CC BY
19УДК 634.11:581.143.6
КАЛЛУСО- И МОРФОГЕНЕЗ ПЫЛЬНИКОВ ИММУННЫХ К ПАРШЕ СОРТОВ ЯБЛОНИ (Malus domestica Borkh.) В КУЛЬТУРЕ IN VITRO
В. Е. Джафарова, кандидат сельскохозяйственных наук
Государственное научное учреждение Всероссийский НИИ селекции плодовых культур, г. Орел, Россия
Введение. В прошлом столетии значительное развитие получил метод «андрогенеза», т.е. культивирование in vitro пыльников. Основной интерес вызван получением гаплоидных растений из пыльцы в культуре in vitro. Явление ^аплоидии было открыто в 1922 г. и первое гаплоидное растение Datura ctramo- nium было получено в том же году [1].
Уже к середине 30-х годов были получены и изучены десятки гаплоидов у разных видов растений. Тогда же были высказаны идеи о получении из гаплоидов абсолютно гомозиготных диплоидных линий и использовании их в селекции [2, 3].
Культивирование изолированных пыльников основано на развитии тысяч микроспор, каждая из которых может дать гаплоидное растение. Применение гаплоидных растений в селекции позволяет сегодня создавать константные не-расщепляющиеся гомозиготные формы в первой генерации, и таким образом со
кращать селекционный процесс на 3-4 генерации, характерные для обычной схемы селекции; упрощать мутационную селекцию, поскольку у гаплоидов отсутствует доминирование и все гены имеют фенотипическое проявление; получать каллусную ткань, содержащую не только гаплоидные клетки, но и клетки других уровней плоидности, что может быть дополнительным источником для селекции И,
5].
Использование техники культивирования пыльников позволило создать целый ряд сортов риса, пшеницы, табака, ячменя и других культур. Удалось получить андрогенные растения многолетних плодовых культур: земляники,
яблони, цитрусовых [6-8].
Успешное использование культивирования in vitro пыльников и получение андрогенных гаплоидов однолетних и многолетних культур послужили причиной для подобных исследований с 2005г в ГНУ ВНИИСПК.
Методика исследований. Основной задачей наших исследований на начальном этапе являлось изучение особенностей каллусогенеза и возможности органогенеза сортов яблони иммунных к парше.
В работе использовали пыльники сортов яблони Орловское полесье, Афродита, Свежесть, Юбилей Москвы. В сухую погоду для посева пыльников бутоны отбирали по внешним признакам, считающимися для яблони наиболее продуктивными в отношении каллусооб-разования (бутоны выдвинуты, но плотно сомкнуты, без белого конуса, их пыльники зеленовато-желтого цвета). Их помещали в чашки Петри с увлажненной фильтровальной бумагой и ставили в холодильник на 3 дня при температуре +3-4°С.
Посев пыльников проводили на среду Мурасиге-Скуга и Хеллера для выявления лучшего каллусообразования. Работа по посеву пыльников проводилась в асептических условиях из расчета один бутон на пробирку. Посеянные пыльники культивировали в термостате при температуре 25°С в условиях 16 часового фотопериода с интенсивностью освещения до 1000 люкс и влажностью воздуха 60-70%.
Среды, используемые для индукции каллусообразования и получения расте-ний-регенерантов, содержали макро- и микросоли, витамины В6, РР по 0,5 мг/л, гидролизат казеина 600-800 мг/л, мезоинозит - 100 мг/л, сахарозу - 20 г/л, и агар, концентрация которого варьировала в зависимости от его вида. В среды были включены еще стимуляторы роста: ауксины, цитокинины, гиббереллин. В группу использованных ауксинов вошли НУК, ИУК, 2,4-Д, пиклорам; в группу ци- токининов -кинетин и шесть БАП. Соотношение ауксин:цитокинин в индукции
каллусообразования равнялось 1:1.
Пиклорам в исследования включен в связи с его высокой ауксиновой активностью на многих однолетних культурах Он эффективнее ИУК и НУК в индукции образования каллуса; на эксплантах табака в сочетании с кинетином стимулировал образование почек [9]. При каллу- согенезе у бобовых и злаковых отмечена его более высокая стимулирующая активность по сравнению с 2,4-Д и значительно более низкая фитотоксичность
[10]. К тому же пиклорам в отличие от 2,4-Д не ингибирует синтез хлорофилла при выращивании каллусов на свету и поэтому более пригоден для получения органогенных каллусов [11].
Выбор пиклорама обусловлен был еще и тем, что при культивировании пыльников многолетних плодовых растений отмечен низкий выход каллусов и эмбриоидов, у отдельных генотипов вообще не удавалось получить регенеран- ты. К тому же данные по применению пиклорама в индукции каллуса и органогенеза у плодовых культур отсутствуют.
Пробирки с образовавшимся в темноте каллусом помещали в светокомнату с интенсивностью освещения до 1500 люкс в условиях 16-часового фотопериода. Через 10 дней каллусы переносили на питательные среды для индукции морфогенеза.
Результаты исследований. В зависимости от складывающихся весенних погодно-климатических условий и их влияния на формирование пыльников начало образования каллуса варьировало от 10 дней до четырех недель в темноте и от двух до семи недель на свету. Частота каллусообразования пыльников изучаемых сортов яблони различалась по годам: наибольшей она была в 2006 г. и находилась в пределах 57,0-93,1% при формировании каллуса в темноте. На свету данный показатель варьировал от 12,5 до 63,4%. Наименьшее каллусооб- разование по сортам было в 2007 г. и составило от 26,0 до 71,4% в темноте, 13,0-31,7% - на свету (табл. 1).
Установлено, что каллусогенез зависит прежде всего от генотипа исходного растения. Наибольшая частота каллу-согенеза была характерна для сортов Свежесть и Юбилей Москвы (72,5- 90,6%). Оба сорта такие показатели проявили на среде Хеллера. Ниже уровень каллусообразования отмечен у сортов Афродита и Орловское полесье. Образовавшиеся каллусные ткани (косвенный андрогенез) различались плотностью и цветом. В основном это были морфогенные каллусы плотной консистенции с бугристой поверхностью. Цвет их варьировал от белого до желтоватого. В единичных случаях встречались каллусы рыхлые, водянистые, молочно- белого цвета.
Таблица 1
Эффективность каллусообразования пыльников яблони в культуре in
vitro, 2007 г.
Сорт Питательная Количество экспланти- Частота каллусообразо-
среда рованных пыльников вания, %
В темноте
Афродита МС 373 46,9±1,3
Хеллера 364 65,9±0,9
Свежесть МС 296 56,4±1,5
Хеллера 353 71,4±1,2
Орловское МС 379 38,4±0,9
полесье Хеллера 363 67,3±1,2
МС (П4)* 341 26,9±1,1
МС (Па)** 365 40,0±1,0
Юбилей МС 391 49,4±1,3
Москвы Хеллера 404 72,5±0,4
МС (П4)* 391 31,0±1,0
МС (ПеГ 385 26,0±0,9
На свету
Орловское МС 360 25,8±0,9
полесье МС (П4)* 249 18,9±0,7
МС (Па)** 296 20,3±0,8
Юбилей МС 388 31,7±1,1
Москвы МС (П4)* 422 13,0±0,8
МС (ПбГ 365 14,5±0,7
примечание: МС (I 14)* - среда Мурасиге-Скуга с добавлением 4 мг/л пиклорама, МС (П6)** - среда Мурасиге-Скуга с добавлением 6 мг/л
Использование пиклорама, как сти- его значительную активность как в тем-
мулятора каллусообразования, показало ноте, так и на свету (табл. 2).
Таблица 2
Эффективность каллусогенеза у пыльников яблони в присутствии пиклорама %)
Сорт Питательная среда Условия культивирования
термостат светокомната
2005 г.
Орловское полесье МС П2* 50,2±1,5 14,5±0,7
МС П4** 39,8±0,9 22,6±1,0
Юбилей Москвы МС П2 26,6±1,1 11,3±0,5
МС П4 39,1 ±1,0 21,3±0,9
2006 г.
Орловское полесье МСГ!2 57,0±1,3 12,9±0,7
МС П4 82,0±0,5 58,1 ±0,7
Юбилей Москвы МС П2 39,7±0,9 12,5±0,8
МС П4 83,3±0,4 74,9±0,5
2007 г.
Орловское полесье МСП4 26,9±1,1 . 18,9±0,7
МС п6*** 40,0±1,0 20,3±0,8
. Юбилей Москвы МС п4 31,0±1,0 13,0±0,8
МС п6 26,0±0,9 14,5±0,7
Примечание: *, **, *** - среда Мурасиге-Скуга с добавлением соответственно 2 мг/л; 4 мг/л; 6 мг/л пиклорама.
Каллус, сформированный в темноте на среде с пиклорамом, плотный, бугорчатый, молочный или белый и внешне больше напоминает скопление меристематических зон, чем растущую неорганизованную рыхлосвязанную кал- лусную ткань. При перенесении такого каллуса на свет половина его поверхности зеленеет в 99 из 100 случаев, тогда как без пиклорама - от 32% до 51 % В зависимости от сорта.
Каллус, сформированный на свету, весь изначально имеет интенсивно зеленую или зеленовато-белую окраску, более плотный, чем в темноте, с четко очерченными границами зон, напоминающими меристематические.
Каллус, образованный в темноте без пиклорама при его дальнейшем пассировании приобретает водянистую структуру или рано стареет, что характерно для всех сортов, хотя и в разной степени. Таких отрицательных особенностей у каллусной ткани, образованной на среде с пиклорамом, не отмечалось.
Для выявления возможности морфогенеза каллусные ткани пассировали на среду МС (соотношение ауксин : цито- кинин 1:3). При этом на каллусе всего лишь одного сорта Свежесть были получены корни. При увеличении соотношения ауксин: цитокинин (НУК:БАП, кине- тин) в три раза получены корни на каллусе у сорта Афродита. При замене цито- кинина (НУК) пиклорамом получены корни на каллусе сорта Свежесть. Ризогенез у обоих сортов протекал внутри каллусной ткани.
Выводы. Результаты исследований показали, что развитие пыльников иммунных к парше сортов яблони проходило по пути косвенного андрогенеза. Интенсивность каллусогенеза определялась генотипом исходного сорта, искусственной питательной средой и экзогенными стимуляторами роста. Использование препарата под названием пиклорам показало его значительную ауксиновую активность в процессе каллусообразования из пыльников яблони как на свету, так и в темноте.
В каллусных тканях сортов Свежесть и Афродита индуцированы корни. Исследования будут в этом направлении продолжены, поскольку вышеизложенное дает надежду в перспективе получить
другие морфогенные образования, а
также растения-регенёранты.
Использованная литература:
1. Blakeslee A., Beeling J., Farnham М. Е., Berger A. D. / Science. - 1922. - Vol. 55. - P. 646-647.
2. Карпеченко, Г. Д. Теоретические основы селекции растений. / Г. Д. Карпеченко. -М.-Л: Сельхозгиз, 1935. - Т. 1.-434 с.
3. Навашин, М. С. Ботанический журнал. / М. С. Навашин. - 1934. - Т. 19. - Вып. 4. -С. 640-641.
4. Гапоненко, А. К. Перспективы использования культуры клеток растений в селекции. / А. К. Гапоненко. // Успехи современной генетики. - М.: Наука, 1987.-Вып. 14.-С. 64-74.
5. Жуков, О. С. Методические рекомендации по получению растений-реге-нерантов плодовых пород в культуре пыльников. / О. С. Жуков, О. Я. Олейникова, Н. И. Савельев. - Мичуринск, 1994.-36 с.
6. Hu Han. Crop improvement by anther culture in genetics : New frontiers. // Proc. XV Intern. Congr. Genet. New Delhi. - 1984. - P. 77-85.
7. Тырнов, В. С. Использование гаплоидов в генетических исследованиях. / В. С. Тырнов // Гаплоидия и селекция. -М.: Наука, 1976.-С. 140-151.
8. Dayuan Wang, Yao-lin Gui and jiang- San Sun. Tissue Culture of Fruit Crops in China. // Hortscience. - 1988. - Vol. 23. - № 6. - P. 962-965.
9. Dulieu H., Vallee J.-C., Martin G. Quelques effects de I'acide 4-amino- 3,5,6-trichloropicolinigue (piclorame sur les tissus de Nicotiana tabacum var. Xanthi n.c.en. culture in vitro. // C. R. Acad. Sci. - 1972. -Vol. D 274, №18, - P. 2574-2577.
10. Мусияка, В. К. Активизация деления и растяжения клеток культуры ткани табака в присутствии 4-амино-3,5,6 трихлорпиколиновой кислоты. / В. К. Мусияка, Ф. Л. Калинин // Физиология и биохимия культурных растений. - 1975. -Т. 7. - № 5. - С. 486-492.
11. Collins G. Use of 4-amino-3,5,6-trichlo-ropicolinic acid as an auxin source in plant tissue cultures. / G. Collins, W. Vion, G.Phillips. // Crop. Sci. - 1978. -Vol. 18,-№2- P. 286-288.
УДК 634.11:581.143.6
Джафарова В. G. Калусо- и морфогенез пиляш iмунних до паршi coptíb яблунi (Malus domestica Borkh.) в культурi in vitro //Сортовивчення та охорона прав на сорти рослин. - К., 2008. - № 7.
Надано результати культивування iзольованих пилякiв яблунi iмунних до паршi сортiв. Наведено особливост формування калуса з використанням ткло- раму i можливостi морфогенеза.
Ключовi слова: сорти яблунi,' iзо-льован пиляки, культивування пилякiв, калусогенез, екзогенн стимулятори, Ыду-кованi коренi. УДК 634.11:581.143.6
Джафарова В. Е. Каллусо- и морфогенез пыльников иммунных к парше сортов яблони (Malus domestica Borkh.) в культуре in vitro //Сортовивчення та охорона прав на сорти рослин. - К., 2008. -№ 7. Изложены результаты культивирования изолированных пыльников им
мунных к парше сортов яблони орловской селекции. Показано, что развитие пыльников исследуемых сортов яблони проходит по пути косвенного андрогене- за. Интенсивность каллусогенеза определяется генотипом сорта, видом питательной среды и экзогенных стимуляторов роста. В каллусных тканях сортов Cвежесть и Афродита индуцированы корни. Препарат пиклорам проявляет значительную ауксиновую активность в процессе каллусообразования из пыльников яблони как на свету, так и в темноте. УДК 634.11:581.143.6
Jafarova V. Anther callusogenesis and morphogenesis of immune to scab apple varieties (Malus domestica Borkh.) in culture in vitro // ^ртовивчення та охорона прав на сорти рослин. - К., 2008. - №7.
The results of cultivating of isolated apple anthers of immune to scab varieties are described. The peculiarities of callus formation using picloram are shown.
