исследования, степень влияния неорганических соединений на скорость реакции зависит от степени эмульгирования субстрата. При высокой степени дисперсности эмульсии прирост активности при добавлении солей существенно ниже. Это имеет большое практическое значение, т.к. позволяет повысить эффективность гидролиза масел при низкой степени эмульгирования или в отсутствии эмульгатора, что снижает затраты на проведение процесса.
Таким образом, изучено влияние соединений различной природы на ферментные препараты амилолитического и липолитического действия. Для каждого из изученных препаратов подобраны оптимальные концентрации активирующих добавок.
Литература
1. Saboury, A.A. Thermodynamic studies on the interaction of calcium ions with alpha-amylase / A.A. Saboury, F. Karbassi // Thermoclinica Acta. - 2000. Vol. 362. - P.121-129.
2. Попадич И.А, Устинников Б.А., Траунбенберг С.Е. [и др]. Способ подготовки крахмалосодержащего сырья для спиртового брожения. Авт. свид. СССР, № S40099, Б.И. № 32, 30.0S.S3.
3. Гамаюрова, В. С. Методы активизации амилолитических ферментов с целью снижения их удельного расхода / В.С. Гамаюрова // Тезисы докладов научно-практической конференции «Современные ресурсо- и энергосберегающие технологии в спиртовой и ликеро-водочной промышленности». - Казань, 2000. - С.35.
4. Плохов, А.Ю. Применение ферментных препаратов в спиртовой промышленности / А.Ю. Пло-хов // Производство спирта и ликероводочных изделий. - 2002. - №3. - С. 22-23.
5. Грачева, И.М. Лабораторный практикум по технологии ферментных препаратов / И.М. Грачева [и др.]. - М.: Легкая и пищевая промышленность, 19S2. - 240 с.
6. Полыгалина, Г.В. Определение активности ферментов. Справочник / Г.В. Полыгалина, В.С. Чередниченко, Л.В. Римарева. - М.: ДеЛи принт, 2003. - 376 с.
7. Бачурин, А.П. Влияние некоторых физико-химических воздействий на активность Глюкаавома-рина Г20х / А.П. Бачурин // Ферментная и спиртовая промышленность. - 19S5. - №2. - С. 15-17.
S. Некоторые кинетические характеристики ферментного препарата Амилоризин П10х / И.Б. Ко-болева [и др.] // Ферментная и спиртовая промышленность. - 19S6. - №4. - С. 40-42.
© В. С. Гамаюрова - д-р хим. наук, проф., зав. каф. пищевой биотехнологии КГТУ, gamaur@kstu.ru; М. Е. Зиновьева - канд. техн. наук, доц. той же кафедры, zino-mari@yandex.ru; К. Л. Васина - асп. той же кафедры, 0202-S4@mail.ru.
