CC BY
35
БИОЛОГИЯ ПОЧВ
УДК 579.631.46:427.2
«АБСОЛЮТНЫЙ» КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ УЧЕТ
КЛЕТОК АРХЕЙ И БАКТЕРИЙ В ПОЧВЕ*
О.А. Андреева, Н.А. Манучарова, А.Л. Степанов, П.А. Кожевин
Показана возможность применения метода последовательного исчерпывания для определения «абсолютной» численности популяций Bacteria и Archaea в почве на основе данных количественного учета для in ^«-гибридизации с рРНК-специфичными флюоресцентно мечеными олигонуклеотидными зондами (FISH).
Ключевые слова: метод FISH, учет численности микроорганизмов, почва, «абсолютная» численность, Bacteria, Archaea.
Введение
В экологии микроорганизмов особое внимание уделяется разработке методов, позволяющих наиболее полно определять их численность в природных местообитаниях, включая почву. Все классические методы количественного учета микроорганизмов, как известно, являются относительными, т.е. при их применении выявляется и учитывается лишь некоторая часть объектов. Повысить полноту учета можно путем подбора способов предварительной подготовки образцов для десорбции клеток и дезагрегирования микроколоний, однако такое решение не является универсальным и предполагает необходимость оптимизации для конкретных объектов и местообитаний.
Ранее было предложено принципиально иное решение задачи более полного учета микроорганизмов на основе подходов, разработанных в общей экологии [2]. В этом случае проводится серия стандартных манипуляций по последовательному изъятию объектов из одного и того же образца почвы с учетом удаленных в каждом «отлове» клеток. В ходе каждого очередного цикла к выявленным ранее объектам прибавляются новые, что позволяет рассчитать показатели «абсолютной» численности. Эффективность метода доказана для стандартных задач как общего количественного учета, так и учета конкретных видовых и штаммо-вых популяций.
В настоящей работе представлена проверка возможности применения определения «абсолютной» численности при количественном учете объектов современными молекулярно-генетическими методами на примере in «/'¿«-гибридизации с рРНК-специфичными флюоресцентно мечеными олиго-нуклеотидными зондами (FISH).
Объекты и методы исследования
В качестве объекта исследования использовали воздушно-сухой образец чернозема мощного глубококарбонатного тяжелосуглинистого на лессовидном суглинке (Белгородская обл., гор. А). Микробные сукцессии в почве были инициированы посредством только увлажнения (60% от полной влагоемкости) и увлажнения с внесением легкодоступных соединений углерода (глюкоза) и азота (№N03) [1]. Отбор образцов для анализа производили на седьмые сутки сукцессий.
Почвенную суспензию в обоих случаях обрабатывали на ультразвуковой установке типа УЗБН-2Т при частоте 22 кГц и силе тока 0,4 А в течение 2 мин. Однократное применение ультразвука использовали для определения относительного обилия архей и бактерий. «Абсолютную» численность оценивали циклическим способом предварительной подготовки, который включал многократную обработку почвенных суспензий ультразвуком с отделением десорбированных клеток от почвы. Извлечение их после очередной ультразвуковой обработки осуществляли с помощью центрифугирования (центрифуга СМ-6М, 2000 об/мин, 10 мин). Полученный супернатант использовали только для количественного учета микроорганизмов заданного цикла обработки после концентрирования клеток с помощью дополнительного центрифугирования (10 000 об/мин, 5 мин). Почвенный осадок с оставшимися в нем микробными клетками снова обрабатывали по описанной схеме. Всего было проведено три цикла обработки и в каждом из них количественно учитывали археи и бактерии. Клетки микроорганизмов фиксировали параформаль-дегидом. Фиксированный материал собирали центрифугированием, после двукратного промывания фосфатным буфером ресуспендировали в смеси
* Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ № 14-04-01573 и Президиума РАН № 14-26-00079.
этанола и фосфатного буфера (1:1) и до анализа хранили при —20°.
Суспензию фиксированного образца наносили на предметные стекла. Гибридизацию препаратов (для нее использовали набор рРНК-специфич-ных олигонуклеотидных флуоресцентно меченых зондов) проводили при температуре 46° [4]. Препараты анализировали с помощью люминесцентного микроскопа ZEISS Mikroskop Axioskop 2 plus (Германия) со светофильтрами Filter set 15 [3].
Результаты и их обсуждение
В основе метода последовательного исчерпывания лежит предположение, что в ходе последовательных учетов численность объектов убывает. Действительно, во всех вариантах эксперимента зависимость численности клеток, изъятых и учтенных после определенного цикла, от суммарной численности удаленных ранее клеток имеет линейный характер, что свидетельствует о повышении полноты учета. В общем виде зависимость может быть описана соответствующим уравнением регрессии: Y = a — pX, где Y — изъятые в конкретном цикле клетки, X — суммарная численность извлеченных ранее клеток. Наклон линий регрессии p отражает долю популяции, удаляемую в одном цикле.
Из полученных уравнений можно определить показатели «абсолютной» численности. Для этого следует рассмотреть условие с предельным извлечением клеток: при Y = 0 получаем X = —a/p. Например, для архей в контрольной сукцессии без внесения ресурсов уравнение регрессии имеет вид Y= —0,52X + 5-107 (коэффициент корреляции r = = 0,99). В данном примереp = 0,52, т.е. доля популяции, удаленной и учтенной при каждом цикле, составляет примерно 52% от численности в почве до проведения заданного цикла. Другими словами, в ходе каждого последующего этапа из почвы извлекается примерно в два раза меньше клеток архей по сравнению с предыдущим циклом. Соответственно, расчетный индекс абсолютного обилия в данном примере составляет примерно 9,6 • 107 клеток.
В ходе эксперимента выяснилось, что даже при учете одной и той же популяции показатель эффективности извлечения клеток p может изменяться в зависимости от условий, но в первом приближении в заданных условиях для архебактерий и бактерий этот показатель варьировал в узком диапазоне — от 0,4 до 0,6. Представленные результаты получены после трех циклов обработки, однако имеется возможность сокращения числа циклов до двух. Расчет проводится по формуле: X = = q2/(C1- C2), где Q—численность клеток в первом цикле изъятия, а С2 — во втором. Проверка показала, что показатели обилия в этом случае
практически совпадают с данными для трех циклов (85-97%).
Сравнение показателей «абсолютной» численности с таковыми для стандартной предварительной ультразвуковой обработки подтверждает вывод о том, что рассматриваемый подход позволяет повысить полноту учета объектов в 1,5—2,5 раза (таблица), что представляет интерес в задачах оценки потоков вещества и энергии в почве. По относительным и абсолютным индексам обилия выявлены и некоторые особенности учитываемых объектов. В частности, установлено, что внесение легкодоступных ресурсов значимо не повлияло на показатели численности архебактерий в рассматриваемое сукцессионное время. В этих же условиях относительные и абсолютные показатели обилия бактерий, напротив, существенно увеличиваются (в 4,6 и 3,4 раза соответственно). Налицо и тенденция доминирования бактерий в прокариотном сообществе именно в сукцессии с внесением дополнительных ресурсов.
«Абсолютная» и относительная численность архебактерий и бактерий
Объект Вариант сукцессий Численность по стандартному методу, число клеток/г почвы «Абсолютная» численность, число клеток/г почвы
Archaea контроль 4,7-107 9,7 • 107
внесение дополнительных ресурсов 4,1 • 107 9,9 • 107
Bacteria контроль 2,3 • 107 4,7 • 107
внесение дополнительных ресурсов 1,1 • 108 1,6 • 108
Отмеченные особенности согласуются с гипотезой об архебактериях как относительных K-стра-тегах, приспособленных к существованию в условиях хронического энергетического стресса [5]. Такой стресс наиболее очевиден в местообитаниях с экстремальными характеристиками (соленость, температура, pH), но в общем случае характерен для разнообразных условий с хроническим дефицитом ресурсов, включая ключевые экологические процессы (например, нитрификация) и выраженные энергетические ограничения катаболизма (ме-таногенез, анаэробное окисление метана). Дефицит ресурсов создается и на климаксных этапах микробных сукцессий, что в нашем случае позволяет архебактериям выживать на относительно высоком стабильном уровне обилия. При наличии легкодоступных ресурсов быстрый отклик г-стра-тегов обеспечивает регистрируемое доминирование популяции Bacteria.
Таким образом, в настоящей работе показана возможность определения «абсолютной» численности популяций Bacteria и Archaea при количественном учете объектов в почве методом FISH,
что позволяет повысить полноту учета объектов при применении современных молекулярно-гене-тических методов в экологии микроорганизмов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Андреева О.А., Кожевин П.А. Оптимизация естественного сообщества микроорганизмов почвы как способ создания микробных удобрений // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 17. Почвоведение. 2014. № 4.
2. Кожевин П.А. Микробные популяции в природе. М., 1989.
3. Манучарова Н.А., Власенко А.Н., Менько Е.В., Звягинцев Д.Г. Специфика хитинолитического микроб-
ного комплекса в почвах, инкубируемых при различных температурах // Микробиология. 2011. Т. 80, № 2.
4. Amann R.I., Krunholz L, Stahl D.A. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic, and environmental studies in microbiology // J. Bacteriol. 1990. Vol. 172.
5. Valentine D. Adaptations to energy stress dictate the ecology and evolution of the Archaea // Nature Rev. 2007. Vol. 5.
Поступила в редакцию 30.09.2015
"ABSOLUTE" DENSITIES OF BACTERIAL
AND ARCHAEAL POPULATIONS IN SOIL
O.A. Andreeva, N.A. Manucharova, A.L. Stepanov, P.A. Kozhevin
This work made use of depletion strategy (removal sampling) in which a soil suspension was repeatedly subjected to removal treatment for a more complete counting cells of Archaea and Bacteria by fluorescence in situ hybridization (FISH) technique. The data were mathematically processed to calculate the "absolute" content of bacterial and archaeal populations in soil.
Keywords: Archaea, Bacteria, soil, population density, fluorescence in situ hybridization.
Сведения об авторах
Андреева Ольга Андреевна, аспирант каф. биологии почв ф-та почвоведения МГУ им.М.В.Ломоносова. E-mail: elvi.23@mail.ru. Степанов Алексей Львович, докт. биол. наук, профессор каф. биологии почв ф-та почвоведения МГУ им.М.В.Ломоносова. E-mail: stepanov_aleksey@mail.ru. Манучарова Наталия Александровна, докт. биол. наук, профессор каф. биологии почв ф-та почвоведения МГУ им. М.В.Ломоносова. E-mail: manucharova@mail.ru. Кожевин Петр Александрович, докт. биол. наук, вед. науч. сотр. ф-та почвоведения МГУ им. М.В.Ломоносова. E-mail: kozhevinpa@mail.ru.
