CC BY
35
УДК 616.379-008.64; 611-018.26; 616-018
АДИПОЦИТОТОКСИКОЗ И ДЕГРАДАЦИЯ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ ТИПА 2
Г.С. Козлов
Ярославская государственная медицинская академия
Ключевые слова: сахарный диабет типа 2, ожирение, инсули-норезистентность, клеточная мембрана, инсулиновый рецеп-торный сигнал, адипоцитотоксикоз, апоптоз бета-клеток KEY WORDS: diabetes 2 type, obesity, insulin resistance, cellular membrane, receptor insulin signaling, adipocyte toxicosis, p-cell death
Сахарный диабет представляет собой метаболическое (обменное) заболевание, характеризующееся гипергликемией, которая является результатом дефекта секреции инсулина, действия инсулина или обоих этих факторов [39]. При всей обширности этиопатогенеза диабета (более 50) большинство больных (70—85%), согласно выборочным исследованиям в Европе и России [4,5], относится к диабету типа 2. Ин-сулинорезистентность, компенсаторная гиперин-сулинемия с повышением концентрации С-пеп-тида/инсулина в крови натощак, отсутствием аутоантител к островковым антигенам, инсулину, декарбоксилазе глутаминовой кислоты ^О), к тирозиндегидрогеназе (1А-2) — основные критерии, в противоположность диабету типа 1 с им-муноопосредованной деструкцией бета-клеток и абсолютным дефицитом инсулина. Сахарный диабет типа 2 варьирует от выраженной инсу-линорезистентности и относительной недостаточности гормона до выраженного дефекта секреции инсулина с инсулинорезистентностью [39]. В целом для больного и клинициста важно понять истоки гипергликемии и эффективно лечить её [4]. Диабет типа 2 часто ассоциирован с высокой генетической предрасположенностью по родственным связям I и II степени (от 70% и выше). Риск развития диабета типа 2 увеличивается с возрастом, при абдоминальном ожирении, снижении физической активности, при наличии артериальной гипертензии, дисли-пидемии [39]. За последние годы возникла
проблема диабета типа 2 у подростков, которая тесно связана с ростом ожирения среди детей, оно же в 55% является причиной инсулиноре-зистентности [17,27]. Частое сочетание диабета типа 2 с ожирением (более 80%), АГ и дисли-пидемией (более 50%) свидетельствует о том, что это не случайное явление и имеет этиопато-генетическую общность.
• Для всех трех ассоциированных заболеваний свойственна высокая генетическая предрасположенность.
• Распространенность диабета типа 2 и АГ нарастает с возрастом и наибольшего уровня достигает к 65-75 годам, периоду биологического старения.
• Инсулинорезистентность оказывается общим патофизиологическим компонентом, связывающим диабет типа 2, АГ и ожирение висцерального типа.
• Адипоциты висцеральной жировой ткани воспринимают специфические гормональные сигналы [44] и сами продуцируют макромолекулы с выраженной биологической активностью, разнонаправленным действием — свободные жирные кислоты, цитокины, ади-понектин и др. Адипоциты по сути являются составной частью многофункциональной, диффузной нейроиммуноэндокринной системы, участвующей в регуляции биологических процессов на клеточном (паракринном) и системном уровне.
• Нарушения функционирования клеточных мембран свойственны диабету типа 2, АГ и висцеральному ожирению. Недостаточная эффективность действия инсулина (инсули-норезистентность) обусловлена нарушением передачи сигнала инсулина мембранными полипептидными субстратами рецептора внутрь клетки и последующего транспорта глюкозы в клетки-мишени глюкозотранспортером-4 (ГЛЮТ-4). Инсулинзависимые ткани (мышечная, жировая, печень) нуждаются в более высоком уровне гормона в крови, чтобы обеспечить должный транспорт глюкозы через клеточные мембраны и её утилизацию. Возможные генетические дефекты плазматических мембран с возрастом накапливаются под воздействием неблагоприятных внешних (экологическая среда, питание, физическая активность и др.) и внутренних факторов (продуктов метаболизма). В частности, несбалансированная продукция адипоцитами в избытке одних макромолекул (свободные жирные кислоты, цитокины) и недостаточная — других (адипонектин, пролиферато-ром пероксисом активируемый ядерный ре-цептор-у — РРЛК-у) способствуют дезорганизации функционирования плазматических мембран клеток-мишеней для инсулина [14,43,46,47]. Процессы дезорганизации клеточных мембран, характерные для диабета типа 2 и свойственные АГ, отличаются по преимущественному набору тканей, ферментных систем, глубине нарушений. Среди многочисленных взглядов на истоки развития и поддержания эссенциальной АГ наряду с нейроэндокринной теорией [1] сохраняется признание роли мембранных нарушений [8]. В клинике и эксперименте установлено повышение проницаемости клеточных мембран при АГ для натрия (), обусловленное торможением натрий-калиевого насоса (№+-К -АТФазы). В результате увеличения количества внутриклеточного натрия и концентрации кальция повышается чувствительность клеток гладких мышц сосудов к симпатическим стимулам [8,9]. Одновременно у пациентов с АГ без ожирения определялось повышение р-адренорецепции клеточных мембран, как при нормальном уровне инсулина в крови, так и при гиперинсулинемии, но у последних оно было несколько выраженнее [9]. Есть сведения о нарушении трансмембранного транспорта у детей с нормальным АД,
чьи родители страдали АГ [8]. Нейроэндокрин-ные и мембранные расстройства с генетической предрасположенностью рассматриваемых болезней тесно переплетаются между собой. Сахарный диабет и АГ сопровождаются активированием тканевой (почечной, эндотелиальной) ренин-ангиотензинной системы [1]. Наряду со многими эффектами ангиотензина II (ATII) установлено негативное влияние октапептида на трансмембранный транспорт глюкозы в инсу-линзависимых тканях вследствие торможения активированных белков, обеспечивающих транслокацию транспортера глюкозы [31,32]. Артериальная гипертензия, ожирение — частые спутники диабета типа 2 [30] резко повышают риск неблагоприятного исхода сосудистой и сердечной патологии.
Из мозаичных причин, которые поддерживают, усугубляют инсулинорезистентность и неадекватную секрецию инсулина, запускают апоп-тоз бета-клеток при диабете типа 2 и прогрес-сирование сосудистой и органной патологии, ведущее положение занимают:
1. Дезорганизация функционирования специфических мембранных белков, инсулиновых рецепторных субстратов (IRS 1 и IRS 2) и ли-пидного бислоя мембран.
2. Избыток массы висцеральной жировой ткани и/или секреции адипоцитами биологически активных веществ (свободные жирные кислоты, фактор некроза опухолей-а—ФНО-а, ин-терлейкины, лептин) и неадекватная секреция субстратов, повышающих чувствительность тканей к инсулину (адипонектин, PPAR-y), вызывает тканевой клеточный токсикоз — адипо-цитотоксикоз.
3. Взаимное влияние основных обменных метаболитов: гипергликемии ^ на липидемию ^ и на ^ свободнорадикальное окисление, и наоборот.
4. Дисфункция бета-клеток островков поджелудочной железы с последующей их деградацией, уменьшением клеточной массы вследствие апоптоза, усиливаемого адипоцитотоксикозом, хронической гипергликемией, липидемией, сво-боднорадикальным окислением.
Транспорт глюкозы в клетки осуществляется путем облегченной диффузии, белками переносчиками — глюкотранспортерами (ГЛЮТ-1-5). В инсулинзависимых тканях (мышечная, жировая, печень, бета-клетки) утилизация глюкозы происходит с участием инсулина и ГЛЮТ-4,
ГЛЮТ-2 (бета-клетки, печень), с многоступенчатым процессом фосфорилирования мембранных и внутриклеточных белковых единиц, с некоторой затратой энергии. Эугликемия в организме зависит от скорости высвобождения глюкозы печенью, равной скорости утилизации её мозгом и периферическими тканями. Из ин-сулинзависимых тканей до 80% глюкозы поглощается мышцами. Инсулин усиливает поступление глюкозы в 20—40 раз. В мышечной ткани (миоциты) присутствует и подобный эритроци-тарному ГЛЮТ-1 [20]. Головной мозг, эндоте-лиальные клетки, мозговой слой почек, эритроциты транспортируют глюкозу без участия инсулина, в этом мы убедились в опытах с эритроцитами, используя радиоактивный фосфор (32Р). Специфические инсулиновые комплексы определяются и на мембранах некоторых клеток, которые не классифицируются как инсулинзависимые. В физиологических условиях в инсулинзависимых тканях достаточно всего 10% рецепторов [10] для достижения оптимального биологического действия.
Рецепторные специфические белки плазматических мембран клеток-мишеней для инсулина представлены двумя полипептидными субстратами (субъединицами) ШБ-1 и ШБ-2, содержащими 179 и 620 аминокислотных остатков, включая тирозиновые и серин/треониновые остатки. Специфическая мембранная субъединица инсули-нового рецептора (ШБ-2) пронизывает плазматическую мембрану и погружается в цитоплазму. Инсулиновые рецепторные субстраты (ШБ) обладают тирозинкиназной и серин/треонинкиназ-ной активностью, стимулирование которых обеспечивает фосфорилирование соответствующих аминокислотных остатков. Фосфорилирование ШБ по тирозину усиливает (определяет) передачу сигнала инсулина, а преимущественное фос-форилирование по серин/треонину тормозит продвижение гормонального сигнала.
Реализация инсулинового сигнала в физиологических условиях:
1. Инсулин связывается с выступающей частью специфического для инсулина полипептидного субстрата мембраны (ШБ-1) клеток мишеней [16]. Имеются отличительные особенности роли ШБ-1 и ШБ-2 в отдельных тканях: в печени и бета-клетках поджелудочной железы более значима роль ШБ-2, а в мышцах — ШБ-1 с однотипным механизмом передачи сигнала.
2. Взаимодействие инсулина с рецепторным субстратом (IRS-1) стимулирует действие второго специфического рецепторного субстрата (IRS-2), который обладает протеинкиназной активностью, в результате чего и возрастает реактивность тирозинкиназы и последующее фосфорилирование тирозиновых остатков.
3. Преимущественное фосфорилирование тирозиновых остатков IRS и фосфорилирование околомембранных белков (проонкогена СВ1, связывающего белка САР), которые участвуют в активировании процесса транслокации ГЛЮТ-4 в плазматическую мембрану, является ключевым этапом передачи гормонального сигнала в клетку.
4. Вслед за фосфорилированием тирозино-вых остатков IRS и околомембранных белковых единиц включается каскад стимулирования ферментных систем цитоплазмы. С участием протеинкиназ (протеинкиназа C), фосфолипа-зы C происходит накопление субстратов в клетке (инозитолтрифосфата, фосфатидилинозито-ла, диаглицерина).
5. В результате каскада образования серии сигнальных молекул, запущенных инсулином, активируются два основных фермента, которые определяют внутриклеточные эффекты гормона: фосфатидилинозитол-3-киназа (PI-3-K), мито-генактивируемая протеинкиназа (МАР-киназа).
6. Фосфатидилинозитол-3-киназа активирует перемещение ГЛЮТ-4 к наружной поверхности плазматической мембраны, транспорт глюкозы внутрь клетки и её последующий метаболизм; МАР-киназа участвует в регулировании процессов клеточного роста [16].
7. Инсулин с участием мембранных рецеп-торных белков погружается в цитоплазму и подвергается протеолизу в лизосомах клетки. Плазматические рецепторные субстраты вновь встраиваются в мембрану клетки и до деградации успевают проделать несколько циклов взаимодействия с гормоном.
Липидным бислоем плазматических мембран обеспечивается физиологическое функционирование клеточных мембран, специфических ре-цепторных белков, ферментов, транспортных систем. В поддержании стабильного состояния липидного бислоя, мембранных белков, ферментов существенная роль принадлежит антиоксидан-там, присутствующим в мембране (а-токоферол, убихиноны, а-липоевая кислота), естественным клеточным ферментам (супероксиддисмутаза,
глутатионпероксидаза). Функцию ловушек свободных радикалов выполняют гидрофильные головки фосфолипидов.
Нарушения эффективности действия инсулина могут возникать на любом этапе передачи сигнала, начиная от связывания гормона с вне-мембранной (возвышающейся) частью специфического рецепторного белка IRS до активирования внутриклеточных ферментов, функционирования транспортеров глюкозы [16]. Наиболее уязвимыми являются 2-й и 3-й этапы передачи инсулинового сигнала: активирование тирозин-киназы и фосфорилирование тирозиновых остатков рецепторных белков. Разобщение фос-форилирования тирозиновых остатков IRS тормозит дальнейшую передачу инсулинового сигнала [49]. В физиологических условиях многие факторы оказывают влияние на эффективность действия инсулина. Действие гормона усиливают физическая нагрузка [40], инсулинопо-добный фактор роста (ИФР-1), гормон роста, пируват, глутамат, а-липоевая кислота и другие факторы, опосредуемые рецепторными белками [16]. Чувствительность к инсулину снижается при недостаточности хрома, поступающего в организм [22,26,36].
Инсулинорезистентность, недостаточная эффективность действия гормона, часто с компенсаторной секрецией его и гиперинсулинеми-ей, считается ключевым компонентом при ряде патологических состояний. В физиологических условиях нарушение толерантности к глюкозе и инсулинорезистентность проявляются в периоды нейроэндокринной перестройки: половое созревание, беременность, старение, отсутствие физической активности, прием пищи с высоким содержанием жира. Из патологических состояний, при которых инсулинорезистентность обычно сочетается с гиперинсулинемией, дислипиде-мией, таких, как ожирение андроидного типа, диабет типа 2 [42], метаболический синдром, АГ [15,35] особое внимание привлекает синдром системной липоатрофии [38].
Парадоксально, что при крайних состояниях содержания жировой ткани, при системной ли-поатрофии и висцеральном ожирении происходят одинаковые метаболические нарушения: инсулинорезистентность , гипертриглицеридемия, дислипидемия по холестерину, повышение уровня в крови свободных жирных кислот, снижение содержания адипонектина. В клинической картине системной липоатрофии отчетливо вы-
ступают симптомы гиперметаболизма: исчезновение жирового депо, чрезмерный аппетит, повышенное потоотделение, непереносимость жары, увеличение дыхательного коэффициента. Все это, вероятно, связано со своеобразной активностью функционирования остаточной жировой ткани, с увеличением отложения липидов и содержания триглицеридов в гипертрофированных мышцах, скоплением жировых капель в поджелудочной железе с её клеточной гиперплазией, увеличением содержания триглицеридов в печени [38]. Дыхательный коэффициент — отношение объема выделившегося углекислого газа к объему кислорода (С02/02), поглощенного тканью за определенное время, отражает тканевое дыхание, а его увеличение свидетельствует о повышении расхода энергии над её образованием с участием в этих процессах свободных жирных кислот [38].
Адипоциты жировой ткани разной локализации неоднородны по функциональным особенностям, что отражается на клинической картине висцерального (андроидного) и ягодично-бед-ренного ожирения. Адипоциты висцеральной жировой ткани имеют более высокую иннервацию и кровоснабжение, плотность рецепторов для ряда гормонов.
Исследованиями системы кортиколиберина в жировой ткани, сердце человека было установлено присутствие в жировой ткани двух типов рецепторов кортикотропин-рилизинг-гормона (Р-1 и Р-2 КРГ). Экспрессия Р-1 КРГ была выше в подкожной жировой ткани, чем в висцеральной. Экспрессия Р-2 КРГ оказывалась сравнимой с экспрессией его в сердце (органе с максимально известной экспрессией Р-2 КРГ). Именно, экспрессия Р-2 КРГ более высокой была в висцеральной жировой ткани. В изолированных адипоцитах человека кортиколиберин подавлял РНК Р-1 КРГ и Р-2 КРГ. Существующая система кортикотропин-рилизинг-гормо-на в жировой ткани, по мнению авторов, участвует в регулировании энергетического гомеос-таза человека, его аппетита [44].
Свободные жирные кислоты наряду с высокой энергетической ценностью выполняют важную пластическую функцию (в построении биологических мембран в составе фосфолипидов, в биосинтезе простагландинов и др.). Жирные кислоты, подобно гормонам щитовидной железы, обладают способностью активировать тканевое дыхание, вызывать разобщение свободного
окисления и фосфорилирования, приводящее к рассеиванию энергии, которая не фиксируется в виде фосфорильной связи молекулы АТФ, а принимает вид тепловой энергии [38] . В физиологических условиях повышенная концентрация свободных жирных кислот подавляет транспорт и утилизацию глюкозы в сердечной мышце. У молодых людей умеренный избыток жира в организме не влияет на чувствительность тканей к инсулину, но приводит к повышенному окислению липидов натощак [41]. Хроническое повышение уровня свободных жирных кислот в плазме влечет за собой патофизиологические последствия — развитие периферической и ге-патоцитарной инсулинорезистентности [14]. Внутриклеточные липиды и свободные жирные кислоты в повышенных концентрациях тормозят передачу сигнала инсулина, вызывая снижение инсулинзависимого транспорта глюкозы в мышцах. При хроническом повышении уровня свободных жирных кислот в плазме крови снижается ответная реакция бета-клеток на стимулирующее воздействие глюкозы [47]. У больных с ожирением и диабетом типа 2 в скелетных мышцах повышается содержание триглицери-дов, масса жира в них четко коррелирует с ин-сулинорезистентностью [28]. Снижение инсу-линзависимого транспорта глюкозы в мышечных клетках под воздействием свободных жирных кислот объясняют тем, что они активируют каскад серинкиназы с участием протеинкиназы C, других киназ. В результате возрастает фосфо-рилирование остатков серина в составе IRS-1, на ключевом этапе передачи сигнала инсулина, разобщается фосфорилирование тирозиновых остатков IRS (инсулинового рецепторного субстрата), необходимых для активирования внутриклеточных ферментов, фосфатидилинози-тол-3-киназы (IP-3-K) и функционирования ГЛЮТ-4. Обоснован вывод, что любые изменения, вызванные увеличением внутриклеточного содержания липидов (метаболитов жирных кислот) в мышцах, приобретенные или обусловленные врожденными дефектами метаболизма жира в адипоцитах, будут приводить к инсулинорези-стентности [42].
Адипоцитокины — группа цитокинов, растворимых белков, выделяемых не только моноцитами, но и адипоцитами. Фактор некроза опу-холей-а, ИЛ-6 и ИЛ-1 способны оказывать ближнее и дальнее бесконтактное воздействие на клетки или взаимодействовать с плазмати-
ческими рецепторами клеток [8]. Среди многочисленных эффектов (регулирование воспалительной и иммунной реакции) адипоцитокины играют существенную роль в развитии и про-грессировании инсулинорезистентности [16,23, 25], апоптозе бета-клеток [23,43]. Фактор некроза опухолей-а выделяют и макрофаги, основные эффекты его — индукция выработки ИЛ-1 и ИЛ-6, цитотоксическое, цитостатическое, про-воспалительное действие [8]. У больных ожирением, диабетом типа 2 концентрация ФНО-а, ИЛ-6, лептина повышена в плазме, в противоположность адипонектину [16,29]. В инсулин-зависимых тканях ФНО-а, ИЛ-6 через опосредованные реакции тормозят передачу сигнала инсулина и активирование ключевых ферментов цитоплазмы — PI-3-K и МАР-киназы, за счет увеличения фосфорилирования сериновых остатков в молекуле мембранного субстрата IRS и соответственно торможения фосфорилирова-ния остатков тирозина. Однако имеются исследования, в которых показано, что ФНО-а не снижает чувствительность миоцитов к инсулину, но поскольку ФНО экспрессируется в ади-поцитах, вероятно, и индуцирует в них инсули-норезистентность [13]. Уровень ФНО-а в крови возрастает при сепсисе, для которого характерна и инсулинорезистентность [16]. По-видимому, провоспалительные цитокины причастны к декомпенсации диабета типа 2 при остром и персистирующем инфекционном воспалении.
Адипонектин продуцируется только жировой тканью. У больных ожирением, диабетом типа 2 содержание адипонектина в плазме крови снижено, а у больных диабетом типа 1 даже более высокое, чем у здоровых [19, 29]. У лиц с нормальной массой тела (967 японцев) концентрация адипонектина в плазме отрицательно коррелировала с индексом массы тела, уровнем систолического и диастолического АД, концентрацией глюкозы и инсулина в плазме, общего холестерина, триглицеридов и мочевой кислоты, выраженностью инсулинорезистентности, но положительно коррелировала с концентрацией холестерина липопротеидов высокой плотности [19]. Повышение массы жировой ткани, висцерального жира — основного депо свободных жирных кислот ведет к снижению уровня адипонектина в плазме и повышению ФНО-а, ИЛ-6, лептина. Снижение адипонектина в крови вызвано снижением экспрессии гена адипонек-
тина в жировой ткани [19,29]. Низкая концентрация адипонектина в крови, низкая экспрессия его в жировой ткани вовлечены в патогенез диабета типа 2. Введение животным адипонек-тина с экспериментальным сахарным диабетом приводит к повышению чувствительности к инсулину. Полагают, что адипонектин подавляет воспаление и атерогенез. Двухгодичные наблюдения показали, что концентрации адипонекти-на в сыворотке крови позволяют прогнозировать инсулинорезистентность в будущем, но не изменения липидного профиля [48].
Ядерный рецептор-у, активируемый проли-фератором пероксисом (PPAR-y), на высоком уровне экспрессируется в жировой ткани в виде изоформы — у-2 и у-3. Изоформы PPAR-y занимают важное положение в дифференцировке жировых клеток, вызывая экспрессию специфических для них генов и побуждая образование адипоцитов, содержащих липиды [11,25]. Активация PPAR-y может влиять на различные этапы передачи сигнала инсулина в жировой ткани. Изоформы PPAR-y оказывают регуля-торное воздействие на экспрессию и синтез макромолекул, которые участвуют в реализации ин-сулинового сигнала в клетках-мишенях: мембранных субстратов инсулинового рецептора (IRS), фосфатидилинозитол-3-киназы, ГЛЮТ-4 и других белков. На основании проведенных исследований полагают, что имеется метаболический диалог между чувствительностью к инсулину тканей по утилизации глюкозы. Факторы, которые продуцируются жировой тканью и вызывают нарушение поглощения глюкозы ади-поцитами, приводят к нарушению чувствительности к инсулину других тканей-мишеней [25]. Отмечена ассоциация PPAR с развитием ожирения и инсулинорезистнентности [11]. Наиболее сильнодействующими из известных активаторов PPAR-y оставались синтетические лиганды тиазолидиндионы (ТЗД) и агонисты тирозина [11,25].
Свободнорадикальные процессы при диабете типа 2 остаются в центре исследований механизмов развития, прогрессирования диабета и сердечно-сосудистой патологии [15,33,43,45,46]. Хроническая гипергликемия у больных диабетом типа 2 провоцирует избыточное образование свободных радикалов и снижает антиокси-дантную защиту [12,15,46]. Изменения в анти-оксидантном статусе проявляются на ранних
стадиях диабета значительным снижением уровня витаминов A и E в плазме крови, антиокси-дантных ферментов каталазы и в меньшей степени супероксиддисмутазы в эритроцитах [33]. В условиях in vitro на эндотелиальных клетках коронарных микрососудов изучали влияние глюкозы в физиологических (5,5 ммоль/л) и высоких (22 ммоль/л) концентрациях на активность и концентрацию оксида азота (NO), супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпе-роксидазы [46]. Высокие концентрации глюкозы в окружающей среде вызывали повышение активности субстратов с прооксидантным действием и снижением образования глутатиона в эн-дотелиальных клетках мелких коронарных сосудов. Среди основных механизмов развития диабетической микроангиопатии вследствие хронической гипергликемии: а) усиление метаболизма глюкозы по полиоловому пути, б) повышение конечных продуктов гликирования, в) активности изоформ протеинкиназы C, г) особая роль отводится влиянию гипергликемии на сво-боднорадикальное окисление, на избыточную продукцию свободных радикалов [45]. Последние вызывают повреждение, перестройку структуры липидов, белков, ДНК, других субстратов клеток и способствуют повреждению мелких сосудов. Риск развития микрососудистых осложнений снижают витамин E (токоферол), ингибитор протеинкиназы C [45]. Наши исследования перекисного окисления липидов в плазматической мембране эритроцитов свидетельствовали о выраженной интенсификации свободнорадикаль-ного окисления мембранных липидов у больных с впервые выявленным диабетом типа 2, интенсивность перекисного окисления липидов мембраны клеток еще более возрастала у пациентов с определенной длительностью диабета. Накопление продуктов перекисного окисления липи-дов в клеточной мембране сочеталось с деструктивными изменениями в липидном бислое, физических свойств клеток, их пластичности, за счет снижения мембранных фосфолипидов.
Липидный бислой плазматической мембраны у больных диабетом типа 2, как показали наши исследования, претерпевает изменения на ранних стадиях болезни. Бислой на 80—85% представлен холестерином и фосфолипидами, он создает оптимальную среду функционирования мембранных белков. В тканях органов фосфо-липиды сосредоточены в биологических мембра-
нах и участвуют в трансмембранном транспорте субстратов, активации энзимов [2]. В наружном липидном монослое преобладают фосфати-дилхолины (наиболее распространенный вид фосфатидов), во внутреннем — фосфатидилэта-ноламины и фосфатидилсерины.
В нашей клинике были изучены: липидный состав мембраны эритроцитов, перекисление липидов плазматической мембраны, способность эритроцитов к деформации и влияние отдельных видов лечения больных диабетом типа 2 на эти процессы. Ранее нами было установлено, что изменения в плазматической мембране эритроцитов, выявляемые in vitro, отражают состояние клеточных мембран других тканей (кардиомиоцитов) в целостном организме. Биохимические исследования осуществлялись в лаборатории кафедры. Иммунореактивный инсулин и C-пептид в сыворотке крови определялись в радиологической лаборатории кафедры лучевой диагностики. Исследования охватывали 149 пациентов с диабетом: 112 больных диабетом типа 2, из них 78 с впервые выявленным, преимущественно женщин (80%) в возрасте 50—60 лет (72%); 37 пациентов были с диабетом типа 1. Группу сравнения составляли 70 трудоспособных лиц с отсутствием генетической предрасположенности к диабету и нормальными показателями углеводного обмена, но близкими по возрасту, полу к подгруппам пациентов с диабетом типа 2. Среди лиц с диабетом типа 2 ожирение было у 88%, отягощенная наследственность — у 66%, артериальная гипертензия — у 49%. Больные диабетом типа 2 определенной давности (6,5 года) поступали в клинику с декомпенсацией диабета (34 пациента) на фоне приема ма-нинила или манинил + метформин (16 и 18 пациентов). У больных этой группы были признаки периферической нейропатии (в 44%), ангиопа-тии нижних конечностей I—II стадии (в 18%), нефропатии в доклинической стадии (18%).
Липидный состав плазматической мембраны эритроцитов у больных диабетом типа 2 существенно отличался от группы сравнения по содержанию холестерина, общих фосфолипидов и их качественному составу. При впервые выявленном диабете типа 2 установлено снижение в клеточной мембране общих фосфолипидов на 9,7% (p < 0,01), увеличение холестерина (мг/г белка) на 14,5% (p < 0,001), соответственно было снижено соотношение содержания общие фосфо-
липиды/холестерин (2,06 ± 0,04 и 2,71 ± 0,06 у лиц контрольной группы, р < 0,001), последний показатель так же отличался и в сравнении с лицами без диабета, но с ожирением. Снижение уровня общих фосфолипидов в мембране происходит за счет фосфатидилхолина, сфинго-миелина (по относительному количеству в составе общих фосфолипидов и абсолютному количеству их (мг/г белка) клеточной мембраны) на 18—19% ниже, чем в контрольной группе (р < 0,001), снижено было и содержание фос-фатидной кислоты (р < 0,01). Однако у больных было увеличено относительное и абсолютное содержание лизофосфатидилхолина (мг/г белка до 27%, р < 0,05), относительное количество в мембране фосфатидилэтаноламина (на 4,5%, р < 0,01) и незначительно — фосфати-дилсерина.
У больных с определенной давностью диабета типа 2 состояние липидной структуры плазматической мембраны зависело от компенсации диабета, предшествующей базисной сахаросни-жающей терапии сульфонилмочевинными препаратами или метформином. В период декомпенсации болезни, с чем поступали больные в клинику, несмотря на прием сахароснижающих препаратов, определялись идентичные изменения в липидном бислое клеточнойй мембраны, что и у больных с впервые выявленным диабетом типа 2. Они заключались в существенном повышении содержания холестерина (р < 0,001), снижении общих фосфолипидов (р < 0,05) и соответственно снижении соотношения общие фосфолипиды/холестерин (р < 0,001); снижении фосфатидилхолина (р < 0,001), фосфатидной кислоты (р < 0,001), сфингомиелина (р < 0,05), но возрастало содержание лизофосфатидилхо-лина по сравнению с таковым в контрольной группе. Гиперинсулинемия оказывала заметное негативное влияние на липидный спектр клеточной мембраны только при значительном увеличении базального уровня инсулина в плазме, в 3,5—4 раза выше нормы, что проявлялось снижением фосфатидилхолина в мембране и соотношения фосфолипиды/холестерин (2,16 ± 0,06 и 1,90 ± 0,09, р < 0,05). У лиц с ожирением и АГ из группы сравнения без диабета (при ограниченной численности — 25 и 10 человек) отмечалась тенденция к изменению в липидном составе мембраны, сходная с таковым у больных диабетом типа 2, более отчетливая у лиц с АГ.
Перекисное окисление липидов мембраны эритроцитов оценивалось по содержанию его продуктов в экстрактах липидов — диеновых ко-нъюгатов и малонового диальдегида на грамм белка и грамм фосфолипидов, рассчитывался коэффициент деградации мембранных фосфо-липидов. Комплексное изучение в различных группах больных с впервые выявленным диабетом типа 2 и диабетом продолжительного течения свидетельствовало о высокой интенсивности перекисного окисления липидов, которая нарастала в период декомпенсации диабета, ухудшала пластические свойства клеток, способность к деформации в связи с нежелательными липидными перестройками в липидном бислое мембраны. У больных с впервые выявленным диабетом содержание в мембранах диеновых конъюгатов в расчете на г/белка и г/фосфо-липидов было выше, чем в контрольной группе на 18 и 39% (р < 0,001), а малонового диаль-дегида — на 52 и 50% (р < 0,001). У больных диабетом с продолжительным течением, получавших сахароснижающие препараты, но поступивших в клинику с декомпенсацией диабета, накопление продуктов переокисления липи-дов в мембранах было еще выше: по сравнению с контрольной группой диеновые конъюгаты возрастали на 50 и 74%, малоновый диальдегид даже на 74 и 100% (р < 0,001). В период компенсации диабета интенсивность переокисления липидов плазматических мембран снижалась, но не всегда, и положительные результаты зависели от сахароснижающей терапии. Перекис-ное окисление липидов несколько возрастает после 40 лет.
Увеличение содержания продуктов переокисления липидов: диеновых конъюгатов и малонового диальдегида в экстрактах липидов эритро-цитарных мембран на 20, 30% и выше вызывает деградацию липидного слоя, потерю фосфоли-пидов, локализованных преимущественно в наружном монослое (фосфатидилхолины), что подтверждается высокой корреляционной зависимостью между общими фосфолипидами и уровнем диенов (г — 0,573). Чрезмерная продукция компонентов переокисления липидов мембраны клеток, структурные изменения ли-пидного бислоя негативно влияли на важнейшее свойство эритроцитов — изменять конфигурацию, проходя через узкие пространства, что необходимо для тесного соприкосновения с эндо-
телием микрососудов. Пластичность эритроцитов, способность к деформации у больных диабетом существенно снижена. Между этим свойством эритроцитов и интенсивностью переокисления липидов мембраны установлена корреляционная связь (для диеновых конъюгатов г = 0,788, для малонового диальдегида г = = 0,331). Одновременно прослеживалась взаимосвязь между пластичностью эритроцитов и уровнем гликозилированного гемоглобина (г = = 0,609), проявлялось взаимовлияние между активностью переокисления липидов мембран и уровнем иммунореактивного инсулина, С-пеп-тида в плазме. Представленные материалы свидетельствуют о том, что при диабете типа 2 в плазматических мембранах происходят глубокие деструктивные изменения, касающиеся не только специфических инсулиновых рецептор-ных белков, но и липидного бислоя.
Состояние бета-клеток поджелудочной железы при диабете типа 2 и секреция инсулина ими претерпевает существенные нарушения. На определенном этапе течения диабета преобладающая инсулинорезистентность с ги-перинсулинемией постепенно сменяется выраженной недостаточностью секреции инсулина над инсулинорезистентностью [39]. Клиническое течение диабета типа 2, по-видимому, отражает и функционирующую массу бета-клеток, которая может быть увеличенной, нормальной [3,7] или значительно сниженной [43] вследствие усиленного апоптоза островковых клеток, превышающего их репликацию. Однако нарушения физиологической функции бета-клеток происходят в начальном периоде диабета [18]. Бета-клетки островков теряют адекватную реакцию на введение глюкозы, прием углеводов: выпадает первая фаза быстрой секреции инсулина, пиковый уровень инсулина в плазме снижен и отсрочен, постепенно утрачивается свойство секреции инсулина в виде коротких волн. В физиологических условиях масса бета-клеток взрослого человека поддерживается на оптимальном уровне за счет уравновешивания процессов апоптоза и репликации, неогенеза [43]. Продолжительность жизни бета-клеток у взрослого человека, по некоторым оценкам, составляет 60 дней. Во второй половине жизненного цикла скорость апоптоза бета-клеток может превышать их репликацию, неогенез и масса клеток может снижаться [43]. На функционирование
бета-клеток прямое или опосредованное отрицательное влияние оказывают биологически активные макромолекулы, в избытке секретируе-мые адипоцитами (свободные жирные кислоты, ФНО-а, ИЛ-6, лептин), ИЛ-1, окислительный стресс, хроническая гипергликемия, липидемия [14,23,47]. Более того, эти факторы могут запускать процессы, усиливающие апоптоз бета-клеток [43], они же в совокупности причастны и к развитию инсулинорезистентности. Глюкоза является не только важной сигнальной молекулой, стимулирующей секрецию инсулина, она необходимый субстрат, обеспечивающий эффективную продукцию гормона [10]. Вещества, которые угнетают метаболизм глюкозы, гликолиз в островковых клетках, препятствуют секреции инсулина [10]. Транспортером глюкозы в бета-клетках служит ГЛЮТ-2. В плазматической мембране бета-клеток функционируют ин-сулиновые рецепторные субстраты (IRS-1 и IRS-2), которые обеспечивают проведение сигнала внутрь клетки, утилизацию глюкозы.
Обоснована концепция, что специфический полипептидный субстрат IRS-2 плазматической мембраны бета-клеток играет важнейшую роль и в регуляции их роста, и их выживания [43]. Преимущественное фосфорилирование тирози-новых остатков IRS-2 обеспечивает распространение гормонального сигнала, активирование белковых субъединиц, ключевых ферментов цитоплазмы. Фосфатидилинозитол-3-киназа (Р1-3-К) ответственна за стимулирование транслокации ГЛЮТ-2, транспорт, утилизацию глюкозы, ми-тогенами активируемая протеинкиназа (МАР-киназа) совместно с другими митогенами регулирует синтез субстратов, белков, клеточный рост. Преимущественное фосфорилирование се-рин/треониновых остатков IRS-2 разобщает фосфорилирование остатков тирозина, тормозит распространение сигнала инсулина ниже и, следовательно, активирование белковых субъединиц, ключевых ферментов цитоплазмы Р1-3-киназы и МАР-киназы. Это отражается на экспрессии специфических белковых субстратов плазматической мембраны бета-клеток — IRS, выживании бета-клеток. Снижение экспрессии IRS-2, первоначальное повреждение специфического субстрата, деградация его запускают и усиливают апоптоз инсулинпродуцирующих клеток [43].
Первоначальное воздействие на функционирование IRS, стимулирование серин/треонин протеинкиназы и фосфорилирование соответствующих аминокислотных остатков могут вызывать многие факторы. Однако повреждение, деградация IRS происходит от суммарных, накапливающихся прямых и опосредованных воздействий одновременно ряда факторов, что отражает и стадии клинического течения диабета типа 2 с преобладанием абсолютного дефицита инсулина. Основными совокупными причинами, вызывающими преимущественное фосфори-лирование серин/треониновых остатков IRS-2, последующую деградацию их и усиление апоп-тоза бета-клеток, являются метаболический и окислительный стресс, хроническая гипергликемия и липидемия, некоторые цитокины. Предполагаются различные механизмы возможного повреждения, деградации, снижения количества IRS-2 при диабете типа 2 [43].
1. Цитокины, лептин, в избытке секретируе-мые адипоцитами у больных диабетом и локально продуцируемые в островках (ИЛ-1, интерфе-рон-у), могут оказывать влияние на ускорение деградации рецепторного субстрата 2 и апоптоз бета-клеток: а) ИЛ-6, интерферон-у, лептин опосредованно усиливают экспрессию белков супрессоров, которые способны связываться с молекулами IRS-2 и вызывать последующую деградацию субстрата; б) ФНО-а, ИЛ-1-p активируют стрессовые протеинкиназы, изоформы про-теинкиназы C, которые способны стимулировать фосфорилирование IRS-2 по серин/треонину.
2. Хроническая гиперлипидемия приводит к аномальной аккумуляции липидов в бета-клетках. Свободные жирные кислоты, внутриклеточный ацетил-СоА могут стимулировать изо-формы протеинкиназы C, которая активирует фосфорилирование серин/треониновых остатков IRS-2.
3. Хроническая гипергликемия может вызывать активирование чувствительной к другим нутриентам серин/треониновую протеинкиназу IRS и запускать деградацию субстрата и апоптоз бета-клеток. Хроническое воздействие глюкозы индуцирует локальное образование ИЛ-1-p в островках, свободных радикалов. Гипергликемия совместно с липидемией, избытком свободных радикалов оказывают существенное влияние на метаболический стресс в бета-клетках.
4. Метаболический стресс вызывают: избыток свободных радикалов, провоцируемых гликемией и липидемией; повышение концентрации внутриклеточного кальция до цитотоксичес-кого уровня; нарушение функционирования эндоплазматической сети, накопление амилоида в клетках и проинсулина в гранулах бета-клеток; индуцирование митохондриального пути апоптоза продуктами липидного обмена (цера-мидами и др.) и стимулирование стрессовых ки-наз [43].
Механизмы активирования серин/треонино-вой протеинкиназы и фосфорилирования аминокислотных остатков ШБ-2 для каждого фактора нередко проходят многоступенчатый путь через взаимодействие активируемых сигнальных молекул [43]. Особого внимания заслуживает положение, что факторы и механизмы их действия, влекущие разобщение проведения ин-сулинового сигнала и снижение экспрессии специфических инсулиновых рецепторных субстратов в плазматической мембране клеток мышечной ткани, печени и бета-клеток островков поджелудочной железы, близки, сходны между собой. Именно эти механизмы причастны к регулированию чувствительности тканей-мишеней к инсулину, развитию инсулинорезистентности и влияют на выживание бета-клеток, их апоп-тоз. Нарушения баланса между инсулинорези-стентностью и компенсаторной реакцией бета-клеточной массы в связи с деградацией специфических мембранных субъединиц — ШБ-1 и ШБ-2 — ускоряет развитие диабета типа 2, его декомпенсацию.
Глубокие нарушения обмена веществ вследствие инсулинорезистентности и дисфункции инсулинпродуцирующих клеток, усиления их апоптоза при диабете типа 2 неизбежно влекут за собой развитие микроангиопатии и прогрес-сирование макроангиопатии с последующей полиорганной недостаточностью. Специфичной для диабета причиной микроангиопатии является хроническая гипергликемия с воздействием на макромолекулы окружающей среды, клетки (эндотелий, эритроциты и др.), плазматические мембраны. Прогрессирование макроангиопатии обусловлено дислипидемией (повышение уровня триглицеридов в крови, общего холестерина, липопротеидов низкой плотности, свободных жирных кислот, снижение фосфолипидов, ли-попротеидов высокой плотности), недостаточ-
ностью адипонектина в сочетании с другими факторами, свойственными атеросклерозу. Жировая ткань, особенно висцерального типа, с ее способностью продукции биологически активных макромолекул, гормоноподобных субстратов разнопланового действия является неотъемлемой частью универсальной нейроиммуноэндокрин-ной системы, обеспечивающей поддержание го-меостатического баланса организма. Гиперпродукция адипоцитами одних сигнальных молекул (свободные жирные кислоты, цитокины, леп-тин), недостаточная секреция и активация других полипептидов (адипонектин, PPAR-y) является важнейшей причиной инсулинорезистент-ности и диабета типа 2, как проявление адипоцитотоксикоза, лептин [49] наряду с инсулином, свободными жирными кислотами участвует в регулировании аппетита, отложении жировых запасов. Повышение индекса массы тела даже в пределах, не соответствующих ожирению, ведет к возрастанию риска диабета типа 2. Такое заключение было получено по данным наблюдения в популяции японцев — 8370 женщин и 16829 мужчин в течение 7,1 и 7,4 года с индексом массы тела 14,9—43,2 кг/м [37]. Диабет был диагностирован у 224 женщин и 869 мужчин в возрасте 30—59—65 лет. В США в конце прошлого века ожирение (индекс массы тела — 30 кг/м2 и выше) отчетливо ассоциировалось с высоким риском смертности. В последние годы влияние ожирения на смертность снизилось благодаря мерам по улучшению образа жизни, качества медицинского обслуживания, повышения интереса к физической нагрузке [21,40]. Нормализация массы тела, калорийно-ограниченная диета, даже в пожилом возрасте, замедляет темпы старения, продлевает продолжительность жизни [6]. Известно, что в пожилом возрасте функция клеточных мембран постепенно ухудшается, поэтому возрастает потреб -ность в защите их от продуктов метаболизма, не сбалансированных нутриентов, от повреждающего действия избытка свободных радикалов, относительной витаминной недостаточности, эс-сенциальных жирных кислот. Последние обеспечивают функционирование, текучесть клеточных мембран и активирование PPAR-y.
Известно, что основные пероральные саха-роснижающие средства: производные сульфо-нилмочевины, тиазолидиндионы, метформин [24] реализуют свое действие через своеобраз-
ные мембранные механизмы. Заслуживает внимания, что ряд современных сердечно-сосудистых средств могут оказывать некоторое ноложитель-ное влияние на транснорт и утилизацию глюкозы нериферическими тканями [15]. В частности, но-лагают, что блокаторы кальциевых каналов, ингибиторы AПФ, блокаторы реценторов ангио-тензина II, статины обладают внутриклеточной антиоксидантой активностью и (или) снижают негативное действие других макромолекул на сигнальную систему инсулина [15]. Своеремен-ное выявление и лечение заболеваний, ассоциированных с диабетом тина 2, снособствуют снижению темнов развития микро- и макросо-судистых осложнений. Tеcная взаимосвязь диабета с ожирением, сердечно-сосудистой натоло-гией онределяет и многоцелевые нринцины лечения, рациональный нодбор лечебных средств в зависимости от комнлекса клинических нрояв-лений болезни.
ЛИTEPATУPA
1. Белен^в Ю.Н., Mapeeв В.Ю., Агеев Ф.^ Ингибиторы aнгиoтeнзиниpeвpaщaющeгo фермента в лечении cepдeчнo-cocyдиcтых зaбoлeвaний. M.; 2001. SB.
2. Бышeвcкий А.Ш., Tepceнoв O.A. Биoхимия для врачей. Екатеринб^г. Урал. Paбoчий; 1994. 3S4.
3. Bнyтpeнниe бoлeзни в 10 книгах. Peд. Харришн T.P. Книга 9. Сахарный диабет. (Дэниел У. Фocтep). M.: Meдицинa; 1997. 1S5-227.
4. Гeтepoгeннocгь caхapнoгo диабета. Ocoбeннocти дебюта зaбoлeвaния (клaccификaция, диaгнocтикa, лечение, вoзмoжнocти иpoфилaктики). Пocoбиe для врачей. Шд ред. И.И. Дeдoвa. M.; 2001. 23.
5. Дeдoв И.И., Шecгaкoвa M.B. Сахарный диабет. M. Унивepcyм Пабл; 2003. 445.
B. Инфopмaция. Boзмoжнocти и иepcиeктивы ^елте-ния иpoдoлжитeльнocти жизни. Дoкл. B.H. Aниcи-мoв. Клин. гepoнтoл. 2005; 7: 72-74. 7. Pyкoвoдcтвo то клиничecкoй эндoкpинoлoгии. Пoд
ред. B.r. Бapaнoвa. Л.: Meдицинa; 1977. 31-13S. S. Pyкoвoдcтвo иo медицине. Peд. Бepкoy P., Флетчер Э. Биoлoгия иммyннoй cиcтeмы. Apтepиaльнaя гииертен-зия. M.: Mиp;1977;1. 1S1-193; 275-2S7.
9. Стрюк P.И., Toкмaчeвa И.Г., Левитская З.И. Карди-oлoгия 1997; 10: 34-39.
10. Эндoкpинoлoгия и мeтaбoлизм. T. 2. Пoд ред. Фели-га Ф., Бaкcтepa Дж. Д., Бpoдyca A.E. Эндoкpиннaя чacть иoджeлyдoчнoй железы: caхapный диабет. Ф. Фелиг. M.; 19S5. 7-217.
11. Aleman Gabriela, Torres Nimbl, Tovar Armando R. Rev. invest clin. 2004; 5B (3): 351-3B7.
12. Baynes J.W. Perspectives in diabetes. Diabetes. 1991; 40: 405-412.
13. Byrne Christopher. Clin. Sci. 2000; 99 (4): 329-330.
14. Boden G., Shulman G.J. J. Clin. Invest. 2002; 32 ирил.: 14-23.
15. Ceriello A., Motz E. Biol. 2004; 24 (5): S1B-S23.
1B. Col V. Rev. Assoc. Belge techol lab. 2002; 29 (1): 919.
17. Daaboul J.J. and Silvor Stein J.H. Minerva pediater. 2004; 56 (3): 255-264.
18. Del Prato S. Diabetologia. 2003; 46 (1) Прилож.: M2-M8.
19. Diez J.J. Europ. J. of Endocrinology 2003; 14: 293300.
20. Eckel J. Horm. Metab. Res. 1996; 28: 508-511.
21. Flegal K.M., Graubard Williamson D.T. J. Amer. Med. Assoc. 2005; 293 (15): 1861-1867.
22. Goldstein Barry J., Zhu Li, Hager Richard, Zilbering Assat, Sun Vanjie, Vincent John B.J. Trace Elem. Exp. Med. 2001; 14 (4): 394-404.
23. Greenberg A.S., Mc Danied M.L. et al. Europ. J. Clin, Invest. 2002; 32 (прилож. 3): 24-34.
24. Gunton Jenny E., Delhanty Patric J.D., Takahashi Shin-Ychiro, Baxter Robert C.J. Clin. Endocrinol. and Metab. 2003; 88 (3): 1323-1332.
25. Gurnell M. Clin. Endocrinol. 2003; 59 (3): 267-277.
26. Heinitz M. Naturheilverfahr. 2004; 45 (4): 214-219.
27. Kaufman F.R. Rev. Endocr. and Metabol Disorders. 2003; 4 (1): 33-42.
28. Kelley Davidt, Goodpaster Bret H., Storlien Len. Annual Review of Nutrition. 2002; 22: 325-346.
29. Коев Драгамир. Ендокринология. Болг. 2004; 9 (1): 22-32.
30. Krauss R.M., Winston M. Circulation. 1998; 98: 14721476.
31. Malik F.S., Lavie C.J., Mehra M.R. et al. Amer. Heart J. 1997; 134: 514-526.
32. Mc Farlance S.I., Banerji M., Sowers J.R. J. Clin. Endocrinol. and Metab. 2001; 86: 713-718.
33. Merzonk S. Gen. Physiiol. and Biophys. 2003; 22 (1): 15-17.
34. Miyantake N., Takahoshi K., Wada J., Nishikawa H., Morishita A. et all. Diabetes Obesity and Metab. 2004; 6 (5): 332-337.
35. Morris A.D., Peteric J.R., Connell J.M.C. J. Hyper-tens.1994; 12: 633-642.
36. Morris B.W., Samaniago S., Fraser R., Mac. Neil S.J. Trace Elem. Exp. Med. 2000; 13 (4): 389-396.
37. Nagava T., Yoshida H., Takahashi H., Kawai M. Dia-bet. Med. 2005; 22 (8): 1107-1111.
38. Oral E.A. Rev. Endocr. and Metab. Disorders. 2003; 4 (1): 61-77.
39. Report of the Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes mellitus. Diabetes Care. 2002; 25 (Suppl. 1): 5-20.
40. Perez-Martin A., Ruynaudt E. and Mercier J. Obesity Rev. 2001; 2 (1): 47-59.
41. Perseghin Gianluca, Sifo Paola, Danna Massimo, Bat-tezzati Alberto, Benedini Stefano et al. Amer. J. Physi-ol. 2002; 283 (3 ч. 1): 556-564.
42. Perseghin G., Petersen K., Shulman G.J. Int. J. Obesity. 2003; 27 (прилож. 3): 6-11.
43. Rhodes G.J. Science. 2005; 307 (5708): 380-384.
44. Seres Janette, Bornestein Stefan R., Seres Peter, Willenberg Holger S. et al. J. Clin. Endocrinol. and Metab. 2004; 89 (2): 965-970.
45. Setter Stephen M., Compbell R., Keith Cahoon, Clifton J. Ann. Pharmacother. 2003; 37 (12): 1858-1866.
46.Weingig P., McMaster D., Bayraktutan U. Diabetes. Obesity and Metab. 2004; 6 (6): 432-441.
47. Vaney G.C., Corkey B.E. Diabetologia. 2003; 46 (10): 1297-1312.
48.Yamdmoto Yukihiro, Hirose Hiroshi, Saito Ikuo, Nishi-kai Kanako, Saruta Takao. J. Clin. Endocrinol. and Metab. 2004; 89 (1): 87-90.
49. Zick V. Int. J. Obesity. 2003; 27 (прилож. 3): 56-60.
Поступила 20.09.2006
